Guia de Clonagem de RNA para Sistemas de Mamíferos por CRISPR

Nota: O seguinte protocolo descreve como executar o projeto gRNA usando ferramentas on-line (passos 1.1-1.4), que são comuns a todos os métodos de construção de plasmídeo de gRNA detalhada neste manuscrito. Uma vez identificados os gRNAs desejados, etapas para encomendar os oligonucleotides necessários são descritas juntamente com diversos métodos para introduzir os oligonucleotides em vetores de expressão (por exemplo, pSB700). Apresentados são 2 métodos de clonagem único guia-expressando vetores baseados em qualquer ligadura em um vetor de expressão pré-digeridas (passos 2-7.3) ou Golden Gate clonagem (passos 8-8.4). Mais delineado é uma estratégia para clonagem emparelhados guia-expressando vetores utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida por Golden Gate clonagem (passos 11-16). Finalmente, métodos comuns para a realização de uma transformação química de Escherichia coli (etapas 9,6-9) e uma validação de sequência de vetor de expressão (passos 10 para 10.2.3) também são descritos. Projeto gRNA oligonucleotides usando ferramentas on-line da seguinte maneira. Projeto gRNAs usando ferramentas on-line tais como a sgRNA artilheiro 2.0 ferramenta on-line (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 ou alternativas, tais como a ferramenta de projeto de amplo sgRNA (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgrna-design)14 e vários outros15. Use o nome de gene, símbolo ou crus sequências de DNA alvo para gerar sequências de gRNA potenciais.Nota: É criado um arquivo de planilha (.csv/.xls) com todos os potenciais gRNAs contra o gene ou a sequência fornecida. A qualidade do potencial gRNAs será relatada como Pontuação se a ferramenta online sgRNA artilheiro 2.0 está sendo usada, ou como % eficiência no alvo se a ferramenta de projeto de amplo sgRNA está sendo usada. Ambas as medidas são derivadas com base na atividade do corte no alvo. Considere a atividade fora do alvo na seleção gRNA ao ranking da gRNAs.Nota: Guias ideais são aqueles com a maior eficiência no alvo e a atividade menos fora do alvo. Para a ativação (CRISPRa), gRNAs são projetados para atingir a região de 1-200 bp montante do transcriptional início local (TSS)4,15. De inibição (CRISPRi), gRNAs são projetados para atingir a região de 50 bp montante de TSS até 300 bp a jusante do TSS5. Para desactivar um gene usando Cas9 corte, gRNAs são projetados para atingir os primeiros 10-50% da sequência de codificação a jusante da iniciação codão (como gRNAs visando a extremidade 3′ do gene foram mostrados para ser menos eficaz)13. Certifique-se de nenhum sites de BsmBI internos estão presentes se oligonucleotídeos estão sendo usados para a clonagem de Golden Gate, pois isso resultará nos oligonucleotides recozidos sendo digerida13. Selecione as sequências genômicas alvo e remover a 3′ NGG PAM (deixando somente a sequência de protospacer) para a modificação de sequência do oligonucleotide gRNA único (por exemplo, iniciando a sequência: CGCGTGCTCTCCCTCATCCAro).Nota: Se utilizar uma folha de cálculo, a fórmula a seguir irá remover 3′ NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), onde A2 é a célula que contém a sequência de destino e o PAM. Acrescente CACCG à extremidade 5′ do oligo.Nota: Após ligadura à coluna vertebral de pSB700, essa sequência será composto por extremidade 3′ do promotor U6 dirigindo a transcrição da gRNA. A sequência de “CACC” garante que o oligo é compatível com as saliências do vetor digerido BsmBI pSB700. O “G” é um requisito dos promotores da polimerase III e assegura a eficiente iniciação da transcrição da gRNA. Use a seguinte fórmula em uma planilha para realizar esta tarefa: =CONCATENATE(“CACCG”,(B2)), onde B2 é a célula que contém a sequência de protospacer [por exemplo, adicionando a 5′ CACCG de sequências para o protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (isto é o oligo frente final solicitado)]. Crie um complemento reverso (rc) da sequência de protospacer.Nota: por exemplo, o complemento inverso da referida protospacer é TGGATGAGGGAGAGCACGCG. Acrescente AAAC à extremidade 5′ do protospacer do rc. Acrescente um adicional C à extremidade 3′ do protospacer do rc (oligo inverso).Nota: A sequência de “AAAC” garante que o oligo compatível para clonagem em vetor de pSB700 BsmBI-digerido. O “C” adicional na extremidade 3′ é necessária para recozer a sequência para o iniciante “G” adicionado à frente oligo. Uso a seguinte fórmula em uma planilha para realizar esta tarefa =CONCATENATE(“AAAC”,(C2),”C”), onde C2 é a célula que contém a sequência inversa complemento [por exemplo, AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (este é o final oligo reverso que é ordenou)]. Encomendar os oligonucleotides, sem modificações adicionais sobre os oligonucleotides. Encomendar a quantidade mínima de oligo exigido, como apenas pequenas quantidades são necessárias para as reações de clonagem. Dilua o liofilizado primers para uma concentração final de 100 μM em tampão TE (Tris-Cl de 10 mM, pH 7,5 com 1 mM de EDTA) 1x. Alíquotas 1:1 para diante e reversos oligonucleotides (por exemplo, 10 μL cada) para tubos de PCR tira-cap.Nota: Isto irá permitir a clonagem rápida de muitos gRNAs de cada vez usando uma pipeta multicanal. Vórtice e spin para baixo as misturas de oligo (100 x g durante 15 s). Incube a reação à temperatura ambiente por 5 min antes de configurar a ligadura.Nota: Não é necessário aquecer e depois refresque-as misturas de oligo para facilitar seu recozimento. É interessante notar que 3-4 pares de oligonucleotídeos gRNA podem ser agrupados e recozidos em uma única reação (por exemplo, mistura 3 μL de para a frente e 3 μL de reverter oligonucleotides juntas de até 4 pares de oligo gRNA, dando um volume total de 24 μL). O volume dos oligonucleotides usado para recozimento pode ser ajustado para acomodar as necessidades do usuário.Nota: Passos 6-7.3 descrevem a pré-digestão de pSB700. Para um método alternativo, consulte a etapa 8, que descreve uma ligadura de restrição de BsmBI passo a passo. Digerir a 15 μg do vetor de expressão guia selecionado pSB700 com BsmBI (0,5 μL por 1 μg) para 1 h, a 55 ° C15. Realizar a digestão do vetor de expressão de gRNA de pSB700 em um volume total de 40 μL (tabela 1). Execute os produtos de digestão em gel de agarose de baixo ponto de fusão de 1,5% (wt/vol). Cortar a banda de espinha dorsal do vetor digerido que corresponde a um fragmento de ~ 9 kb de tamanho e coloque a fatia de gel em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL (Figura 1). Use um kit de purificação de gel de comercial para extrair o DNA do gel do agarose de acordo com as instruções do fabricante. Eluir o DNA em 10-15 μL de tampão TE (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM Tris, pH 8.0) para obter um concentrado eluato. Ligam os oligonucleotides recozido gRNA da etapa 4 para o vetor de expressão de guia de pSB700 BsmBI-digerido em uma reação de 20 μL (tabela 2) para a clonagem dos oligonucleotides a gRNA para o vetor de expressão pSB700 pré-digerida. Primeiro, adicione água, buffer e DNA, em seguida, a mistura de vórtice e adicionar enzima, vórtice 1 vez final após a adição da enzima e spin-down a solução (100 x g durante 15 s). Incube as reações à temperatura ambiente durante a noite. Incluem uma reação não-inserção de controlo negativo que tem um vetor digerido BsmBI sozinho, sem uma inserção de oligo gRNA recozido. 1 μL de água pode ser usado no lugar do 1 μL de oligonucleotides gRNA para o controle negativo não-inserção. Prossiga para a transformação (etapa 9).Nota: O passo 8 é um método alternativo para a pré-digestão de pSB700 como descrito nos passos 6-7.3. Introduza o vetor de pSB700 através do uso de Golden Gate clonagem para a ligadura de restrição de BsmBI passo a passo, gRNA oligonucleotides (descritos nas etapas 1-5.1). Montar o mestre mix (1x) — se gRNAs múltiplos estão sendo clonados, preparar a mistura de mestre sem os oligonucleotides inserir adicionados (tabela 3). Alíquota do mestre misturar em cadeia da polimerase e usar uma pipeta multicanal para adicionar os oligonucleotides gRNA da etapa 4.2. Inclua um controle de não-inserção usando 1 μL de água. Incluindo a enzima BsmBI e T4 DNA ligase dentro a mesma reação, digestão de restrição simultânea e ligadura são alcançados (i.e., clonagem de Golden Gate). Use o seguinte protocolo de portão simples para digerir o vetor e ligate as inserções em 1 reação: manter a reação a 37 ° C por 2 h, a 50 ° C durante 10 minutos, a 65 ° C por 15 min, a 80 ° C por 15 min e finalmente , segure a 4 ° C. Digno de nota, verifique se os oligonucleotides não contêm BsmBI sites antes de utilizar este método. Se o gRNAs que estão sendo clonados conter sítios de restrição BsmBI, vai ser digeridas mediante a adição de BsmBI. Isto impedirá o usuário de obtenção de qualquer transformants. Após a reação inicial do portão simples, adicionar um adicionais 0,5 μL da enzima BsmBI para cada reação e colocá-los de volta a 55 ° C, durante 1 h. Após a digestão, mantenha a reação a 4 ° C ou congelá-lo até que esteja pronto para transformar. Esta segunda rodada de incubação da enzima de restrição remove qualquer não digerido ou religated pSB700 do selvagem-tipo vector espinha dorsal da mistura da reação para que apenas vetores que receberam as inserções de oligo permanecem intactos e renderão transformants. Prossiga para a transformação (etapa 9). Transformar 0,5 μL da mistura de reação em 8 μL de e. coli competente [por exemplo, NEB DH5a (1-3 x 109 UFC / µ g de DNA pUC19) ou NEB estável 1 – 3 x 109 UFC / µ g de DNA de pUC19). Para Lentivirus plasmídeos, células NEB estável irão fornecer mais consistente do plasmídeo de rendimentos. Remover Escherichia coli de armazenamento a-80 ° C e derretê-lo no gelo por 5-10 min. Adicionar 0,5 μL da mistura de reação para 8 μL de competentes de Escherichia coli e manter a mistura no gelo por 30 min. Calor de choque a mistura a 42 ° C por 45 s. Apoie-o no gelo por 2 min. Recupere a cultura em um agitador rotativo para 1 h a 37 ° C para NEB DH5a e a 30 ° C para estábulos NEB em 250 μL da mídia SOC. Placa de 80 μL da cultura em uma resistência aos antibióticos apropriada placa lisogenia caldo (LB) e incube-lo durante a noite a 37 ° C para NEB DH5a e a 30 ° C para estábulos NEB [por exemplo, pSB700 é banhado em LB com placas de ampicilina (100 μg/mL)] (Figura 3). Validar a sequência do plasmídeo de expressão gRNA: verificar a sequência de cada colônia por Sanger sequenciamento utilizando a cartilha 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′ que primos no promotor U6 montante do oligo gRNA inserir. Escolha 2-3 colônias por reação de sequenciamento (tabela 4).Nota: Vários provedores de sequenciamento agora a oferta de serviços que podem realizar Sanger sequenciando diretamente de colônias bacterianas, o que reduz bastante o tempo e os custos, eliminando a necessidade de purificar os plasmideos antes de sequenciamento. Alternativamente, um kit de isolamento de plasmídeo pode ser usado para recuperar o DNA do plasmídeo bacterianos clones individuais. Plasmídeos purificados em seguida podem ser apresentados para sequenciamento. Se for realizada uma reação de ligadura em pool, use tabela 4 como um guia para o número de colônias que deve ser selecionado e enviado para o sequenciamento. Após a confirmação da sequência, isole o plasmídeo de expressão gRNA. Use uma ponta de pipeta estéril para inocular a colônia desejada em uma cultura de 5 mL de meio LB contendo 100 μg/mL de ampicilina para vetores da expressão pSB700. Crescem as células em uma incubadora rotativa a 100 rpm a 37 ° C durante a noite (30 ° C se NEB estábulos estão sendo usados). Isole o plasmídeo de DNA das culturas usando um kit de preparação do plasmídeo, seguindo o protocolo do fabricante.Nota: Enquanto os métodos acima permitem aos usuários criar vetores contendo gRNA único, este protocolo permite aos utilizadores criar vetores que contenham 2 gRNAs, cada uma conduzida pelo próprio promotor III RNA polimerase. Para um design de gRNA emparelhados, use o arquivo de saída das ferramentas de design de sgRNA descritos acima (etapas 1,1-1,4) e selecione 2 guias turísticos. Para uma ativação ou repressão, selecionar os pares de guias que são pelo menos 30 nt distante. Para gRNAs usada para o corte, selecione guias que 2 exões diferentes dentro do gene-alvo. Para as instruções abaixo, designe a gRNA primeiro na matriz gRNA-A e o segundo gRNA na matriz gRNA-B, para criar uma modificação de sequência do oligonucleotide gRNA emparelhados.Nota: O oligo usado para criar gRNA-A será chamado fA, e o reverso oligo usado para introduzir a gRNA-B será referido como rB. O método de clonagem abaixo automaticamente acrescenta um G iniciando na extremidade 5′ de cada um do gRNAs. Crie o oligo fA apropriado como segue.Nota: Os 20 nucleotídeos compreendendo a gRNA segmentação sequência para gRNA-A vontade constituem a sequência de fA inicial sobre os quais as etapas a seguir irão construir (por exemplo, protospacer – aggggctacaccactcattg). Acrescente TTTTCGTCTCTCACCG à extremidade 5′ do fA (por exemplo, da sequência de TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg). Acrescente GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA à extremidade 3′ de fA (por exemplo, da sequência de TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Esta é a versão final do oligo fA que será ordenado. Crie o necessário oligo rB como segue.Nota: Os 20 nucleotídeos que compreende a sequência de direcionamento de gRNA para gRNA-B constituirá a sequência inicial do rB sobre os quais as etapas a seguir irão construir (por exemplo, da partida gtcccctccaccccacagtg de sequência). Levar o complemento reverso do rB = (revcom) rB (por exemplo, cactgtggggtggaggggac). Acrescentar TTTTCGTCTCTAAAC à extremidade 5′ do (revcom) rB (EG., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac). Acrescentar CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG à extremidade 3′ do (revcom) rB (por exemplo, TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Esta é a versão final do oligo rB que será ordenado.Nota: as fórmulas a seguir podem ser usadas com software de planilha comum para editar automaticamente as sequências de oligo: = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTCACCG”,(A2), “GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA”), onde A2 é a célula que contém a sequência de fA e = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTAAAC”,(B2),”CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG”), onde B2 é a célula que contém a sequência de rB (revcom). Encomendar os oligonucleotides de um fornecedor de síntese de escolha. Sem modificações adicionais são necessárias. Use o ADN do plasmídeo preparado para realizar o PCR com primers tanto fA e rB. Isto irá anexar ambos o avanço e os gRNAs inversa para o fragmento PCR gerados a partir deste plasmídeo e vai permitir que cada um a ser expressa de seu próprio promotor (promotores U6 e 7SK — promotores diferentes são usados neste projeto para impedir recombinação viral). Usar o protocolo de PCR Phusion GC especial para criar o fragmento necessário: manter a mistura a 98 ° C por 1 min (1 ciclo), a 98 ° C por 15 s, 53 ° c, durante 15 s, a 65 ° C por 2 min e a 72 ° C por 4 min (30 ciclos) e em seguida Segure a 4 ° C (tabela 5). Executar o produto do PCR em um gel de agarose a 1% e verificar que 1 banda é vista no ~ 490 bp (Figura 2). Cortar e extrair este produto do PCR usando um kit de extração do gel de escolha. Eluir o DNA em 15 μL de tampão TE (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM Tris, pH 8.0) ou água destilada. Medir a concentração do produto extraído juntamente com a do vetor de pSB700 com um espectrofotômetro para o cálculo de molaridade do DNA. Normalize o produto do PCR e o vetor de uma concentração de 40 femtomoles/μL.Nota: Vários sites estão disponíveis para ajudar com o cálculo da molaridade de uma solução de DNA determinada baseada no comprimento do DNA e sua concentração em solução (por exemplo, Promega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). A calculadora usa a fórmula:Aqui, N é o comprimento da sequência de nucleotídeos. Configure uma reação simultânea restrição de digestão e ligadura usando o protocolo descrito em passos 8-8.4 para clonar o fragmento do PCR em um vetor de pSB700. Em vez de adicionar 1 μL de solução de primer para a reação, adicione 1 μL de 40 fmole/μL do produto da PCR. Além disso, use 1 μL do vetor pSB700 na concentração de 40 fmole/μL.Nota: Rácios molares iguais conduzem a resultados consistentes, embora mesmo em casos onde a proporções exatas não são usadas, as colônias podem ser obtidas. Ao completar o processo de reação de Golden Gate (passos 8-8,4), prossiga para a transformação e a sequência de verificação (etapas 9 – 10.2.3).