Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Zu bewerten, wie gut wir das SmFISH-Protokoll gearbeitet (skizziert in Abbildung 1), eine Reihe von 54 Sonden entwickelt, die den offenen Leseraster des Gens NDC80 Fliesen (Abb. 2A, oben). Die Sonde befindet sich an der 5′-Ende bezeichnet man als Sonde 1; dem andern, Sonde 2; und der dritte, Probe 3, etc.. Die 27 Sonden zugewiesen eine ungerade Anzahl (Probe 1, 3, 5,…) sind alle konjugiert, der Fluoreszenzfarbstoff CAL Fluor 590 (CF590); und die 27 Sonden zugewiesen eine gerade Zahl (Sonde 2, 4, 6…), um den Quasar 670 (Q670) Fluoreszenzfarbstoff konjugiert. Daher sind diese wechselnden Sonde Sätze oft als “Odd/even” Sonden bezeichnet. Bei der Hybridisierung sollten beide Sonde das gleiche Protokoll kennzeichnen. Nach Spoterkennung haben wir ein paar Messungen zur Beurteilung der Qualität des SmFISH-Datensatz verwendet. Der erste war der Grad und die Qualität der ns1 für die ungerade/gerade Sonden. In unserem Fall colocalized 88 % aller SmFISH-Spots (Abbildung 2A und 2 b), mit mehr als 95 % der Flecken gepaart innerhalb von 2 Pixeln voneinander entfernt (Abbildung 2, gepaart), die innerhalb der Erwartungswert gegeben jeden chromatischen und erkennen Abweichung zwischen den beiden Leuchtstofflampen Kanälen. Im Vergleich dazu weniger als 10 % der unpaaren Flecken hatte einen nächster Nachbar Abstand von weniger als 2 Pixel, zeigen, dass die Wahrscheinlichkeit von falsch vor Ort zwei gering ist (Abbildung 2). 12 % der unpaaren Spots wurden gleichmäßig zwischen den beiden Kanälen unterteilt (Abb. 2 b, vgl. CF590-nur mit Q670 nur); und so schlossen wir, dass für dieses 2,4 kb-gen mit einer Reihe von Ausdruck zwischen 0 und 45 Transkripte pro Zelle ~ 94 % der RNA-Moleküle in jedem fluoreszierende Kanal genau erfasst wurden. Wenn das SmFISH-Protokoll suboptimal wäre, würde man (1) eine größere Bruchteil der SmFISH Spots mit nur einem der beiden fluoreszierende Signale (colocalized) und/oder (2) Zellen mit einem sehr niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis oder kein Signal überhaupt beobachten. Wir als nächstes gefragt, ob die Erkennung des SmFISH-Signals in Bezug auf die Gesamtzahl der RNA-Moleküle pro Zelle voreingenommen war. In einer Bevölkerung liegt die Gesamtzahl der einer bestimmten RNA in jeder Zelle in einer Verteilung mit einigen Zellen beherbergen weitere RNA-Moleküle als andere. Eine gute SmFISH-Protokoll sollte die RNA robust unabhängig davon erkennen, ob eine hohe Zahl oder geringe Anzahl von RNA-Moleküle in jeder Zelle vorhanden ist. Um dies, für jede Zelle zu testen, haben wir den Bruch der SmFISH Flecken mit colocalized Signalen und der Bruch mit nur einem der beiden fluoreszierende Signale berechnet. Nach Gruppierung der Zellen, die die gleiche Anzahl von insgesamt Flecken pro Zelle hatte, wir berechnen den durchschnittlichen Anteil der colocalized (gepaart) oder nicht colocalized (nur für CF590 oder Q670-only) Flecken in einer bestimmten Gruppe, und dieser Durchschnitt in Abhängigkeit von der Gesamtzahl der im Diagramm Flecken pro Zelle (Abbildung 3). Für jede Kategorie von Spots ähnelten sich die Fraktionen über den gesamten Bereich der Gesamtzahl der Flecken pro Zelle. Vergleicht man die Zellen mit insgesamt 20 fluoreszierenden Flecken pro Zelle im Vergleich zu denen mit insgesamt 30 Punkte, waren durchschnittlich Bruchteile der colocalized Spots zum Beispiel ähnlich. Dieses Ergebnis vorgeschlagen, dass unser Protokoll eine Reihe von RNA-Moleküle in einer Zelle (bis mindestens 40 ~ Moleküle pro Zelle) erkennen könnte. Wenn das Protokoll suboptimal gearbeitet, könnte man eine Tendenz beobachten. Zum Beispiel könnte der Anteil der Spots mit nur einem der beiden fluoreszierende Signale als die Gesamtzahl der Flecken pro Zelle erhöht erhöhen. Mit dieser optimierten Protokoll, untersuchten wir den Ausdruck des NDC80 -Gens, die in verschiedenen Wachstumsbedingungen ein Kinetochor-Protein kodiert. Das NDC80 -gen drückt zwei mRNA-Isoformen: lange undecodierten Abschrift Isoform, NDC80Luti, hat ~ 400 Basenpaaren die Erweiterung am 5′-Ende im Vergleich zu den kurzen NDC80ORF Isoform, aber beide Protokolle teilen der kodierenden Region des NDC80 -Gens (siehe schematisch in Abbildung 4A). Wir haben zwei Sätze von Sonden entwickelt: die CF 590 Satz bindet in der Region einzigartige 5′ NDC80Luti; und das Q-670-Set bindet an die gemeinsame Region NDC80Luti und NDC80ORF. Die NDC80Luti Transkripte wurden erkannt, als die SmFISH Flecken, wo die Signale beider Sätze colocalized, Sonde, während, die NDC80ORF Abschriften wurden diejenigen mit dem Signal nur aus Q-670. Aufgrund der Größe des einzigartigen Segments NDC80Lutikönnten wir nur 20 Oligonukleotid Sonden entlang dieser Region Fliese ist weniger als die empfohlenen 30 bis 48-Sonden. Wir ergibt sich also erst wenn diese Sonde Serie robust RNA in unser optimiertes Protokoll erkennen könnte. Für entweder fluoreszierende Kanal wir grafisch das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR, definiert als die Varianz der Pixel rund um einen Platz im Vergleich zu den vor Ort Intensität) gegen das Signal für jeden SmFISH Fleck erkannt, und erzeugt ein Streudiagramm für alle spots in das gesamte Sichtfeld (Beispielbilder Abbildung 4a) und Grundstücke in Abbildung 4 bidentifiziert. Zwei verschiedene Populationen wurden für beide der Q-670 eindeutig identifiziert und die CF-590-Sonde setzt (optimiert, Abbildung 4 b), was darauf hindeutet, dass die wahre SmFISH Spots (innerhalb des grauen Bereichs) aus dem Hintergrundsignal getrennt werden könnte. Beachten Sie, dass eine solche Trennung in suboptimalen Zustand, weniger offensichtliche (Suboptimal, Abbildung 4 b) war. Wir diese zwei Sonde Sets verwendet, um die Expression von NDC80Luti studieren und NDC80ORFwährend des vegetativen Wachstums und Meiose. In den vegetativen Zellen robustes Signal aus dem Q-670-Sonde-Set wurde erkannt, aber nicht von der CF-590 Sonde gesetzt (Abbildung 5A, vegetative), Vereinbarung mit der Beobachtung von Nordbeflecken, die nur die kurze Isoform während des vegetativen Wachstums16 zum Ausdruck kam . Dieses Ergebnis auch vorgeschlagen, dass die CF 590 Sonde spezifisch, nachgiebig niedrigen Hintergrund in unserem optimierten SmFISH-Protokoll ist. Im Gegensatz dazu robustes Signal aus beide Sonde in meiotischen Prophase erkannt wurde, und hatte die Mehrheit der Spots Signal (Abb. 5A, meiotischen Prophase) colocalized. Nordfleck und analysiert (Abb. 5 b) bestätigt diese Beobachtung, dass die lange Isoform NDC80Luti speziell in Meiose zum Ausdruck kam. Diese beiden Arten von mRNAs erkannt wurden, in das Zytoplasma (außerhalb der DAPI-Region), was darauf hindeutet, dass beide aus dem Zellkern, Einklang mit dem Ribosom Profilerstellung Daten18exportiert wurden. Um festzustellen, ob ausreichende Daten genau entfallen die biologischen Variation untrennbar mit unserem Datensatz erhoben wurden, führten wir bootstrap Analyse anhand von Statistiken der einzelnen Zellen, die enthalten (1) den Anteil der colocalized Flecken pro Zelle und (2) der Anteil der Flecken mit einem der beiden fluoreszierende Signale (CF 590 nur und nur Q-670). In dieser Analyse eine Programm nach dem Zufallsprinzip ausgewählt eine Zelle aus den 437 quantifizierten Zellen für 500 Iterationen. Als nächstes wurden der Mittelwert und die Varianz der jeweiligen Statistik verknüpft mit diesen 500 ausgewählten Zellen berechnet. Dieser Prozess wiederholte sich dann für die Auswahl nach dem Zufallsprinzip zwei Zellen aus allen Zellen, ohne Ersatz; und dann für die Auswahl nach dem Zufallsprinzip drei Zellen, etc.. bis zu einer Hälfte der gesamten Datensatz Größe erreicht wurde. Die Varianz in den Daten nach ~ 40 Zellen, darauf hindeutet, dass nach diesem Punkt die meisten die Variation in der Zwischenzeit untrennbar mit der Daten anstatt ein Artefakt der Undersampling ist Plateau (Abbildung 6, inset). Dieser Effekt wurde noch deutlicher, wenn wir die Stichprobenvarianz dividiert durch die Stichprobe-Mittelwert, in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen in der Stichprobe jedes Iterationszyklus (Abbildung 6) grafisch dargestellt. Mit den Daten angezeigt wurde die Änderung der Varianz i.e. klein nach ~ 60 Zellen. Die Anzahl der Zellen in einem SmFISH Experiment quantifiziert übersteigt die minimale Anzahl von Zellen erforderlich, um einen stabilen Mittelwert und einem Plateau der Varianz zu erreichen. In unserem Fall quantifizieren wir über 95 Zellen pro Probe pro replizieren. Die Gesamtzahl der Zellen (> 400) übertraf auch die minimale Anzahl von Zellen (~ 60) erforderlich, um den Mittelwert der Grundgesamtheit widerspiegeln. Mit einem maßgeschneiderten Matlab-Programm16, vegetative Zellen wurden gefunden, um einen Median von 5 haben NDC80ORF Abschriften pro Zelle, während in meiotischen Prophase Zellen, der Median, 4 Transkripte pro Zelle (zweiseitige Wilcoxon deutlich gesunken Summe der Rank-Test, p = 0.026) (Abbildung 7). Die mittlere Anzahl der NDC80Luti Transkripte pro Zelle war 21 Transkripte und 100 % der Zellen ausgedrückt NDC80Luti Transkripte. Wir grafisch der Anteil der Zellen mit einer bestimmten Anzahl von Abschriften als eine schrittweise, relative Häufigkeit Histogramm, weil die Anzahl der mRNA-Moleküle eine diskrete Menge ist. Das größte Fach jeder Histogramm wurde auf die gleiche Höhe normalisiert. Abbildung 1: Flussdiagramm des Protokolls SmFISH. Zellen werden mit Formaldehyd bei Raumtemperatur für 20 min oder bei 4 ° c über Nacht für vegetatives Wachstum und meiotischen Proben bzw. fixiert. Nach dem Waschen in Puffer B dreimal, werden Zellen von Zymolyase verdaut, bis ~ 70-90 % der Zellen verdaut werden. Die verdauten Proben sind dann gewaschen, einmal mit Puffer B, die Zymolyase zu entfernen, und anschließend permeabilized in 70 % igem Ethanol (EtOH) stundenlang ~3.5. Zur Vorbereitung der Hybridisierung sind Proben zunächst in 10 % Formamid Waschpuffer (FWB) für ~ 20 min inkubiert. Als nächstes sind die Proben in ~ 50 µL der Hybridisierung-Lösung, Nukleinsäuretablette, enthält die fluoreszierenden Sonden für Übernachtung Inkubation im Dunkeln bei 30 ° c. Die Proben sind nach Hybridisierung in 10 % FWB für 30 min abzuwaschen die überschüssige Sonden inkubiert und dann in 10 % FWB mit 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), die DNA zu beflecken inkubiert. Für die Probe unmittelbar nach der Inkubation FWB/DAPI abgebildet ist die Probe im GLOX Puffer ergänzt mit Katalase, Trolox und Glukose-Oxidase (GLOX + Enz); Nukleinsäuretablette in der Erwägung, dass die anderen Proben sind Nukleinsäuretablette im GLOX Puffer ohne Enzyme, und bei 4 ° c gelagert bis zu ~ 3 Stunden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Beurteilung der SmFISH Qualität mit ungerade/gerade Sonden. (A) oben: Schaltplan für die ungerade/gerade Sonde-Sets. Vierundfünfzig Oligonukleotid Sonden des NDC80 -Gens mit Ziegeln zu decken wurden entwickelt. Die ungeraden Sonden wurden mit einem Fluorophore (CF590, in Magenta dargestellt) und die geraden Sonden mit einem anderen Fluorophor (Q670, grün dargestellt) beschriftet. Unten: Vertreter SmFISH Bilder von meiotischen Prophase Zellen mithilfe der ungerade/gerade Sonde erworben. 6 Stunden nachdem Zellen (UB8144) eine Zeit auf Sporenbildung Medium übertragen wurden als diese Zellen in meiotischen Prophase verhaftet wurden, wurden Proben genommen. DNA wurde mit DAPI (blau dargestellt) gebeizt. Bilder werden als die maximale Intensität Projektionen der Z-Stapel angezeigt. Maßstabsleiste: erhalten die ungerade/gerade Sonde-Sets mit 5 µm. (B) Prozentsatz der gepaart oder ungepaart SmFISH Flecken. Insgesamt 428 meiotischen Prophase Zellen wurden analysiert, pooling von zwei unabhängigen Experimenten. Diese Zahl ist aus Abbildung 2geändert-Figur Zuschlag 4 von Chen Et Al. 16 (C) A kumulative Dichte Funktion (CDF) des Abstandes zwischen je zwei gekoppelten Flecken und der Abstand zwischen der nächste Nachbar ein Ungepaartes Spot. Für jeden gefundenen Fleck in einem fluoreszierenden Kanal, der “k nächsten Nachbarn” Algorithmus wurde angewandt, um am nächsten gefundenen Ort zu identifizieren – und die Entfernung zu diesem Punkt — in den ergänzenden Kanal. Lokalisierungen, die gegenseitige nächste Nachbarn waren galten gekoppelt werden, und eine neue Liste generiert wurde, Aufnahme der gekoppelten, nur CF590 und Q670 nur-Erkennungen. Für jede Kategorie von Erkennungen war ein CDF-Histogramm der Abstände in Matlab, bestätigt, dass richtig gekoppelte Flecken in der Tat viel näher in ferne als solche ohne eine entsprechende Stelle in den anderen Kanal wurden aufgetragen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Bruchteile von gepaarten und ungepaarten Flecken, in Abhängigkeit von der Gesamt-RNS pro Zelle Nummer. Um zu testen ob die Erkennung und Paarung der SmFISH Flecken auf verschiedenen Ausdruck Ebenen befangen, wurden einzelne Zellen durch total RNA Ausdruck gruppiert. Die mittlere Bruchteile von gekoppelten, nur CF590 und Q670 nur-Erkennungen wurden für jede Gruppe von Zellen berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Qualitätsbeurteilung von SmFISH Daten mit den Sonden für NDC80Luti entworfen und NDC80ORF mRNAs. Die Q-670-Sonden (grün dargestellt) in der gemeinsamen Region geteilt zwischen NDC80Luti hybridisieren und NDC80ORF mRNAs, während die CF-590-Sonden (in Magenta dargestellt) in der Region einzigartige 5′ NDC80Luti hybridisieren . (A) Vertreter SmFISH Bilder von NDC80Luti und NDC80ORF meiotischen Prophase erwarb unter im Vergleich zu suboptimalen Bedingungen optimiert. UB8144-Stämme (optimiert Zustand) und UB1337 (suboptimalen Zustand) induzierte Meiose unterziehen und während meiotischen Prophase behoben wurden. Diese beiden Stämme beherbergen verschiedene Synchronisation Systeme zur Meiose zu induzieren, aber die Verwendung von entweder System hat keinen Einfluss auf SmFISH Qualität (Daten nicht gezeigt). In den suboptimalen Zustand wurden Zellen bei Raumtemperatur für 20 min (keine Übernachtung Fixierung), verdaut mit Zymolyase ohne VRC ergänzt und in einer niedrigeren Konzentration des VRC hybridisiert fixiert. Bilder werden als die maximale Intensität Projektionen der Z-Stapel angezeigt. DNA wurde mit DAPI (blau dargestellt) gebeizt. Maßstab: 5 µm. (B) Scatterplots Anzeige das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und das Signal von jedem SmFISH vor Ort in das Sichtfeld erkannt dargestellt in Abbildung 4A, für entweder fluoreszierende Kanal sowie die optimierte oder suboptimalen Bedingungen. Im optimierten Zustand lebten zwei SmFISH Flecken vorhanden. Die wahre SmFISH Spots befanden sich in der Grauzone, trennt das Hintergrundsignal. In suboptimalen Zustand einzelnen mRNAs waren hart, von Auge zu unterscheiden, und die Trennung zwischen den wahren Spots und Hintergrund nach dem Ausführen der Spoterkennung Software war weniger offensichtlich. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: Ausdruck der NDC80Luti und NDC80ORF Abschriften sind zeitlich gesteuert. (A) Vertreter SmFISH Bilder von NDC80Luti und NDC80ORF während des vegetativen Wachstums und Meiose. Wenn Zellen (UB8144) exponentiell wachsende im Reich Nährmedium wurden, wurden die vegetative Proben genommen. 6 Stunden nachdem Zellen (UB8144) eine Zeit auf Sporenbildung Medium übertragen wurden als diese Zellen in meiotischen Prophase verhaftet wurden, wurden meiotischen Prophase Proben genommen. Die Q-670-Sonden (grün dargestellt) in der gemeinsamen Region geteilt zwischen NDC80Luti hybridisieren und NDC80ORF mRNAs, während die CF-590-Sonden (in Magenta dargestellt), der einzigartige 5′ Region NDC80hybridisieren Luti . DNA wurde mit DAPI (blau dargestellt) gebeizt. Jede Zelle wurde durch seine Zip1-GFP-Signal, ein Marker für meiotischen Prophase inszeniert. Unser SmFISH-Protokoll bewahrt starkes GFP Signal ohne weitere Modifikation. Vegetatives Wachstum: Zip1-GFP negativ. Meiotischen Prophase: Zip1-GFP positiv. Bilder werden als die maximale Intensität Projektionen der Z-Stapel angezeigt. Maßstab: 5 µm. Diese Zahl ist aus Abbildung 2 von Chen Et Al. geändert. 16. (B) NDC80ORF, NDC80Lutiund Ndc80 Protein (Ndc80p) Ebene während der Meiose (UB4074). NDC80Luti und NDC80ORF Ebenen wurden durch Nordfleck, und Ndc80p Ebene wurde durch Anti-V5 Immunoblot zu den angegebenen Zeitpunkten bestimmt. Hxk1p, Ladekontrolle für Immunoblot. Als UB8144 Stamm, birgt auch diese Sorte der pGAL-NDT80 GAL4-ER Synchronisation System19,20. Zellen wurden auf 0 Stunden auf Sporenbildung Medium übertragen und durch β-Östradiol zusätzlich 6 Stunden später aus der Pachytene Haft entlassen. Die NDC80Luti Abschrift in S/meiotischen Prophase robust erkannt wurde, während die NDC80ORF Transkripte war überwiegend vor der meiotischen Eintrag (0 Stunden) und während die meiotischen Divisionen (7-9 Stunden). Diese Zahl ist aus Abbildung 6J von Chen Et Al. geändert. 16 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.  Abbildung 6: Bootstrap-Analyse für die meiotischen Prophase Proben gezeigt Abbildung 5 . Aller quantifizierten Zellen wurden zusammengefasst und eine bestimmte Anzahl (n) der Zellen wurden nach dem Zufallsprinzip 500 mal probieren. Der Mittelwert und 95 % Konfidenzintervall wurden für den Bruchteil der gepaarten und ungepaarten mRNA pro Zelle berechnet. Diese Daten wurden für jede Wahl die Zahl n (kleines Foto) aufgetragen. Das Plateau in Varianz wurde visualisiert, indem Plotten der Stichprobenvarianz dividiert durch den Mittelwert in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen (n) abgetastet. Die Gesamtzahl der Zellen gemessen (437) überstiegen die Nummer auf dem Plateau des Fehlers (~ 60 Zellen), darauf hinweist, dass zusätzliche Daten nicht das Vertrauen in die Messungen verbessern würde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7: Quantifizierung der SmFISH Daten in Abbildung 5 , als die relative Häufigkeit Histogramme der Zellen mit einer bestimmten Anzahl von NDC80Luti gezeichnete und NDC80ORF Abschriften pro Zelle, mit den Daten aus drei unabhängigen Experimenten gebündelt. Die gestrichelte Linie gibt die mittlere Anzahl der NDC80Luti und NDC80ORF Abschriften pro Zelle. Jede Histogramm war normalisiert, so dass die maximale bin Höhe der gleichen quer durch die Histogramme. Eine Gesamtanzahl von 637 Zellen wurden für vegetatives Wachstum und 437 für meiotischen Prophase analysiert. Zweiseitige Wilcoxon Rang Summe durchgeführt wurde für NDC80Luti und NDC80ORF, vegetative und meiotischen Prophase Proben zu vergleichen. Diese Zahl wird von Figur 2D von Chen Et Al. geändert. 16 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.  Puffer B (1 L Brühe: 1,2 M Sorbit; 0,1 M Kalium-Phosphat-Puffer pH 7,5) 1 x Nuklease-freies Wasser 500 mL Sorbit 218,6 g KH2PO4 2,18 g K2HPO4 14,62 g Nuklease-freies Wasser 1 L Endvolumen bringen * Lagerung bei 4 ° c in 50-mL-aliquoten nach Filter sterilisieren Zymolyase 100 t (10 mg/mL) * Lagerung bei-20 ° c in Aliquote 10 mg Zymolyase Pulver in 1 mL MilliQ Wasser auflösen E. coli tRNA (10 mg/mL) * Lagerung bei-20 ° c in Aliquote 10 mg tRNA Pulver in 1 mL MilliQ Wasser auflösen 70 % igem Ethanol (50 mL) 1 x (mL) Reinem ethanol 35 Nuklease-freies Wasser 15 * Bei Raumtemperatur lagern Hybridisierung-Puffer (10 mL) 1 x (mL) 50 % Dextran Sulfat 2 E. Coli tRNA (10 mg/mL) 1 200 mM Vanadyl Ribonucleoside Komplex (VRC) 0.1 BSA, 50 mg/mL 0,04 20 X SSC 1 Formamid 1 Nuklease-freies Wasser 4,86 * Bei-20 ° c in 250 µL oder 500 µL Aliquots Lagern 10 % Formamid Waschpuffer (10 mL) 1 x (mL) Formamid bei Raumtemperatur 1 20 X SSC 1 Nuklease-freies Wasser 8 * machen Sie frisch, Wirbel für 20-30 Sekunden mischen 10 % Glukoselösung * Lagerung bei 4 ° c in Aliquote nach Filter sterilisieren 1 g Glukose in 10 mL Nuklease-freies Wasser auflösen Glukose-oxidase * Lagerung bei-20 ° c in Aliquote Auflösen von 3,7 mg Glukose-Oxidase in 1 mL 50 mM NaOAc, pH 5 Anti-Bleichmittel (GLOX) Puffer ohne Enzyme (1 mL) 1 x (µL) 10 % Glukose im Nuklease-freies Wasser 40 1 M Tris, pH 8,0 10 20 X SSC 100 Nuklease-freies Wasser 850 * frisch machen, können auch Aliquote bei 4 ° c Lagern Anti-Bleichmittel (GLOX) Puffer mit Enzymen (50 µL) 1 x (µL) Katalase (Vortex gelinde gesagt, es setzt sich leicht) 0,5 Glukose-oxidase 0,5 100 mM Trolox (gelöst in Ethanol) 1 GLOX Puffer 50 * frisch machen jedes Mal, auf dem Eis vorbereiten, können für ca. 2-3 Stunden bei 4 ° c gelagert werden Tabelle 1. Puffer und Medien