Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Чтобы оценить, насколько хорошо smFISH протокол работал (изложенные в Рисунок 1), мы разработали набор 54 зонды которые плитка открытой чтении кадр гена NDC80 (рис. 2A, сверху). Зонд расположен в наиболее 5′ конце именуется как зонд 1; Следующий 1, зонд 2; и третье, зонд 3, и т.д. 27 зонды назначен нечетное число (датчик 1, 3, 5…) сопряжены для Люминесцентную краску CAL Fluor 590 (CF590); и 27 зонды четное число (зонд 2, 4, 6…), конъюгированных Люминесцентную краску Квазар 670 (Q670). Следовательно эти чередующиеся наборы зонд часто называются «чет/нечет» зондов. После гибридизации оба набора зонд должен ярлык же стенограмма. После обнаружения место мы использовали несколько измерений судить о качестве smFISH набора данных. Первый из них был степень и качество colocalization для чет/нечет зондов. В нашем случае 88% всех пятен smFISH colocalized (рисунок 2A и 2B), с более чем 95% паре в пределах 2 пикселов друг от друга (рис. 2 c, парных), пятна, которые в пределах ожидаемое значение любой хроматические и обнаружения отклонение между двумя каналами флуоресцентные. Для сравнения, менее 10% непарных пятна имел ближайшего соседа расстояние менее 2 пикселов, показывают, что вероятность неправильного представления пятно пара низкого (рис. 2 c). 12% непарных пятна были поровну между двумя каналами (Рисунок 2Б, Сравните CF590-только с Q670-только); и таким образом, мы пришли к выводу, что для этого гена 2,4 КБ с диапазоном выражения между нуля до 45 стенограммы в клетку, ~ 94% молекул РНК точно были обнаружены в каждом канале, флуоресцентные. Если протокол smFISH субоптимальные, одно будет наблюдать (1) большую часть пятна smFISH только с одним из двух сигналов флуоресцентные (не colocalized), и/или (2) клетки с очень низкое соотношение сигнал шум или сигнал не на всех. Далее, мы попросили, если обнаружение сигнала smFISH был пристрастен в отношении общего числа молекул РНК в клетку. В популяции общее количество конкретного РНК в каждой ячейке лежит в распределении, некоторые клетки укрывательство больше молекул РНК, чем другие. Хороший smFISH протокол должен энергично обнаружить РНК независимо ли высокой или низкой число молекул РНК присутствует в каждой клетке. Чтобы проверить это, для каждой ячейки, мы рассчитали фракция smFISH пятна с colocalized сигналов и дроби с только одним из двух люминесцентных сигналов. После группировки клетки, которые имели одинаковое количество общего числа в ячейке, мы рассчитывается средняя фракция colocalized (парные) или не colocalized (только для CF590 или Q670-только) пятна в данной группе и графике это среднее значение в зависимости от общего числа пятна на ячейку (рис. 3). Для каждой категории пятен фракции были похожи через весь спектр общее количество точек в клетку. Например сравнивая клетки с в общей сложности 20 флуоресцентные пятна на ячейку сравнению с в общей сложности 30 точек, средняя фракции colocalized пятна были похожи. Этот результат предложил, что наш протокол мог обнаружить молекул РНК диапазон в клетке (до по крайней мере 40 ~ молекул в клетку). Если протокол работал suboptimally, одно может наблюдать уклоном. Например часть пятна с только один из двух люминесцентных сигналов может увеличиться как общее количество пятен на ячейку увеличилось. Используя этот оптимизированный протокол, мы изучили выражение NDC80 ген, который кодирует белок Кинетохор, в различных условиях. Джин NDC80 выражает две изоформы мРНК: долго undecoded Стенограмма изоформы, NDC80luti, имеет расширение ~ 400 пар в конце 5′ по сравнению с краткосрочной NDC80ORF изоформы, но оба стенограммы поделиться кодирвоания гена NDC80 (см. схема в Рисунок 4A). Мы разработали два набора зондов: CF 590 набор связывается с уникальным 5′ регион NDC80luti; и набор Q 670 связывается с общей области NDC80luti и NDC80ORF. NDC80luti стенограммы были обнаружены пятна smFISH, где сигналы от оба датчика Наборы colocalized, тогда как NDC80ORF стенограммы были те сигнала только от Q 670. Из-за размера сегмента уникальный NDC80lutiмы могли бы только плитка 20 зонды олигонуклеотида вдоль этого региона, который меньше, чем рекомендуемый зонды 30-48. Таким образом мы сначала определяется, если этот набор зонд надежно может обнаружить РНК в нашем оптимизирован протокол. Для либо флуоресцентные канала мы графике отношение сигнал шум (SNR, определяется как дисперсию значений пикселов, окружающих место по отношению к пятно интенсивности) против сигнал обнаружения для каждого smFISH месте и формируются рассеяния для всех пятен выявленные в всего поля зрения (пример изображения в Рисунок 4A ) и участки в рисунке 4В. Двух различных популяций были четко определены для Q 670 и CF 590 зонд наборы (оптимизировано, рис. 4B), предполагая, что истинный smFISH пятна (внутри области серого) могут быть отделены от фонового сигнала. Отметить, что в условиях неоптимальных такое разделение был менее очевидным (Suboptimal, Рисунок 4B). Мы использовали эти наборы два зонда для изучения выражение NDC80luti и NDC80ORFво время вегетативного роста и мейоз. В растительных клетках надежный сигнал из Q 670 зонд набора был обнаружен, но не от CF 590 зонда набор (Рисунок 5A, вегетативной), соглашаясь с замечанием, Северный blotting, только короткие изоформы было выражено во время вегетативного роста16 . Этот результат также предложил, что CF 590 зонда набор конкретных, приносит низкий фон в нашем оптимизирован smFISH протокол. В противоположность этому надежный сигнал от обоих зонд был обнаружен в meiotic профаза, и большинство пятна colocalized сигнала (Рисунок 5A, meiotic профаза). Наряду с анализом Северная помарка (Рисунок 5B) это наблюдение подтвердил, что длинные изоформы NDC80luti была выражена конкретно в мейоз. Эти два типа mRNAs были обнаружены в цитоплазме (за пределами региона DAPI), предполагая, что оба были экспортированы из ядра, в соответствии с рибосомы, Профилирование данных18. Чтобы определить, если достаточные данные были собраны для точного счета для биологической вариации, присущих нашей набор данных, мы провели загрузчик анализ с использованием статистических данных каждой ячейки, которая включала (1) часть colocalized пятна на клетки и (2) Доля мест с одним из двух люминесцентных сигналов (CF 590 только и Q 670 только). В этом анализе программа случайно выбранных одну ячейку из 437 количественных клеток для 500 итераций. Далее среднее и дисперсия соответствующих статистических данных, связанных с этими 500 ячеек были рассчитаны. Этот процесс был затем повторяется для случайным выбором две клетки от всех клеток, без замены; а потом случайно выбора три клетки и др. пока одна половина размера общего набора данных было достигнуто. Вариативность в наборе данных перестала расти после ~ 40 клеток, о том, что после этого момента большинство различий в средней неотъемлемым элементом данных, вместо того, чтобы артефакт undersampling (рис. 6, вставка). Этот эффект становится более очевидным, когда мы графике выборочную дисперсию, разделенных выборочное среднее, как функция количество клеток, отобранных в каждой итерации цикла (рис. 6). С данными показано изменения в дисперсии стал diminishingly небольшой после ~ 60 ячеек. Количество клеток, количественно в smFISH эксперименте должен превышать минимальное количество клеток, необходимых для достижения стабильного среднего и плато дисперсии. В нашем случае мы количественно более 95 клетки на сэмпл, за репликацию. Общее количество клеток (> 400 клетки) также превышает минимальное количество (~ 60 клетки), необходимое для отражения среднего. Заказные программы Matlab16растительной клетки были обнаружены в среднем 5 NDC80ORF стенограммы в клетку, тогда как в клетках meiotic профаза, медиана значительно упала до 4 стенограммы в клетку (2 tailed Вилкоксон Ранг сумма тест, p = 0,026) (Рисунок 7). Среднее количество NDC80luti стенограммы на ячейку был 21 стенограммы, и 100% ячеек выражена NDC80luti стенограммы. Мы графике часть клетки с заданным числом стенограммы как поэтапный, относительной частоты гистограммы, потому что количество молекул мРНК дискретной величины. Крупнейший бин каждой гистограммы нормализуется на одинаковой высоте. Рисунок 1: диаграмму для протокола smFISH. Клетки фиксируются с формальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут или на 4 ° c на ночь, для вегетативного роста проб и мейотическую, соответственно. После мытья в буфер В три раза, клетки усваиваются с zymolyase до ~ 70% – 90% клеток перевариваются. Усваивается образцы затем промывают один раз с буфера B для удаления zymolyase и впоследствии permeabilized в 70% этанола (EtOH) для ~3.5 часов. Чтобы подготовиться к гибридизации, Образцы инкубируют в 10% формамида мыть буфера (FWB) ~ 20 мин. Далее образцы являются высокомобильна в ~ 50 мкл раствора гибридизации, который содержит флуоресцентных зондов для ночи инкубации в темноте на 30 градусов. После гибридизации образцы инкубировали в FWB 10% для 30 минут смыть излишки зондов, а затем инкубируют в 10% FWB с 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятно ДНК. Для примера, отображаемого сразу же после инкубации FWB/DAPI образец высокомобильна в буфере GLOX, дополнена каталазы, Trolox и глюкоза оксидаза (GLOX + enz); в то время как другие образцы высокомобильна в буфере GLOX без ферментов и хранить при 4 ° c до ~ 3 часа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: Оценка качества smFISH, с использованием зондов, чет/нечет. (A) top: Схема для наборов чет/нечет зонд. Пятьдесят четыре олигонуклеотидных зондов черепица NDC80 гена были разработаны. Нечетные зонды были помечены с одним Флюорофор (CF590, показан пурпурным) и четные зонды, с другой Флюорофор (Q670, показано зеленым). Внизу: Представитель smFISH изображения meiotic профаза клеток, полученные с помощью зонда, чет/нечет наборов. 6 часов после того, как клетки (UB8144) были переданы заспорение среднего, то время, когда эти клетки были арестованы в профазе meiotic были взяты образцы. ДНК был запятнан DAPI (показаны синим цветом). Изображения отображаются в виде проекций максимальной интенсивности z стеки. Линейки: 5 мкм. (Б) процент в паре или непарные smFISH пятна полученные с помощью зонда, чет/нечет наборов. В общей сложности 428 meiotic профаза клетки были проанализированы, объединение двух независимых экспериментов. Этот показатель изменяется от Рисунок 2-рис Дополнение 4 Чэнь и др. 16 (C) совокупный плотность функция (СГО) расстояния между каждой парой парные пятна и расстояние между ближайшего соседа непарных пятно. Для каждого обнаруженного пятно в одном канале флуоресцентные, алгоритм «k ближайших соседей» был применен для определения ближайших обнаруженных месте — и расстояние до этого места — в дополнительных канала. Локализации, которые были взаимные ближайших соседей были рассмотрены в паре, и новый список был создан запись парных, CF590 и только Q670 обнаружений. Для каждой категории обнаружений СГО гистограммы расстояния было изобразить в Matlab, подтверждающий, что правильно парные пятна действительно были гораздо ближе в расстоянии чем те, без соответствующего места в другой канал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: число фракций парные и непарные пятна, как функция общего РНК в клетку. Чтобы проверить, если обнаружение и сопряжения smFISH пятен предвзято на уровнях различные выражения, отдельные клетки были сгруппированы по общее выражение РНК. Средняя фракции парных, CF590 и только Q670 обнаружений были рассчитаны для каждой группы клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4: Оценка качества smFISH данных, получаемых с помощью зондов для NDC80luti и NDC80ORF мРНК. Q 670 зонды (показано зеленым) гибридизировать к общей региона совместно NDC80luti и NDC80ORF мРНК, тогда как CF 590 зонды (показан пурпурным) гибридизировать в регионе уникальные 5′ NDC80luti . (A) представитель smFISH образы NDC80luti и NDC80ORF в meiotic профаза, приобретенные под оптимизирован по сравнению с оптимальным условиям. Штаммы UB8144 (оптимизированный условие) и UB1337 (субоптимальные условие) были вынуждены пройти мейоз и фиксированной во время meiotic профаза. Эти два штаммов гавани систем синхронизации побудить мейоз, но использование любой системы не влияет на качество smFISH (данные не показаны). В условиях неоптимальных клетки были исправлены при комнатной температуре 20 мин (не ночь фиксации), переваривается с zymolyase без VRC дополнен и гибридизированных в низкой концентрации VRC. Изображения отображаются в виде проекций максимальной интенсивности z стеки. ДНК был запятнан DAPI (показаны синим цветом). Линейки: 5 мкм. Scatterplots (B) отображение отношение сигнал шум (SNR) и сигнал каждого smFISH месте обнаружен в поле зрения представлены в Рисунок 4A, либо флуоресцентные канала, а также для оптимизированного или неоптимальных условиях. В оптимизированные условия присутствовали две популяции smFISH пятен. Истинный smFISH пятна были расположены внутри области серый, отделяя от фонового сигнала. В условиях неоптимальных индивидуальных mRNAs были трудно отличить на глаз, и разделение между истинной пятна и фон после запуска месте обнаружения программного обеспечения был менее очевидным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5: Выражение NDC80luti и NDC80ORF височно контролируются стенограммы. (A) представитель smFISH образы NDC80luti и NDC80ORF во время вегетативного роста и мейоз. Вегетативные пробы были взяты когда клетки (UB8144) растет в геометрической прогрессии в богатой питательной среде. 6 часов после того, как клетки (UB8144) были переданы заспорение среднего, то время, когда эти клетки были арестованы в профазе meiotic были взяты пробы meiotic профаза. Q 670 зонды (показано зеленым) гибридизировать к общей региона совместно NDC80luti и NDC80ORF мРНК, тогда как CF 590 зонды (показан пурпурным) гибридизировать в уникальный 5′ регион NDC80luti . ДНК был запятнан DAPI (показаны синим цветом). Каждая ячейка была поставлена его сигнал Zip1-GFP, маркер для meiotic профаза. Наши smFISH протокол сохраняет сильный сигнал GFP без дальнейших изменений. Вегетативного роста: Zip1-GFP отрицательной. Meiotic профаза: Zip1-GFP положительный. Изображения отображаются в виде проекций максимальной интенсивности z стеки. Линейки: 5 мкм. Этот показатель изменяется от Рисунок 2 c Чэнь и др. 16. (B) NDC80ORF, NDC80lutiи уровень протеина (Ndc80p) Ndc80 во время мейоза (UB4074). NDC80luti и NDC80ORF уровни были определены при Северная помарка, и Ndc80p уровень определяется immunoblot анти V5 в назначенное время точках. Hxk1p, контроля для immunoblot загрузки. Как штамм UB8144, этот штамм также затаивает pGAL-NDT80 GAL4-ER синхронизации системы19,20. Клетки были переданы заспорение среднего в 0 час и освобождается от ареста pachytene β-эстрадиола добавлением 6 часов спустя. NDC80luti Стенограмма энергично был обнаружен в S/meiotic профаза, тогда как NDC80ORF стенограммы преимущественно присутствовал до meiotic запись (0 часов) и во время meiotic дивизий (7-9 часов). Этот показатель изменяется от Рисунок 6J Chen et al. 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.  Рисунок 6: загрузочный анализ образцов meiotic профаза, показано в Рисунок 5 . Все количественные клетки были объединены, и заданное количество клеток (n) случайно были взяты пробы в 500 раз. Среднее значение и 95% доверительный интервал были рассчитаны для фракция парные и непарные мРНК в клетку. Эти данные были построены для каждого выбора число n (вставка). Плато в дисперсии был визуализирован путем построения выборочную дисперсию, разделенных означает, как функция количество клеток (n) пробы. Общее количество клеток измеряется (437) значительно превышает число на котором ошибка перестала расти (~ 60 клетки), указав, что дополнительные данные не повысит доверие в измерениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 7: количественная оценка smFISH данные, отображаемые в Рисунок 5 , графическом качестве относительной частоты гистограммы клеток с заданным числом NDC80luti и NDC80ORF стенограммы в клетку, с использованием данных пула от трех независимых экспериментов. Пунктирная линия показывает среднее количество NDC80luti и NDC80ORF стенограммы в клетку. Каждой гистограммы нормализуется так что бин максимальная высота была одинаковой во всех гистограммы. Общее количество 637 клетки были проанализированы для вегетативного роста и 437 для meiotic профаза. Двустороннее Вилкоксон ранг сумма тест был проведен для NDC80luti и NDC80ORF, соответственно, сравнивая растительные и meiotic профаза образцы. Этот показатель изменяется от 2D фигура Чэнь и др. 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.  Буфера B (1 Л складе: 1,2 М сорбитол; 0,1 М калия фосфат буфера, pH 7.5) 1 x Нуклеаза свободной воды 500 мл Сорбит 218.6 g KH2PO4 2.18 g K2HPO4 14.62 g Нуклеаза свободной воды Довести до окончательного объемом 1 Л * Хранить при 4 ° c в 50-мл аликвоты после стерилизации фильтр Zymolyase-100T (10 мг/мл) * Хранить на уровне-20 ° c в аликвоты Растворите порошок zymolyase 10 мг в 1 мл MilliQ воды E. coli tRNA (10 мг/мл) * Хранить на уровне-20 ° c в аликвоты Растворите порошок tRNA 10 мг в 1 мл MilliQ воды 70% этанола (50 мл) 1 x (мл) Чистого этанола 35 Нуклеаза свободной воды 15 * Хранить при комнатной температуре Гибридизация буфера (10 мл) 1 x (мл) 50% декстран сульфат 2 E. coli tRNA (10 мг/мл) 1 200 мм ванадила ribonucleoside комплекс (ВРЦ) 0.1 BSA, 50 мг/мл 0,04 20 x SSC 1 Формамид 1 Нуклеаза свободной воды 4.86 * Хранить на уровне-20 ° c в 250 мкл или 500 мкл аликвоты 10% формамида мыть буфера (10 мл) 1 x (мл) Формамид при комнатной температуре 1 20 x SSC 1 Нуклеаза свободной воды 8 * сделать свежие, вихревые для 20-30 лет смешивать 10% раствор глюкозы * Хранить при 4 ° c в аликвоты после стерилизации фильтр Растворить 1 г глюкозы в 10 мл воды, свободной от нуклеиназы Глюкозооксидаза * Хранить на уровне-20 ° c в аликвоты Распустить глюкозооксидаза 3,7 мг в 1 мл 50 мм NaOAc, рН 5 Борьбе с отбеливателем (GLOX) буфер, без ферментов (1 мл) 1 x (мкл) 10% раствор глюкозы в свободной от нуклеиназы воды 40 1 М трис, рН 8,0 10 20 x SSC 100 Нуклеаза свободной воды 850 * сделать свежие, можно также хранить аликвоты на 4 ° c Борьбе с отбеливателем (GLOX) буфера, с энзимами (50 мкл) 1 x (мкл) Каталазы (вихревой мягко, он оседает легко) 0.5 Глюкозооксидаза 0.5 100 мм (растворимые в этиловом спирте) Trolox 1 GLOX буфер 50 * сделать свежий каждый раз, готовить на льду, можно хранить при 4 ° c на 2-3 часа Таблица 1. Буферы и средства массовой информации