Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Ne kadar iyi çalıştı smFISH Protokolü (anahat içinde Şekil 1), NDC80 gen açık okuma çerçevesi karo 54 probları bir dizi tasarlanmış değerlendirmek için (Şekil 2A, üst). En sonunda 5′ bulunan prob prob 1 adlandırılır; bir sonraki, sonda 2; ve üçüncüsü, yoklama 3, vb. 27 probları garip bir atanan sayı (Probe 1, 3, 5…) tüm CAL Fluor 590 (CF590) floresan boya için; Birleşik ve Quasar 670 (Q670) floresan boya için Birleşik bir çift sayı (Probe 2, 4, 6…), 27 probları atanır. Bu nedenle, bu alternatif sonda kümeleri probları “tek/çift” anılır. Hibridizasyon, her iki prob kümeleri aynı transkript etiket. Nokta algılama sonra biz smFISH veri kümesi kalitesini yargıç için birkaç ölçümleri kullanılır. Birincisi derecesi ve kalitesini colocalization için tek/çift probları oldu. Bizim durumumuzda, beklenen verilen değer içinde herhangi bir renk olan her diğer (eşleştirilmişŞekil 2C,), 2 piksel yakınına eşleştirilmiş noktalar ve algılama % 95’i daha büyük (Şekil 2A ve 2B), smFISH lekelerin % 88 colocalized sapmaları iki floresan kanallar arasında. Buna karşılık, bir komşu en yakın mesafe az 2 piksel, spot bir çift Algıla olasılığı düşük olduğunu gösteren unpaired noktalar % 10’dan az vardı (Şekil 2C). % 12’si unpaired noktalar eşit iki kanal arasında ayrıldı (Şekil 2B, karşılaştır CF590 yalnızca salt Q670 ile); ve böylece, biz 2.4 kb bir genle için hücre başına 45 transkript sıfıra arasında ifade bir dizi, RNA moleküllerinin ~ doğru floresan her kanalda algılandı. SmFISH Protokolü suboptimal olsaydı, bir smFISH noktalar (colocalized-) iki floresan sinyallerini yalnızca biri ile daha büyük (1) bir kısmını ve/veya (2) çok düşük bir sinyal-gürültü oranı veya sinyal yok hücrelerle hiç gözlemlemek. Biz sonraki smFISH sinyal algılama RNA molekülleri hücre başına toplam sayısı ile ilgili olarak önyargılı Eğer sordu. Bir nüfus içinde belirli bir RNA her hücrede toplam sayısı bir dağıtım, diğerlerine göre daha fazla RNA molekülleri yataklık bazı hücreler aittir. Bir daha yüksek bir sayı veya RNA molekülleri az sayıda her hücrede mevcut olup iyi smFISH Protokolü sağlam RNA ne olursa olsun olup olmadığını algılamalıdır. Bu, her hücre için test etmek için colocalized sinyalleri smFISH lekeli kısmını ve kesir iki floresan sinyallerini yalnızca biri ile hesaplanır. Toplam noktalar aynı sayıda hücre başına vardı hücreleri gruplandırma sonra biz ortalama kısmını hesaplanan colocalized (eşleştirilmiş) veya (yalnızca CF590 veya salt Q670) lekeler sigara colocalized belirli bir grup ve bu ortalama toplam sayısı bir fonksiyonu olarak Grafiği çizilecek. hücre (Şekil 3) başına noktalar. Noktalar her kategori için kesirler noktalar hücre başına toplam sayısı tüm aralığında benzerdi. Örneğin, toplam 30 noktalar toplamda olanlar karşı hücre başına 20 floresan lekelerin bulunduğu hücreleri karşılaştırma, colocalized noktalar ortalama kesirler benzerdi. Bu sonuç bizim Protokolü (en çok en az 40 ~ moleküller hücre başına) bir hücre aralığı RNA molekülleri tespit olabilir önerdi. Protokol suboptimally işe yaradıysa, biri bir önyargı gözlemlemek olabilir. Örneğin, yalnızca iki floresan sinyallerini biri lekeli kısmını noktalar arttı hücre başına toplam sayısı olarak artırabilir. Bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralını kullanan, biz farklı büyüme ortamlarda bir kinetochore protein kodlar NDC80 Gen ifadesinin inceledi. NDC80 gen iki mRNA izoformlarının ifade eder: uzun undecoded transkript izoformu, NDC80luti, vasıl belgili tanımlık son 5′ ile karşılaştırıldığında kısa bir ~ 400 baz çifti uzantılı NDC80ORF pay izoformu, ama her iki transkript Kodlayıcı bölge NDC80 gen (bkz: şematik 4A şekiliçinde). Probları iki set dizayn ettik: CF 590 kümesi benzersiz 5′ bölgesinin NDC80luti; için bağlar ve Q 670 küme NDC80luti ortak bölgesine bağlanır ve NDC80ORF. NDC80luti transkript nerede sinyalleri her iki yoklama colocalized, kümeleri ise smFISH noktalar tespit edildi NDC80ORF transkript bu sadece Q 670 gelen sinyal ile vardı. NDC80lutibenzersiz segment büyüklüğü nedeniyle, sadece 20 oligonükleotid probları boyunca önerilen 30 ila 48 probları daha az olan bu bölge, döşeme. Bu yüzden, biz önce Bu sonda set sağlam RNA bizim en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralında tespit olabilir Eğer belirlenir. Floresan her iki kanalı için sinyal-gürültü oranı (SNR, bir nokta nokta yoğunluğu göre çevreleyen piksel varyansını olarak tanımlanan) için her smFISH nokta tespit sinyali karşı Grafiği çizilecek ve bir scatterplot tüm noktalar için oluşturulan Tüm görüş alanı ( Şekil 4A örnek görüntüler) ve araziler Şekil 4Bolarak tanımlanan. İki ayrı nüfus açıkça için her iki Q 670 tespit edildi ve CF 590 sonda (optimize edilmiş, Şekil 4B), ayarlar öne doğru smFISH noktalar (gri alanı içinde) arka plan sinyalini ayrılmış. Suboptimal durumda daha az belirgin (Suboptimal, 4B rakam) böyle ayrılık olduğunu unutmayın. Biz bu iki prob kümeleri NDC80luti ifade çalışırdım ve NDC80ORFbitkisel büyüme ve mayoz sırasında. Bitkisel hücrelerde Q 670 sonda kümesinden güçlü sinyal algılandı ancak CF 590 sonda Kuzey Blot tarafından gözlem ile (Şekil 5A, bitkisel), kabul sadece kısa izoformu bitkisel büyüme16 sırasında ifade ayarlanmamış . Bu sonuç da CF 590 sonda küme belirli, düşük arka planda bizim en iyi duruma getirilmiş smFISH Protokolü verimli olduğunu düşündürmektedir. Buna ek olarak, her iki prob kümelerinden güçlü sinyal segregasyonun profaz algılandı ve noktalar çoğunluğu sinyal (Şekil 5A, segregasyonun profaz) colocalized. Kuzey blot Analizi (Şekil 5B) ile birlikte, bu gözlem uzun izoformu NDC80luti özellikle mayoz ifade edildi doğruladı. MRNA’ların bu iki tür (dışında DAPI bölgesi) sitoplazmada her iki çekirdek veri18profil oluşturma ribozom ile tutarlı üzerinden verildi Düşündüren tespit edildi. Yeterli veri bizim veri kümesine içsel biyolojik değişim için doğru bir şekilde hesabına toplanmıştır belirlemek için biz (1) (2) başı hücre colocalized noktalar kesir dahil her hücre istatistikler kullanarak önyükleme çözümlemenin (CF 590 sadece ve Q 670 sadece) iki floresan sinyalden birisi lekeli kısmını. Bu analizde, bir programın rasgele 500 yineleme için 437 quantified hücrelerden bir hücreyi seçtiğinizden. Ardından, ortalama ve bu 500 seçili hücreler ile ilişkili ilgili istatistik varyansını hesaplanmıştır. Bu işlem sonra rastgele iki hücre yerine koymadan tüm hücreleri seçmek için tekrar edilmiş; ve sonra rasgele seçme üç hücreleri, vs. kadar toplam veri kümesi boyutu yarısı ulaştı. ~ 40 hücreleri, bu noktadan sonra çoğu ortalama varyasyon içsel veri yerine undersampling bir artifakı olduğunu düşündüren sonra veri kümesi varyans monoton (Şekil 6, iç metin). Bu etkinin ne zaman biz her yineleme döngüsü (Şekil 6) örneklenmiş hücre sayısı bir fonksiyonu olarak örnek ortalaması tarafından bölünmüş örnek varyans Grafiği çizilecek daha belli oldu. Gösterilen veriler ile varyans değişikliği ~ 60 hücreleri sonra diminishingly küçük oldu. SmFISH deney sayısal hücreleri hücre istikrarlı bir ortalama ve bir plato varyans elde etmek için gerekli en az sayıda aşmalıdır. Bizim durumumuzda biz örnek çoğaltılır başına başına üzerinde 95 hücre sayılabilir. Popülasyon ortalaması yansıtmak için gerekli en az sayıda hücre (~ 60 hücreleri) de aştı toplam hücre (> 400 hücreleri). Bir ısmarlama Matlab programı16ile medyan 5 için bitkisel hücreleri bulundu NDC80ORF hücre, başına transkript segregasyonun profaz hücrelerde, hücre (iki uçlu Wilcoxon başına 4 transkript için ortanca önemli ölçüde düştü, ancak Sırası Sum testi, p = 0.026) (Şekil 7). NDC80luti transkript hücre başına ortalama sayısı 21 transkript yapıldı ve hücrelerin % 100 NDC80luti transkript dile getirdi. MRNA molekülleri sayısı ayrı bir miktar olduğu için biz bir step-wise, göreli frekans çubuk grafik transkriptleri belirli sayıda hücrelerle kısmını Grafiği çizilecek. Her çubuk grafik en büyük depo aynı yüksekliğe normalleştirilmiş. Şekil 1: smFISH iletişim kuralı için Flow-chart. Hücreleri formaldehit, oda sıcaklığında 20 dakika veya 4 ˚C ile gecede, bitkisel büyüme örnekleri ve segregasyonun örnekleri için sırasıyla sabittir. % ~ 70- hücre sindirilmiş kadar tampon B üç kez yıkadıktan sonra zymolyase tarafından hücreleri sindirmek. Sindirilir örnekleri arabellek zymolyase kaldırmak için B ile bir kez yıkanmış ve daha sonra % 70 etanol (alkol) ~3.5 saatlerce permeabilized. Hibridizasyon için hazırlamak için örnekleri ilk arabellekte % 10 formamide yıkama (FWB) ~ 20 dakika inkübe. Daha sonra örnekleri ~ 50 µL hibridizasyon başvuruluyor, floresan problar 30 ˚C, karanlık gecede kuluçka için geçerli olan resuspended. Hibridizasyon sonra örnekleri için 30 dk içinde % 10 FWB fazla probları yıkamayı inkübe ve % 10 FWB ile 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DNA leke DAPI) içinde inkübe. Hemen FWB/DAPI kuluçka sonra yansıma örnek için örnek katalaz, Trolox ve glikoz oksidaz ile (GLOX + enz); desteklenen GLOX arabelleği resuspended Oysa diğer örnekleri enzimler olmadan GLOX arabelleğinde resuspended ve 4 ˚C depolanan, ~ 3 saate kadar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: tek/çift probları kullanarak smFISH kalitesini değerlendirilmesi. (A) top: Şematik tek/çift prob kümeleri için. Elli dört oligonükleotid probları NDC80 gen fayans tasarlanmıştır. Tek sayılı probları bir fluorophore (CF590, magenta içinde gösterilir) ve çift numaralı sondaları başka bir fluorophore (Q670, yeşille gösterildiği) ile etiketlenmiş. Alt: Temsilcisi smFISH görüntüleri segregasyonun profaz hücre tek/çift prob kümeleri kullanarak elde. Örnekleri 6 saat sonra hücreler (UB8144) sporulation orta olarak ne zaman bu hücreler segregasyonun profaz tutuklandı bir zaman transfer edildi alınmıştır. DNA (mavi renkle gösterilmiştir) DAPI ile lekeli. Görüntüleri z-yığınlar maksimum yoğunluk projeksiyon gösterilir. Ölçek çubuğu: 5 µm. eşleştirilmiş veya unpaired smFISH noktalar (B) yüzdesini elde tek/çift prob kümesi’ni kullanma. Toplam 428 segregasyonun profaz hücre analiz, iki bağımsız deneylerden Havuzu. Bu şekil Şekil 2′ den değiştirilir-şekil ek 4 Chen vd. 16 (C) A toplu yoğunluk fonksiyonu (CDF) eşleştirilmiş noktalar her çifti ile unpaired bir noktaya en yakın komşu arasındaki mesafe arasındaki mesafe. Bir floresan kanaldaki her algılanan spot için en yakın algılanan nokta tanımlamak için “k en yakın komşu” algoritması uygulandığı — ve bu noktaya kadar olan mesafeyi — tamamlayıcı kanaldaki. En yakın komşu karşılıklı yerelleştirmeler eşlenmiş olması kabul edildi ve yeni bir liste eşleştirilmiş, salt CF590 ve sadece Q670 tespitlerde kayıt oluşturuldu. Tespitlerde her kategori için bir CDF çubuk grafik mesafelerin Matlab, doğru şekilde eşleştirilmiş noktalar gerçekten mesafe olmayanlar karşılık gelen bir diğer kanalda spot daha çok daha yakın olduğunu teyit çizildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: Toplam RNA bir fonksiyonu olarak eşleştirilmiş ve unpaired noktalar kesirler sayı hücre başına. Algılama ve smFISH lekeler eşleştirme önyargılı Eğer farklı ifade düzeylerinde test etmek için tek tek hücreleri toplam RNA ifade tarafından gruplandırılmış. Eşleştirilmiş, salt CF590 ve sadece Q670 tespitlerde kaba kesirler hücrelerinin her grup için hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: Kalite değerlendirmesi NDC80luti için tasarlanmış probları kullanılarak oluşturulan smFISH veri ve NDC80ORF mRNA’ların. NDC80luti arasında paylaşılan ortak bölgesine (yeşil renkle gösterilmiştir) Q 670 probları melezlemek ve NDC80ORF mRNA’ların, benzersiz 5′ bölgesinin NDC80luti için (magenta içinde gösterilmiştir) CF 590 probları melezlemek ise . (A) NDC80luti görüntülerini temsilcisi smFISH ve NDC80ORF segregasyonun profaz içinde alınan küçük suboptimal koşullara karşı en iyi duruma getirilmiş. Suşları UB8144 (koşulu getirilmiş) ve UB1337 (suboptimal koşul) mayoz geçmesi indüklenen ve segregasyonun profaz sırasında sabit. Bu iki suş mayoz ikna etmek için farklı senkronizasyon sistemleri liman, ama her iki sistemi smFISH kalite (veri gösterilmez) etkilemez. Suboptimal durumda hücre zymolyase ile desteklenmiş ve VRC daha düşük bir konsantrasyon içinde melezleşmiştir VRC olmadan sindirmek için 20 dk (hiçbir gecede fiksasyon), oda sıcaklığında tespit edildi. Görüntüleri z-yığınlar maksimum yoğunluk projeksiyon gösterilir. DNA (mavi renkle gösterilmiştir) DAPI ile lekeli. Ölçek çubuğu: 5 µm. sinyal-gürültü oranı (SNR) ve görüş alanı tespit sinyal her smFISH spot olarak görüntüleme (B) Scatterplots sunulan 4A rakam, floresan her iki kanalı için hem de en iyi duruma getirilmiş veya suboptimal koşulları için. En iyi duruma getirilmiş durumda iki popülasyonun smFISH noktalar vardı. Gerçek smFISH noktalar arka plan sinyalini ayıran gri alanı içinde yerleşmişti. Suboptimal durumda bireysel mRNA’ların gözle ayırt etmek zor ve nokta algılama yazılımını çalıştırdıktan sonra gerçek noktalar ile arka plan arasındaki mesafeyi daha az belirgin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5: İfade NDC80luti ve NDC80ORF transkript geçici kontrol. (A) NDC80luti görüntülerini temsilcisi smFISH ve NDC80ORF bitkisel büyüme ve mayoz sırasında. Hücreler (UB8144) besin zengin ortam katlanarak büyürken bitkisel örnekleri alınmıştır. Segregasyonun profaz örnekleri 6 saat sonra hücreler (UB8144) sporulation orta olarak ne zaman bu hücreler segregasyonun profaz tutuklandı bir zaman transfer edildi alınmıştır. NDC80luti arasında paylaşılan ortak bölgesine (yeşil renkle gösterilmiştir) Q 670 probları melezlemek ve NDC80ORF mRNA’ların, benzersiz 5′ bölgesinin NDC80 için(magenta içinde gösterilmiştir) CF 590 probları melezlemek ise luti . DNA (mavi renkle gösterilmiştir) DAPI ile lekeli. Her hücre kendi Zip1-GFP sinyal, kalem segregasyonun profaz için sahnelendi. Bizim smFISH Protokolü güçlü GFP sinyal daha fazla değişiklik yapmadan korur. Bitkisel büyüme: Zip1-GFP negatif. Segregasyonun profaz: Zip1-GFP pozitif. Görüntüleri z-yığınlar maksimum yoğunluk projeksiyon gösterilir. Ölçek çubuğu: 5 mikron. Bu rakam Chen ve ark. Şekil 2C değiştirilir 16. (B) NDC80ORF, NDC80lutive Ndc80 protein (Ndc80p) seviyesini mayoz (UB4074) sırasında. NDC80luti ve NDC80ORF düzeyleri tarafından Kuzey leke tespit ve Ndc80p düzeyi tarafından belirtilen süre noktalarda anti-V5 immunoblot kararlıydım. Hxk1p, denetim immunoblot için yükleniyor. UB8144 zorlanma gibi aynı zamanda bu zorlanma limanlar pGAL-NDT80 GAL4-ER eşitleme sistemi19,20. Hücreleri sporulation orta olarak 0 saatte aktarılıp pachytene krizinden β-estradiol ek 6 saat sonra serbest bırakılır. NDC80luti transkript sağlam S/segregasyonun profaz içinde Oysa tespit edildi NDC80ORF transkript segregasyonun giriş (0 saat) öncesinde ve sırasında segregasyonun bölümler (7-9 saat) ağırlıklı olarak mevcut. Bu rakam Chen ve ark. Şekil 6J değiştirilir 16 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.  Şekil 6: Bootstrap gösterilen segregasyonun profaz örnekleri için gerçekleştirilen analiz Şekil 5 . Quantified hücrelerin tümünü havuza alınmış ve hücre belirli bir sayısı (n) rastgele 500 kez örnek. Hücre başına eşleştirilmiş ve unpaired mRNA kısmını ortalama ve % 95 güven aralığı hesaplanır. Bu veriler (gömme) n sayısına her seçim için çizildi. Varyans Plato ne demek istiyorsun, hücreleri (n) örneklenmiş bir fonksiyonu olarak bölünmüş örnek varyans komplo tarafından görüntülenmiştir. Ek veri ölçümleri güven geliştirmek değil gösteren büyük ölçüde hangi numarayı hata (~ 60 hücreleri) monoton, aştı toplam sayısı ölçülen hücreleri (437). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 7: miktar gösterilen smFISH veri Şekil 5 , grafiği çıkarılan göreli sıklığı histogramlar NDC80luti bir belirli sayıda hücre olarak ve NDC80ORF transkript üç bağımsız deneylerden havuza alınmış verileri kullanarak hücre başına. Kesikli çizgi NDC80luti ortalama sayısını gösterir ve NDC80ORF transkript hücre başına. En fazla bin yüksekliği aynı tüm çubuk grafikler arasında olduğu kadar her çubuk grafik normalleştirilmiş. Toplam 637 hücre sayısı için bitkisel büyüme ve 437 segregasyonun profaz için analiz edildi. İki uçlu Wilcoxon sırası Sum testi NDC80luti için gerçekleştirilen ve NDC80ORF, sırasıyla, bitkisel ve segregasyonun profaz örnekleri karşılaştırma. Bu rakam Chen ve ark. Şekil 2B değiştirilir 16 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.  Arabellek B (1 L hisse senedi: 1.2 M sorbitol; 0,1 M potasyum fosfat tampon, pH 7.5) 1 x Nükleaz ücretsiz su 500 mL Sorbitol 218.6 g KH2PO4 2.18 g K2HPO4 14.62 g Nükleaz ücretsiz su 1 L son hacim için getirmek * Depolamak, 50 mL aliquots içinde 4 ˚C filtre sterilize sonra Zymolyase 100T (10 mg/mL) * Aliquots-20 ˚C, mağaza 1 ml MilliQ su 10 mg zymolyase toz geçiyoruz E. coli tRNA (10 mg/mL) * Aliquots-20 ˚C, mağaza 1 ml MilliQ su 10 mg tRNA toz geçiyoruz % 70 etanol (50 mL) 1 x (mL) Saf etanol 35 Nükleaz ücretsiz su 15 * Mağaza oda sıcaklığında Hibridizasyon arabellek (10 mL) 1 x (mL) % 50 dextran sülfat 2 E. coli tRNA (10 mg/mL) 1 200 mM Vanadyl ribonucleoside karmaşık (VRC) 0,1 BSA, 50 mg/mL 0,04 20 x SSC 1 Formamide 1 Nükleaz ücretsiz su 4,86 * 250-µL veya 500 µL aliquots-20 ˚C, mağaza % 10 formamide yıkama arabellek (10 mL) 1 x (mL) Formamide Oda sıcaklığında 1 20 x SSC 1 Nükleaz ücretsiz su 8 * taze, 20-30’lu için girdap mix yapmak % 10 glikoz çözüm * Depolamak, aliquots içinde 4 ˚C filtre sterilize sonra 1 g glikoz 10 mL su nükleaz ücretsiz olarak dağıtılması Glikoz oksidaz * Aliquots-20 ˚C, mağaza 3.7 mg glikoz oksidaz 50 mM NaOAc, pH 5 1 ml dağıtılması Anti-çamaşır suyu (GLOX) arabellek, enzimler (1 mL) olmadan 1 x (µL) % 10 glikoz nükleaz ücretsiz su 40 1 M Tris, pH 8.0 10 20 x SSC 100 Nükleaz ücretsiz su 850 * taze olun, de aliquots, 4 ˚C saklayabilirsiniz Enzimler (50 µL) ile Anti-çamaşır suyu (GLOX) tampon 1 x (µL) Katalaz (girdap hafif, belli oldu kolayca) 0,5 Glikoz oksidaz 0,5 100 mM (etanol içinde çözünmüş) Trolox 1 GLOX arabellek 50 * taze her zaman olun, buz üzerinde hazırlamak, 4 ˚C 2-3 saat boyunca saklanabilir Tablo 1. Arabellekleri ve medya