Hybridation In Situ de Fluorescence de la molécule unique (smFISH) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose

Pour évaluer la façon dont le protocole smFISH travaillé (indiqué dans la Figure 1), nous avons conçu un ensemble de 54 sondes que la trame de lecture ouverte du gène NDC80 de tuiles (Figure 2 a, haut). La sonde placée à l’extrémité 5′ le plus est dénommée Probe 1 ; celle qui suit, sonde 2 ; et la troisième, sonde 3, etc.. Les 27 sondes assignés un impair nombre (sonde 1, 3, 5…) sont tous conjugués à la teinture fluorescente CAL Fluor 590 (CF590) ; et les 27 sondes assigné un nombre pair (2 de Probe, 4, 6…), conjugué à la teinture fluorescente Quasar 670 (Q670). Par conséquent, ces ensembles de sondes alternatif sont souvent dénommés « impair/pair » sondes. Après hybridation, les deux ensembles de sonde doivent étiqueter la même transcription. Après détection spot, nous avons utilisé quelques mesures pour juger de la qualité de l’ensemble de données smFISH. Le premier était le degré et la qualité de colocalisation des sondes impair/pair. Dans notre cas, 88 % de tous les endroits smFISH épididymaire (Figure 2 a et 2 b), avec plus de 95 % des taches jumelés au sein de 2 pixels de l’autre (Figure 2, appariés), qui se trouve à la valeur attendue compte tenue de tout chromatique et détection aberration entre les deux canaux fluorescents. Par comparaison, moins de 10 % des taches non appariés a une distance plus proche voisin de moins de 2 pixels, montrant qu’il est peu probable d’identifie par erreur une paire spot (Figure 2). Les 12 % de taches non appariés ont été également réparties entre les deux canaux (Figure 2 b, comparez CF590 uniquement avec Q670 uniquement) ; et ainsi, nous avons conclu que pour ce gène 2,4 Ko avec un éventail d’expression entre zéro à 45 transcriptions par cellule, ~ 94 % des molécules d’ARN ont été correctement détectés dans chaque canal fluorescent. Si le protocole de smFISH ont été sous-optimal, on observerait (1) une plus grande fraction des taches smFISH avec un seul des deux signaux fluorescents (non-épididymaire), et/ou des cellules (2) avec un rapport signal-bruit très faible ou aucun signal du tout. Nous avons ensuite demandé si la détection du signal smFISH faisait preuve de partialité en ce qui concerne le nombre total de molécules d’ARN par cellule. Dans une population, le nombre total d’un ARN particulière dans chaque cellule se trouve dans une distribution, avec certaines cellules contenant des molécules d’ARN plus que d’autres. Un protocole de bonne smFISH devrait détecter robuste de l’ARN sans se soucier si un nombre élevé ou faible nombre de molécules d’ARN est présent dans chaque cellule. Pour le vérifier, pour chaque cellule, nous avons calculé la fraction des taches smFISH avec signaux épididymaire et la fraction avec un seul des deux signaux fluorescents. Après un regroupement des cellules ayant le même nombre de points totales par cellule, nous avons calculé la fraction moyenne d’épididymaire (jumelé) ou des taches (CF590 seule ou Q670 uniquement) non logées dans un groupe donné et représentées graphiquement cette moyenne en fonction du nombre total de spots par cellule (Figure 3). Pour chaque catégorie de taches, les fractions étaient similaires sur l’ensemble du nombre total de places par cellule. Par exemple, en comparant les cellules avec un total de 20 taches fluorescentes par cellule par rapport à ceux avec un total de 30 points, les fractions moyennes des taches colocalized étaient semblables. Ce résultat suggère que notre protocole pourrait détecter des molécules d’une gamme d’ARN dans une cellule (jusqu’à au moins environ 40 molécules par cellule). Si le protocole a travaillé sous-optimal, on peut observer un biais. Par exemple, la fraction des spots avec un seul des deux signaux fluorescents pourrait augmenter le nombre total de places par cellulaire a augmenté. En utilisant ce protocole optimisé, nous avons examiné l’expression du gène NDC80 qui code pour une protéine du kinétochore, dans différentes conditions de croissance. Le gène NDC80 exprime deux isoformes d’ARNm : l’isoforme longue ayant de transcription, NDC80luti, possède une extension de ~ 400 paires de bases à l’extrémité 5′ par rapport à court NDC80ORF isoforme, mais les deux transcriptions partagent la région codante du gène NDC80 (voir le schéma de la Figure 4 a). Nous avons conçu deux séries de sondes : The CF 590 ensemble se lie à la région 5′ unique de NDC80luti; et l’ensemble de 670 Q se lie à la région commune de NDC80luti et NDC80ORF. Les transcriptions NDC80luti ont été détectées comme les taches de smFISH où les signaux émis par les deux sondes ensembles épididymaire, tandis que le NDC80ORF transcriptions étaient ceux avec le signal qu’à partir de 670 Q. En raison de la taille du segment unique de NDC80luti, nous pourrions seulement tuile 20 sondes oligonucléotidiques le long de cette région, qui est moins que les sondes recommandées de 30 à 48. Ainsi, nous avons d’abord déterminé si cet ensemble sonde robuste pouvait détecter l’ARN dans notre protocole optimisé. Pour chaque canal fluorescent, nous représenté graphiquement le rapport signal sur bruit (SNR, défini comme l’écart des pixels entourant une place par rapport à l’intensité du spot) contre le signal détecté pour chaque place de smFISH et généré un nuage de points pour tous les spots identifié dans le champ de vision complet (images d’exemple Figure 4 a) et des parcelles dans la Figure 4 b. Deux populations distinctes ont été clairement identifiées pour les deux le 670 Q et la sonde CF 590 définit (optimisé, Figure 4 b), ce qui suggère que les taches de smFISH vrai (à l’intérieur de la zone grise) peuvent être séparées de la signal de fond. Notez que, dans l’État sous-optimal, cette séparation était moins évidente (Suboptimal, Figure 4 b). Nous avons utilisé ces ensembles de deux sondes pour étudier l’expression des NDC80luti et NDC80ORFpendant la croissance végétative et la méiose. Dans les cellules végétatives, signal robuste de l’ensemble de sonde 670 Q a été détecté, mais pas de la CF 590 sonde (Figure 5 a, végétatif), souscrivant à l’observation par northern Blot qui seulement l’isoforme court a été exprimée au cours de la croissance végétative16 . Ce résultat suggère aussi que le jeu de sondes CF 590 est spécifique, rendement faible bruit de fond dans notre protocole optimisé smFISH. En revanche, un signal robuste de deux ensembles de sonde a été détecté dans la prophase méiotique et la majorité des taches avait épididymaire signal (Figure 5 a, la prophase méiotique). Ainsi qu’analyse par northern blot (Figure 5 b), cette observation confirme que l’isoforme longue NDC80luti était exprimée spécifiquement lors de la méiose. Ces deux types d’ARNm ont été détectés dans le cytoplasme (à l’extérieur de la région DAPI), ce qui suggère que les deux ont été exportés du noyau, compatible avec le ribosome de profilage des données18. Pour déterminer si des données suffisantes ont été recueillies pour précisément de tenir compte de la variation biologique intrinsèque à notre ensemble de données, nous avons effectué l’analyse « bootstrap » en utilisant les statistiques de chaque cellule, qui comprenait (1) la fraction des taches colocalized par cellule et (2) la fraction des spots avec un des deux signaux fluorescents (CF 590 seulement et 670 Q seulement). Dans cette analyse, un programme choisis au hasard une seule cellule dans les 437 cellules quantifiés pour 500 itérations. Ensuite, la moyenne et la variance des statistiques respectifs liés à ces 500 cellules sélectionnées ont été calculés. Ce processus a ensuite été répété pour sélectionner au hasard des deux cellules de toutes les cellules, sans remplacement ; et puis pour sélectionner au hasard trois cellules, etc.. jusqu’à ce qu’un moitié de la taille de l’ensemble de données total a été atteint. La variance dans le jeu de données atteint un plateau après ~ 40 cellules, ce qui suggère que, après ce point la plupart de la variation de la moyenne est inhérente à des données, et non un artefact de sous-échantillonnage (Figure 6, encart). Cet effet devenue plus évident quand nous avons représenté graphiquement la variance de l’échantillon divisée par la moyenne de l’échantillon, en fonction du nombre de cellules prélevés dans chaque cycle d’itération (Figure 6). Avec les données présentées, le changement de variance devenue diminishingly petit après ~ 60 cellules. Le nombre de cellules quantifié dans une expérience smFISH doit dépasser le nombre minimal de cellules nécessaires pour atteindre une moyenne stable et un plateau de la variance. Dans notre cas, nous avons mesuré plus de 95 cellules par exemple, par réplicat. Le nombre total de cellules (> 400) a bien dépassé le nombre minimal de cellules (~ 60) nécessaire pour tenir compte de la moyenne de la population. Avec une sur mesure Matlab programme16, cellules végétatives ont eu une durée médiane de 5 NDC80ORF transcriptions par cellule, tandis que dans les cellules de la prophase méiotique, la médiane significativement chuté à 4 transcriptions par cellule (Wilcoxon bilatéral Test de somme de Rank, p = 0,026) (Figure 7). Le nombre médian de NDC80luti transcrits par cellule était 21 transcriptions, et 100 % des cellules a exprimé les transcriptions NDC80luti . Nous avons représenté graphiquement la fraction des cellules avec un nombre donné de transcriptions sous forme d’histogramme par étapes, la relative fréquence parce que le nombre de molécules d’ARNm est une quantité discrète. Le plus grand bac de chaque histogramme a été normalisé à la même hauteur. Figure 1 : diagramme pour le protocole de smFISH. Cellules sont fixées avec le formaldéhyde à température ambiante pendant 20 min ou à 4 ° c du jour au lendemain, pour des échantillons de la croissance végétative et méiotique, respectivement. Après un lavage en tampon B trois fois, les cellules sont digérés par zymolyase jusqu’à ce qu’environ 70 % – 90 % des cellules sont digérés. Les échantillons digérés sont ensuite lavées une fois avec le tampon B d’enlever le zymolyase et perméabilisées par la suite dans 70 % d’éthanol (EtOH) pendant ~3.5 heures. Pour parer à l’hybridation, les échantillons sont incubés tout d’abord dans le tampon de lavage de formamide de 10 % (FWB) pendant environ 20 min. Ensuite, les échantillons sont remis en suspension dans environ 50 µL de Solution d’hybridation, qui contient les sondes fluorescentes, pour une nuit d’incubation à 30 ° c dans l’obscurité. Après hybridation, les échantillons sont incubés dans FWB 10 % pendant 30 min pour évacuer l’excès sondes et ensuite incubés dans 10 % FWB avec 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) sur la tache de l’ADN. Pour l’exemple imagé immédiatement après l’incubation FWB/DAPI, l’échantillon est remis en suspension dans le tampon GLOX additionné de catalase, Trolox et glucose oxydase (GLOX + enz) ; considérant que, les autres échantillons sont remis en suspension dans le tampon GLOX sans enzymes et stockés à 4 ° c jusqu’à environ 3 heures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : évaluation de la qualité de smFISH à l’aide de sondes impair/pair. (A) haut : Schéma pour les ensembles de sonde impair/pair. Cinquante-quatre sondes carrelage le gène de NDC80 ont été conçus. Les sondes impaires sont marquées avec un fluorophore (CF590, montré en magenta) et les sondes de paires, avec un autre fluorophore (Q670, en vert). En bas : Images représentant smFISH des cellules de la prophase méiotique acquis en utilisant les ensembles de sonde impair/pair. Échantillons ont été prélevés à 6 heures après que les cellules (UB8144) ont été transférés au milieu de sporulation, un temps où ces cellules ont été arrêtés à la prophase méiotique. L’ADN a été coloré au DAPI (représentée en bleu). Images apparaissent comme les projections de l’intensité maximale de z-cheminées. Barre d’échelle : 5 µm. (B) pourcentage des taches de même couleur ou non appariés smFISH obtenus en utilisant les ensembles de sonde impair/pair. Un total de 428 prophase méiotique cellules ont été analysées, mise en commun de deux expériences indépendantes. Ce chiffre est modifié par rapport à la Figure 2-supplément figure 4 de Chen et al. 16 (C) A cumulé densité fonction (CDF) de la distance entre chaque paire de taches appariés et la distance entre le voisin le plus proche d’un endroit non apparié. Pour chaque place détecté dans un canal fluorescent, l’algorithme « k plus proches voisins » a été appliqué pour identifier le spot détecté plus proche — et la distance que vous souhaitez survoler — dans le canal complémentaire. Localisations qui étaient mutuelles la plus proche voisins étaient réputées être couplé, et une nouvelle liste a été générée en enregistrant les détections appariées, CF590 seule et Q670-uniquement. Pour chaque catégorie de détections, un histogramme de la CDF des distances a été tracé en Matlab, confirmant que correctement appariées spots en effet ont été beaucoup plus proches en distance que celles sans un correspondant à l’autre canal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : nombre de Fractions de spots appariées et non appariées, en fonction de l’ARN total par cellule. Pour tester si la détection et l’appariement des taches smFISH était partiale aux niveaux d’expression différents, les cellules individuelles ont été regroupés par la totale expression de RNA. Les fractions moyennes des détections appariées, CF590 seule et Q670-seule ont été calculées pour chaque groupe de cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Évaluation de la qualité des données générées en utilisant les sondes conçues pour NDC80luti smFISH et NDC80ORF mRNA. Les sondes de 670 Q (indiqués en vert) s’hybrident à la région commune partagée entre NDC80luti et NDC80ORF mRNA, alors que les sondes CF 590 (montrés en magenta) s’hybrider à la région unique de 5′ de NDC80luti . (A) smFISH représentant des images de NDC80luti et NDC80ORF en prophase méiotique, acquis moins optimisé par rapport aux conditions suboptimales. Souches UB8144 (optimisé condition) et UB1337 (État sous-optimal) ont été amenées à subir la méiose et fixés au cours de la prophase méiotique. Ces deux souches hébergent les systèmes de synchronisation différents pour induire la méiose, mais l’utilisation d’un système n’affecte pas la qualité de smFISH (données non présentées). En l’État sous-optimal, les cellules ont été fixées à température ambiante pendant 20 min (aucune fixation au jour le jour), digérée avec zymolyase sans VRC complétée et hybridé dans une plus faible concentration de VRC. Images apparaissent comme les projections de l’intensité maximale de z-cheminées. L’ADN a été coloré au DAPI (représentée en bleu). Barre d’échelle : 5 µm. les diagrammes de dispersion (B) afficher le rapport signal sur bruit (SNR) et le signal de chaque spot smFISH détecté dans le champ de vision présenté dans la Figure 4 a, canal fluorescent, ainsi que les conditions optimisées ou sous-optimale. En l’état optimisé, deux populations des taches smFISH étaient présentes. Les taches de véritable smFISH sont trouvaient à l’intérieur de la zone grise, sépare le signal de fond. En l’État sous-optimal, différents mRNAs étaient difficiles à distinguer à le œil, et la séparation entre le vrais taches et le fond après avoir exécuté le logiciel de détection spot était moins évidente. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Expression de NDC80luti et NDC80ORF transcriptions sont contrôlées dans le temps. (A) smFISH représentant des images de NDC80luti et NDC80ORF pendant la croissance végétative et la méiose. Végétatives échantillons ont été prélevés lorsque des cellules (UB8144) ont été en croissance exponentielle dans un milieu riche en nutriments. La prophase méiotique échantillons ont été prélevés les 6heures après que cellules (UB8144) ont été transférés au milieu de sporulation, un temps où ces cellules ont été arrêtés à la prophase méiotique. Les sondes de 670 Q (indiqués en vert) s’hybrident à la région commune partagée entre NDC80luti et NDC80ORF mRNA, alors que les sondes CF 590 (montrés en magenta) s’hybrident à l’unique région 5′ du NDC80luti . L’ADN a été coloré au DAPI (représentée en bleu). Chaque cellule a été mis en scène par son signal Zip1-GFP, un marqueur de la prophase méiotique. Notre protocole de smFISH conserve le signal fort de GFP sans modification supplémentaire. La croissance végétative : négatif Zip1-GFP. La prophase méiotique : positif Zip1-GFP. Images apparaissent comme les projections de l’intensité maximale de z-cheminées. Barre d’échelle : 5 µm. Ce chiffre est modifié par rapport à la Figure 2 de Chen et al. 16. (B) NDC80ORF, NDC80lutiet Ndc80 la teneur en protéines (Ndc80p) au cours de la méiose (UB4074). NDC80luti et NDC80ORF niveaux ont été déterminés par northern blot et Ndc80p niveau a été déterminé par immunoblot anti-V5 sur les points de l’heure indiquée. Hxk1p, contrôle d’immunoblot de chargement. Comme la souche UB8144, cette souche héberge également le pGAL-NDT80 GAL4-ER synchronisation système19,20. Les cellules ont été transférés au milieu de sporulation à 0 heure et libérés d’arrestation pachytène par addition de β-estradiol 6 heures plus tard. La transcription NDC80luti détecta robuste en prophase méiotique/S, tandis que le NDC80ORF transcriptions était principalement présent avant son entrée méiotique (0 heure) et au cours des divisions méiotiques (7-9 heures). Ce chiffre est modifié par rapport à la Figure 6J de Chen et al. 16 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.  Figure 6 : Bootstrap analyse effectuée pour les échantillons de la prophase méiotique montrés Figure 5 . Toutes les cellules chiffrés ont été regroupées, et un nombre donné (n) des cellules ont été choisis au hasard de 500 fois. La moyenne et l’intervalle de confiance à 95 % ont été calculés pour la fraction de l’ARNm appariées et non appariées par cellule. Ces données ont été tracées pour chaque choix du nombre n (en médaillon). Le plateau de variance a été visualisé en traçant la variance de l’échantillon divisée par la moyenne, en fonction du nombre de cellules (n) échantillonné. Le nombre total de cellules mesurées (437) dépassé largement le nombre au cours de laquelle l’erreur atteint un plateau (~ 60 cellules), ce qui indique que des données supplémentaires n’améliorerait pas la confiance dans les mesures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Quantification des données smFISH montrées Figure 5 , graphiques comme les histogrammes de fréquence relative des cellules avec un nombre donné de NDC80luti et NDC80ORF transcriptions par cellule, en utilisant les données regroupées à partir de trois expériences indépendantes. La ligne pointillée indique le nombre médian de NDC80luti et NDC80ORF transcriptions par cellule. Chaque histogramme a été normalisée afin que la hauteur maximale bin était le même dans toutes les histogrammes. Un nombre total de 637 cellules ont été analysé pour la croissance végétative et 437 de la prophase méiotique. Test de Wilcoxon somme de Rank bilatéral a été réalisée pour NDC80luti et NDC80ORF, respectivement, en comparant des échantillons de la prophase méiotique et végétatifs. Ce chiffre est modifié de la Figure 2D de Chen et al. 16 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.  Mémoire tampon B (stock 1 L : 1,2 M sorbitol ; tampon de phosphate de potassium 0,1 M, pH 7,5) 1 x Eau exempte de nucléase 500 mL Sorbitol 218,6 g KH2PO4 2,18 g K2HPO4 14,62 g Eau exempte de nucléase Porter au volume final de 1 L * Conserver à 4 ° c en aliquotes 50 mL après filtre stérilisant Zymolyase 100 t (10 mg/mL) * Conserver à-20 ° c en aliquotes Dissoudre la poudre de zymolyase de 10 mg dans 1 mL d’eau MilliQ E. coli ARNt (10 mg/mL) * Conserver à-20 ° c en aliquotes Dissoudre la poudre tRNA 10 mg dans 1 mL d’eau MilliQ éthanol à 70 % (50 mL) 1 x (mL) Éthanol pur 35 Eau exempte de nucléase 15 * Stocker à température ambiante Tampon d’hybridation (10 mL) 1 x (mL) Sulfate de dextran 50 % 2 E. coli ARNt (10 mg/mL) 1 200 mM vanadyle ribonucléosides complexes (VRC) 0,1 BSA, 50 mg/mL 0,04 20 x SSC 1 Formamide 1 Eau exempte de nucléase 4.86 * Conserver à-20 ° c en aliquotes 250 µL ou 500 µL tampon de lavage 10 % formamide (10 mL) 1 x (mL) Formamide à température ambiante 1 20 x SSC 1 Eau exempte de nucléase 8 * faire frais, vortex pendant 20-30 secondes pour mélanger solution de glucose 10 % * Conserver à 4 ° c en aliquotes après filtre stérilisant Dissoudre 1 g de glucose dans 10 mL d’eau exempte de nucléase Glucose oxydase * Conserver à-20 ° c en aliquotes Dissoudre la glucose-oxydase 3,7 mg dans 1 mL de 50 mM NaOAc, pH 5 Tampon anti-eau de Javel (GLOX), sans enzymes (1 mL) 1 x (µL) 10 % de glucose dans de l’eau exempte de nucléase 40 1 M Tris, pH 8,0 10 20 x SSC 100 Eau exempte de nucléase 850 * faire frais, peut également stocker des aliquotes à 4 ° c Tampon anti-eau de Javel (GLOX), avec des enzymes (50 µL) 1 x (µL) Catalase (vortex légèrement, il s’installe facilement) 0,5 Glucose oxydase 0,5 100 mM Trolox (dissous dans l’éthanol) 1 Tampon GLOX 50 * faire frais chaque fois, préparer sur glace, peuvent être stockés à 4 ° c pendant 2-3 heures Le tableau 1. Tampons et medias