Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

Para evaluar qué tan bien el protocolo de smFISH trabajado (se describe en figura 1), hemos diseñado un conjunto de 54 sondas que el marco de lectura abierta del gen NDC80 del azulejo (figura 2A, parte superior). La sonda situada en el más extremo 5′ se conoce como punta de prueba 1; el otro, Probe 2; y la tercera, sondeo 3, etcetera. Las 27 sondas asignan un impar número (sonda 1, 3, 5…) se conjugan para el tinte fluorescente CAL Fluor 590 (CF590); y las 27 sondas asignan un número par (sondeo 2, 4, 6…), conjugado con el tinte fluorescente Quasar 670 (Q670). Por lo tanto, estos conjuntos de prueba alterna se refieren a menudo como sondas “impar”. Sobre hibridación, ambos conjuntos de sonda deben etiquetar la transcripción del mismo. Después de la detección del punto, utilizamos algunas medidas para juzgar la calidad de los datos smFISH. El primero fue el grado y la calidad de la colocalización de los sondeos/impar. En nuestro caso, el 88% de todos los puntos de smFISH colocalized (figura 2A y 2B), con más del 95% de los puntos emparejados dentro de 2 pixeles entre sí (figura 2, emparejados), que está dentro del valor esperado dado cualquier cromático y detección aberración entre los dos canales fluorescentes. En comparación, menos del 10% de puntos impares tenía una distancia más cercano vecino de menos de 2 píxeles, mostrando que la probabilidad de misidentifying un par de puntos es baja (figura 2). El 12% de los puntos fueron dividido uniformemente entre los dos canales (figura 2B, compare CF590 sólo con sólo Q670); y así, llegamos a la conclusión que para este gen de 2,4 kb con una gama de expresión entre cero a 45 transcripciones por la célula, ~ 94% de las moléculas de ARN fueron detectado con exactitud en cada canal fluorescente. Si el protocolo de smFISH era subóptimo, una observaría (1) una fracción mayor de los smFISH puntos con una sola de las dos señales fluorescentes (no colocalized), o (2) células con una relación señal / ruido muy baja o ninguna señal en absoluto. A continuación nos pide si la detección de la señal de smFISH era parcial con respecto al número total de moléculas de ARN por la célula. En una población, el número total de un determinado RNA en cada célula se encuentra en una distribución, con algunas células que más moléculas de ARN que otros. Un protocolo de smFISH buena contundencia debería detectar el RNA independientemente si un número alto o bajo número de moléculas de ARN está presente en cada célula. Para probar esto, para cada celda, se calculó la fracción de los puntos de smFISH con señales colocalized y la fracción con una sola de las dos señales fluorescentes. Después de agrupar las células que tenían el mismo número de puntos totales por celda, se calculó la fracción promedio de colocalized (emparejados) o puntos (sólo para CF590 o solo Q670) no colocalized en un grupo dado y graficó este promedio en función del número total de puntos por la célula (figura 3). Para cada categoría de puntos, las fracciones fueron similares en toda la gama del número total de puntos por la célula. Por ejemplo, comparando las células con un total de 20 puntos fluorescentes por celular versus aquellos con un total de 30 puntos, el promedio fracciones de puntos colocalized fueron similares. Este resultado sugiere que nuestro protocolo podría detectar las moléculas de una gama de ARN en una célula (hasta por lo menos 40 moléculas por célula). Si el protocolo de trabajo subóptimo, se puede observar un sesgo. Por ejemplo, puede aumentar la fracción de los puntos con una sola de las dos señales fluorescentes como el número total de puntos por la célula mayor. Usando este protocolo optimizado, examinamos la expresión del gene de NDC80 , que codifica una proteína del cinetocoro, en diferentes condiciones de crecimiento. El gen de NDC80 expresa dos isoformas mRNA: la isoforma larga dececonocida transcripción, NDC80luti, tiene una extensión de ~ 400 pares de bases en el extremo 5′ en comparación con el corto NDC80ORF isoforma, pero ambas transcripciones compartan la región codificante del gen NDC80 (véase esquema en Figura 4A). Hemos diseñado dos tipos de sondas: 590 CF el conjunto se une a la única 5′ región de NDC80luti; y el conjunto de 670 Q se une a la región común de NDC80luti y NDC80ORF. Las transcripciones de NDC80luti fueron detectadas como los lugares smFISH donde las señales de ambos probe juegos colocalized, mientras que el NDC80ORF transcripciones fueron aquellos con la señal de Q 670. Debido al tamaño del segmento único de NDC80luti, sólo podríamos azulejo 20 sondas de oligonucleótidos a lo largo de esta región, que es menor que la recomendada puntas de prueba de 30 a 48. Así, determinamos primero si este conjunto de sonda robusta podría detectar RNA en nuestro protocolo optimizado. Para cualquier canal fluorescente, graficar la relación señal a ruido (SNR, definido como la variación de los píxeles que rodean un punto en relación con la intensidad de la mancha) contra la señal detectada por cada punto de smFISH y genera un diagrama de dispersión para todas las manchas identificado en el campo de visión entero (imágenes de ejemplo en la Figura 4A ) y de la parcelas en la Figura 4B. Claramente se identificaron dos poblaciones distintas para ambos el 670 de Q y la sonda CF 590 establece (optimizado, Figura 4B), lo que sugiere que los puntos de verdadera smFISH (dentro de la zona gris) se podrían separar de la señal de fondo. Tenga en cuenta que en la condición subóptima, dicha separación fue menos evidente (Suboptimal, Figura 4B). Utilizamos estos sistemas dos sonda para estudiar la expresión de NDC80luti y NDC80ORFdurante el crecimiento vegetativo y la meiosis. En células vegetativas, se detectó señal robusta desde el 670 Q probe, pero no de la CF 590 sonda establecido (figura 5A, vegetativo), de acuerdo con la observación por borrar norteño que sólo la isoforma corta fue expresada durante el crecimiento vegetativo16 . Este resultado también sugiere que el conjunto de sonda CF 590 es específico, rendimiento bajo fondo en nuestro protocolo optimizado de la smFISH. Por el contrario, sólida señal de ambos conjuntos de sonda fue detectado en profase meiótica y la mayoría de los lugares había colocalized señal (figura 5A, profase meiótica). Análisis de la mancha blanca /negra norteña (figura 5B), esta observación confirmó que la isoforma larga NDC80luti fue expresada específicamente en la meiosis. Estos dos tipos de mRNAs se detectaron en el citoplasma (fuera de la región DAPI), sugiriendo que ambos fueron exportados desde el núcleo, consistente con el ribosome profiling datos18. Para determinar si obtuvieron los datos suficientes para tener en cuenta con exactitud la variación biológica intrínseca a nuestro conjunto de datos, realizamos el análisis bootstrap utilizando las estadísticas de cada célula, que incluye (1) la fracción de los lugares colocalized por célula y (2) la fracción de los lugares con una de las dos señales fluorescentes (CF 590 solamente y Q 670 solamente). En este análisis, un programa seleccionadas al azar a una célula de las células cuantificadas 437 500 iteraciones. A continuación, se calculan la media y la varianza de las estadísticas respectivas asociadas a estas 500 celdas seleccionadas. Este proceso entonces fue repetido por seleccionar al azar dos células de todas las células, sin reemplazo; y luego para la selección al azar de tres células, etcetera. hasta que se llegó a la mitad del tamaño del conjunto total de datos. La varianza del conjunto de datos plateaued después de ~ 40 células, lo que sugiere que después de este punto la mayoría de la variación en la media es intrínseca a los datos en lugar de un artefacto de undersampling (figura 6, de la inserción). Este efecto se hizo más evidente cuando graficó la variación de la muestra dividida por la media muestral, en función del número de células en cada ciclo de iteración (figura 6). Con los datos mostrados, el cambio en la varianza se convirtió cada pequeño después de ~ 60 células. El número de células en un experimento de smFISH debe superar el número mínimo de células necesarias para lograr un medio estable y una meseta de la varianza. En nuestro caso, hemos cuantificado más de 95 células por muestra, por repetición. El número total de células (> 400) bien superado el número mínimo de células (~ 60) necesario para reflejar la media de la población. Con un por encargo Matlab programa16, células vegetativas fueron encontradas para tener una mediana de 5 NDC80ORF transcritos por la célula, mientras que en las células de la profase meiótica, la mediana se redujo significativamente a 4 transcripciones por la célula (Wilcoxon de dos colas Rank Sum test, p = 0.026) (figura 7). La mediana del número de transcripciones de NDC80luti por célula fue 21 transcripciones, y 100% de las células expresan las transcripciones de NDC80luti . Graficó la fracción de las células con un número determinado de expedientes como un histograma de frecuencia relativa, paso a paso porque el número de moléculas de mRNA es una cantidad discreta. La papelera más grande de cada histograma fue normalizada a la misma altura. Figura 1: Organigrama para el protocolo de smFISH. Las células se fijan con formol a temperatura ambiente durante 20 minutos o a 4 ° c durante la noche, para muestras de crecimiento vegetativo y meiótica, respectivamente. Después del lavado en el búfer B tres veces, las células son digeridas por zymolyase hasta ~ 70-90% de las células son digerido. Las muestras digeridas se lavará una vez con Buffer B para quitar el zymolyase y permeabilized posteriormente en 70% de etanol (EtOH) ~3.5 horas. Para prepararse para la hibridación, las muestras se incuban primero en tampón de lavado 10% formamida (FWB) durante 20 minutos. A continuación, las muestras se resuspendió en 50 μl de solución de hibridación, que contiene las sondas fluorescentes, para la incubación durante la noche en la oscuridad a 30 ° c. Después de la hibridación, las muestras se incuban en FWB 10% durante 30 minutos para limpiar las sondas de exceso y luego se incubaron en 10% FWB con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para teñir el ADN. Para la muestra reflejada inmediatamente después de la incubación de FWB/DAPI, la muestra se resuspendió en el búfer GLOX complementado con oxidasa de glucosa, catalasa y Trolox (GLOX + enz); mientras que las otras muestras se resuspendió en el búfer GLOX sin las enzimas y almacenadas a 4 ° c hasta ~ 3 horas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: evaluación de la calidad de smFISH usando puntas de prueba/impar. (A) arriba: Esquema de los sistemas de sondeo/impar. Cincuenta y cuatro sondas de oligonucleótidos embaldosar el gene de NDC80 fueron diseñadas. Las sondas impares fueron etiquetadas con un fluoróforo (CF590, mostrado en magenta) y las sondas de pares, con otro fluoróforo (Q670, mostrado en verde). Abajo: Representante smFISH imágenes de las células de la profase meiótica adquirieron haciendo uso de la sonda/impar. Se tomaron muestras 6 horas después de las células (UB8144) fueron transferidas al medio de esporulación, un tiempo cuando estas células fueron detenidas en la profase meiótica. ADN fue teñido con DAPI (mostrado en azul). Imágenes se muestran como las proyecciones de máxima intensidad de pilas de z. Barra de escala: 5 μm. (B) porcentaje de los puntos de smFISH pares o impares obtenidas haciendo uso de la sonda/impar. Se analizaron un total de 428 células profase meiótica, puesta en común de dos experimentos independientes. Se modifica esta figura figura 2-figura suplemento 4 de Chen et al. 16 (C) un acumulado densidad función (CDF) de la distancia entre cada par de puntos pares y la distancia entre el vecino más cercano de un lugar impar. Para cada punto detectado en un canal de fluorescente, se aplicó el algoritmo “k más cercano vecino” para identificar el lugar más cercano detectado y la distancia a ese lugar, en el canal complementario. Localizaciones que fueron mutuos vecinos más cercanos eran considerados para ser asociado, y se generó una nueva lista de grabación las detecciones apareadas, CF590-y Q670. Para cada categoría de detecciones, un histograma de la CDF de las distancias fue trazado en Matlab, confirmando que puntos correctamente emparejados de hecho estaban más cercanos en distancia que aquellos sin una correspondiente en el otro canal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: número de fracciones de puntos apareados y no apareados, como una función del RNA total por celular. Para comprobar si la detección y vinculación de los puntos de smFISH era parcial a nivel de expresión diferente, las células individuales se agruparon por expresión de RNA total. Las fracciones medias de pares, sólo CF590 y sólo Q670 detecciones se calcularon para cada grupo de células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Evaluación de la calidad de los datos de smFISH generados utilizando las sondas diseñadas para NDC80luti y NDC80ORF mRNAs. Hibridan las sondas Q 670 (mostradas en verde) a la región común compartida entre NDC80luti y NDC80ORF mRNAs, mientras que las sondas de CF 590 (mostradas en magenta) hibridan a la única 5′ región de NDC80luti . (A) imágenes de smFISH representante de NDC80luti y NDC80ORF en profase meiótica, adquirió bajo optimizado frente a condiciones subóptimas. Cepas UB8144 (condición optimizado) y UB1337 (condición óptima) fueron inducidos a experimentar meiosis y fija durante la profase meiótica. Estas dos cepas albergan sistemas de sincronización diferente para inducir la meiosis, pero el uso de cualquier sistema no afecta la calidad de smFISH (datos no mostrados). En la condición óptima, las células se fijaron a temperatura ambiente durante 20 minutos (sin fijación durante la noche), digerida con zymolyase sin VRC suplido y cruzado por hibridación en una menor concentración de VRC. Imágenes se muestran como las proyecciones de máxima intensidad de pilas de z. ADN fue teñido con DAPI (mostrado en azul). Barra de escala: 5 μm. (B) diagramas de dispersión muestran la relación señal a ruido (SNR) y la señal de cada punto de la smFISH detectada en el campo de visión presentaron en la Figura 4A, ningún canal fluorescente, así como las condiciones optimizadas o subóptimas. En la condición optimizada, dos poblaciones de los lugares de smFISH estaban presentes. Los puntos de verdadera smFISH fueron situados dentro de la zona gris, separa la señal de fondo. En la condición subóptima, mRNAs individuales eran difíciles de distinguir por el ojo, y la separación entre los puntos de verdad y el fondo después de ejecutar el software de detección de punto era menos evidente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Expresión de NDC80luti y NDC80ORF transcripciones son controladas temporal. (A) imágenes de smFISH representante de NDC80luti y NDC80ORF durante el crecimiento vegetativo y la meiosis. Se tomaron muestras vegetativas cuando las células (UB8144) fueron creciendo exponencialmente en medio ricos nutrientes. 6 horas después de las células (UB8144) fueron transferidas al medio de esporulación, un tiempo cuando estas células fueron detenidas en la profase meiótica se tomaron muestras de la profase meiótica. Hibridan las sondas Q 670 (mostradas en verde) a la región común compartida entre NDC80luti y NDC80ORF mRNAs, mientras que las sondas de CF 590 (mostradas en magenta) hibridan a la única 5′ región de NDC80luti . ADN fue teñido con DAPI (mostrado en azul). Cada celda fue representada por su señal Zip1-GFP, un marcador de la profase meiótica. Nuestro protocolo de smFISH conserva fuerte señal GFP sin mayor modificación. Crecimiento vegetativo: Zip1-GFP negativo. Profase meiótica: Zip1-GFP positivas. Imágenes se muestran como las proyecciones de máxima intensidad de pilas de z. Barra de escala: 5 μm. Se modifica esta figura 2 Figura de Chen et al. 16. (B) NDC80ORF, NDC80lutiy nivel de proteína (Ndc80p) de Ndc80 durante la meiosis (UB4074). NDC80luti y NDC80ORF niveles fueron determinados por la mancha blanca /negra norteña y Ndc80p nivel se determinó por el immunoblot anti-V5 en los puntos de tiempo indicado. Hxk1p, control de immunoblot de carga. Como UB8144 la tensión, esta tensión también alberga el pGAL NDT80 GAL4-ER sincronización sistema19,20. Células se transfirieron a medio de esporulación en 0 horas y liberadas de detención de paquiteno por la adición de β-estradiol 6 horas más tarde. La transcripción de NDC80luti robusta fue detectada en profase meiótica/S, mientras que el NDC80ORF transcripciones fue predominante presente antes de la entrada meiótica (0 horas) y durante las divisiones meióticas (7-9 horas). Esta cifra se modifica 6J figura de Chen et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  Figura 6: iniciar el análisis realizado para las muestras de la profase meiótica se muestra en la Figura 5 . Todas las células cuantificadas se combinaron, y un número dado (n) de las células se muestrearon al azar 500 veces. Se calcularon la media y el intervalo de confianza del 95% para la fracción de mRNA apareados y no apareados por la célula. Estos datos fueron graficados para cada opción del número n (recuadro). La meseta de varianza fue visualizada mediante el trazado de la varianza de la muestra dividida por el medio, en función del número de células (n) muestreados. El número total de células medido (437) excedido grandemente el número en el cual el error plateaued (~ 60 células), que indica que datos adicionales no mejoraría la confianza en las mediciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: cuantificación de los datos smFISH en Figura 5 , grafican como los histogramas de la frecuencia relativa de las células con un número determinado de NDC80luti y NDC80ORF transcritos por la célula, utilizando los datos de tres experimentos independientes. La línea discontinua indica la mediana del número de NDC80luti y NDC80ORF transcritos por la célula. Cada histograma se normalizó para que la altura máxima bin fue el mismo en todos los histogramas. Un número total de 637 células fueron analizado para el crecimiento vegetativo y 437 de la profase meiótica. Dos colas prueba de Wilcoxon Rank Sum se realizó de NDC80luti y NDC80ORF, respectivamente, comparando muestras de la profase meiótica y vegetativo. Esta cifra se modifica de 2D de la figura de Chen et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  Tampón B (1 L de caldo de: 1,2 M sorbitol; tampón de fosfato de potasio de 0.1 M, pH 7.5) 1 x Agua libre de nucleasas 500 mL Sorbitol 218,6 g KH2PO4 2,18 g K2HPO4 g 14,62 Agua libre de nucleasas Llevar a volumen final de 1 L * Almacenar a 4 ° c en alícuotas de 50 mL después de filtro de esterilización Zymolyase 100T (10 mg/mL) * Almacenar a-20 ° c en alícuotas Disolver el polvo de zymolyase de 10 mg en 1 mL de agua MilliQ E. coli tRNA (10 mg/mL) * Almacenar a-20 ° c en alícuotas Disolver el polvo de tRNA de 10 mg en 1 mL de agua MilliQ etanol al 70% (50 mL) 1 x (mL) Etanol puro 35 Agua libre de nucleasas 15 * Almacenar a temperatura ambiente Tampón de hibridación (10 mL) 1 x (mL) 50% sulfato de dextrán 2 TRNA de e. coli (10 mg/mL) 1 Ribonucleósido de Vanadyl 200 mM complejo (VRC) 0.1 BSA, 50 mg/mL 0.04 20 x SSC 1 Formamida 1 Agua libre de nucleasas 4.86 * Almacenar a-20 ° c en alícuotas de 250 μl o 500 μl tampón de lavado 10% formamida (10 mL) 1 x (mL) Formamida a temperatura ambiente 1 20 x SSC 1 Agua libre de nucleasas 8 * hacer fresco, vortex durante 20-30 s para mezclar solución de glucosa 10% * Almacenar a 4 ° c en alícuotas después de filtro de esterilización Disolver 1 g de glucosa en 10 mL de agua libre de nucleasas Glucosa oxidasa * Almacenar a-20 ° c en alícuotas Disolver la glucosa oxidasa de 3,7 mg en 1 mL de 50 mM NaOAc, pH 5 Anti-Bleach (GLOX) Buffer, sin enzimas (1 mL) 1 x (μL) glucosa 10% en agua libre de nucleasas 40 1 M Tris, pH 8.0 10 20 x SSC 100 Agua libre de nucleasas 850 * hacer fresco, también puede almacenar alícuotas a 4 ° c Anti-Bleach (GLOX) Buffer, con las enzimas (50 μL) 1 x (μL) Catalasa (vortex suavemente, se instala fácilmente) 0.5 Glucosa oxidasa 0.5 100 mM Trolox (disuelto en etanol) 1 Buffer GLOX 50 * hacer fresca cada vez, preparar el hielo, pueden almacenarse a 4 ° c durante 2-3 horas Tabla 1. Buffers y medios de comunicación