Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Para avaliar o quão bem o protocolo smFISH trabalhado (indicado na Figura 1), nós projetamos um conjunto de 54 sondas que o frame de leitura aberto do gene NDC80 de azulejos (Figura 2A, topo). A sonda localizada em mais de 5′ extremidade é referida como sonda 1; a próxima vítima, sonda 2; e a terceira, 3 sonda, etc. As 27 sondas atribuído um ímpar número (sonda 1, 3, 5…) são todos conjugados para o corante fluorescente CAL Fluor 590 (CF590); e as 27 sondas atribuído um número par (sonda 2, 4, 6…), conjugado com o corante fluorescente Quasar 670 (Q670). Portanto, esses conjuntos de sonda alternados são muitas vezes referidos como sondas “ímpar”. Após a hibridização, ambos os conjuntos de sonda devem rotular a transcrição da mesma. Após a detecção local, usamos algumas medidas para julgar a qualidade do conjunto de dados smFISH. O primeiro foi o grau e a qualidade de colocalization para as sondas/ímpar. No nosso caso, 88% de todos os pontos de smFISH colocalized (Figura 2A e 2B), com mais de 95% das manchas pareadas dentro de 2 pixels do outro (Figura 2, emparelhado), que está dentro do valor esperado dado qualquer cromática e deteção aberração entre os dois canais fluorescentes. Em comparação, menos de 10% dos pontos da marcação sem paridade tinha uma vizinho mais próximo de distância de menos de 2 pixels, mostrando que a probabilidade de interpretação um par local é baixa (Figura 2). A 12% dos pontos da marcação sem paridade foram divididos uniformemente entre os dois canais (Figura 2B, comparar somente CF590 com somente Q670); e assim, concluímos que este gene 2,4 kb com uma gama de expressão entre zero a 45 cópias por célula, ~ 94% de moléculas de RNA foram detectadas com precisão em cada canal fluorescente. Se o protocolo de smFISH eram suboptimal, um observar (1) uma fração maior de manchas de smFISH com apenas um dos dois sinais fluorescentes (não-colocalized), e/ou (2) células com uma relação sinal / ruído muito baixa ou nenhum sinal em tudo. Em seguida perguntamos se a deteção do sinal smFISH era inclinada em relação ao número total de moléculas de RNA por célula. Em uma população, o número total de um determinado RNA em cada célula encontra-se em uma distribuição, com algumas células abrigando mais moléculas de RNA do que outros. Um protocolo de boas smFISH robusta deve detectar o RNA independentemente se um número elevado ou baixo número de moléculas de RNA está presente em cada célula. Para testar isso, para cada célula, cálculo da fração de manchas de smFISH com sinais colocalized e a fração com apenas um dos dois sinais fluorescentes. Após o agrupamento das células que tinham o mesmo número de pontos totais por célula, calculamos a fração média de colocalized (combinados) ou não-colocalized (CF590-somente ou Q670) de pontos em um determinado grupo e graficamente esta média em função do número total de manchas por célula (Figura 3). Para cada categoria de pontos, as frações foram semelhantes em toda a gama do número total de pontos por célula. Por exemplo, comparando as células com um total de 20 pontos fluorescentes por célula contra aqueles com um total de 30 pontos, as frações médias dos pontos colocalized foram semelhantes. Este resultado sugere que nosso protocolo poderia detectar moléculas uma gama de RNA em uma célula (até pelo menos 40 ~ moléculas por célula). Se o protocolo funcionou abaixo, um pode observar um viés. Por exemplo, a fração dos pontos com apenas um dos dois sinais fluorescentes pode aumentar como o número total de pontos por célula aumentada. Usando este protocolo otimizado, examinamos a expressão do gene NDC80 , que codifica uma proteína de cinetócoro, em condições diferentes de crescimento. O gene NDC80 expressa duas isoformas de mRNA: O isoform tempo undecoded transcrição, NDC80luti, tem uma extensão de ~ 400 pares de bases na extremidade 5′ em comparação com o curta NDC80ORF isoform, mas ambas as transcrições compartilham região codificante do gene NDC80 (ver esquema na Figura 4A). Nós projetamos dois conjuntos de sondas: conjunto The 590 CF vincula-se à região original 5′ de NDC80luti; e o conjunto de 670 Q vincula-se à região comum de NDC80luti e NDC80ORF. As transcrições NDC80luti foram detectadas como as manchas de smFISH onde os sinais de ambos sonda moda colocalized, Considerando que o NDC80ORF transcrições foram aqueles com o sinal apenas de Q 670. Devido ao tamanho do segmento exclusivo de NDC80luti, nós só poderia telha 20 pontas de prova do oligonucleotide ao longo desta região, que é menor do que o recomendado sondas de 30 a 48. Assim, determinamos primeiro se este conjunto de sonda robustamente poderia detectar RNA em nosso protocolo otimizado. Para qualquer canal fluorescente, graficamente a relação sinal-ruído (SNR, definido como a variação de pixels em torno de um ponto em relação a intensidade local) contra o sinal detectado para cada ponto de smFISH e gerado um gráfico de dispersão para os locais de identificado no campo de visão inteiro (imagens de exemplo na Figura 4A ) e parcelas na Figura 4B. Duas populações distintas foram claramente identificadas para ambos o 670 Q e a sonda de 590 CF define (Optimized, Figura 4B), sugerindo que as manchas de smFISH verdadeiro (dentro da área cinza) poderiam ser separadas do sinal de fundo. Observe que, na condição de qualidade inferior, tal separação foi menos óbvio (Suboptimal, Figura 4B). Usamos esses conjuntos de dois sonda para estudar a expressão da NDC80luti e NDC80ORFdurante o crescimento vegetativo e meiose. Nas células vegetativas, sinal robusto do conjunto sonda 670 Q foi detectado, mas não de 590 a CF sonda conjunto (Figura 5A, vegetativa), concordando com a observação pela mancha do Norte que só o isoform curto foi expressa durante o crescimento vegetative16 . Este resultado também sugere que o conjunto de sonda 590 CF específico, gerando baixo fundo em nosso protocolo otimizado de smFISH. Em contraste, sinal robusto de ambos os conjuntos de sonda foi detectado na prófase meiótica e a maioria dos pontos tinha colocalized de sinal (Figura 5A, prófase meiótica). Juntamente com análise de borrão do Norte (Figura 5B), esta observação confirmou que a isoforma de longa NDC80luti manifestou-se especificamente na meiose. Estes dois tipos de mRNAs foram detectados no citoplasma (fora da região DAPI), sugerindo que ambos foram exportados do núcleo, consistente com o ribossoma, criação de perfil de dados18. Para determinar se os dados suficientes foram coletados para conta com precisão para a variação biológica intrínseca ao nosso conjunto de dados, realizamos análise de inicialização usando as estatísticas de cada célula, que incluía (1) a fração dos pontos colocalized por célula e (2) a fração das manchas com um dos dois sinais fluorescentes (CF apenas 590 e Q apenas 670). Nesta análise, um programa selecionado aleatoriamente uma célula de 437 células quantificadas para 500 iterações. Em seguida, foram calculados a média e a variância das respectivas estatísticas associadas com esses 500 células selecionadas. Este processo foi repetido então para selecionar aleatoriamente duas células de todas as células, sem substituição; e depois para selecionar aleatoriamente três células, etc. até que uma metade do tamanho do conjunto de dados total foi alcançado. A variância do conjunto de dados se estabilizou após ~ 40 células, sugerindo que, após este ponto a maioria da variação média é intrínseca para os dados ao invés de um artefato de undersampling (Figura 6, inserir). Este efeito se tornou mais evidente quando nós graficamente a variação de amostra, dividida pela média da amostra, em função do número de células amostrados em cada ciclo de iteração (Figura 6). Com os dados mostrados, a mudança na variação tornou-se diminishingly pequena após ~ 60 células. O número de células quantificado em um experimento de smFISH deve exceder o número mínimo de células necessárias para alcançar uma média estável e um platô da variância. No nosso caso, podemos quantificar mais 95 células por amostra, por replicar. O número total de células (> 400) bem ultrapassado o número mínimo de células (~ 60) necessário para refletir a média da população. Com uma custom-made Matlab programa16, as células vegetativas foram encontradas para ter uma média de 5 NDC80ORF transcrições por célula, enquanto em células da prófase meiótica, a mediana caiu significativamente para 4 transcrições por célula (Wilcoxon bicaudal Teste de soma de Rank, p = 0,026) (Figura 7). O número médio de NDC80luti transcrições por célula foi 21 transcrições, e 100% das células expressa as transcrições NDC80luti . Nós graficamente a fração das células com um determinado número de transcrições como um histograma de frequência relativa, passo a passo, porque o número de moléculas de mRNA é uma quantidade discreta. O maior bin de cada histograma foi normalizada para a mesma altura. Figura 1: Flow-chart para o protocolo de smFISH. As células são fixos com formaldeído em temperatura ambiente por 20 min ou no 4 ˚ c durante a noite, para amostras de crescimento vegetativo e meióticas amostras, respectivamente. Após a lavagem em tampão B três vezes, as células são digeridas por zymolyase até ~ 70-90% das células são digeridos. As amostras digeridas são então lavadas uma vez com Buffer B para remover o zymolyase e posteriormente permeabilizadas em 70% etanol (EtOH) por ~3.5 horas. Para se preparar para a hibridação, amostras primeiro são incubadas em tampão de lavagem 10% formamida (FWB) por ~ 20 min. Em seguida, as amostras são resuspended em ~ 50 µ l de solução de hibridação, que contém as sondas fluorescentes, para incubação durante a noite, no escuro a 30 ˚ c. Após a hibridização, as amostras são incubadas em FWB 10% por 30 min para lavar as excesso sondas e então incubadas em 10% FWB com 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para manchar o DNA. Para a amostra fotografada imediatamente após a incubação FWB/DAPI, a amostra é resuspended no buffer GLOX suplementado com catalase, Trolox e glicose oxidase (GLOX + enz); Considerando que, as outras amostras são resuspended no buffer GLOX sem enzimas e armazenadas a 4 ˚ c até ~ 3 horas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: avaliação da qualidade smFISH usando sondas ímpar/par. (A) top: Diagrama esquemático para os conjuntos de sonda/ímpar. Cinquenta e quatro do oligonucleotide sondas, telhando o gene NDC80 foram projetadas. As sondas ímpares foram rotuladas com um fluoróforo (CF590, mostrado em magenta) e as sondas de pares, com mais um fluoróforo (Q670, mostrado em verde). Fundo: Representante smFISH imagens de células de prófase meiótica adquiriram usando os conjuntos de sonda/ímpar. Foram colhidas amostras 6 horas depois de células (UB8144) foram transferidas para meio de esporulação, uma vez que quando estas células foram presos em prófase meiótica. DNA foi manchado com DAPI (mostrado em azul). Imagens são mostradas como as projeções de intensidade máxima de z-pilhas. Barra de escala: 5 µm. (B) percentagem das manchas de smFISH pareados ou não pareado obtidos usando os conjuntos de sonda/ímpar. Um total de 428 prófase meiótica de células analisadas, pool de dois experimentos independentes. Esta figura é modificada da Figura 2-suplemento Figura 4 de Chen et al . 16 (C) A cumulativa densidade função (CDF) da distância entre cada par de pontos emparelhados e a distância entre o vizinho mais próximo de um local da marcação sem paridade. Para cada ponto detectado em um canal fluorescente, o algoritmo “k mais próximo vizinho” foi aplicado para identificar o local mais próximo de detectado — e a distância até esse ponto — no canal complementar. Localizações que eram mútuas mais próximo vizinhos foram consideradas para ser emparelhado, e uma nova lista foi gerada gravando as detecções emparelhadas, somente CF590 e Q670-somente. Para cada categoria de detecções, um histograma CDF das distâncias foi plotado em Matlab, confirmando que corretamente emparelhados pontos realmente eram muito mais perto na distância do que aqueles sem um correspondente em outro canal local. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: número de fracções de manchas emparelhadas e não emparelhadas, em função do RNA total por célula. Para testar se a detecção e o emparelhamento dos pontos smFISH era inclinado a níveis diferentes de expressão, células individuais foram agrupadas pela expressão de RNA total. As frações médios de detecções emparelhadas, somente CF590 e Q670 somente foram calculadas para cada grupo de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Avaliação da qualidade dos dados gerados usando as sondas projetadas para NDC80luti smFISH e NDC80ORF mRNAs. As sondas Q 670 (mostradas em verde) cruzam a região comum compartilhada entre NDC80luti e NDC80ORF mRNAs, Considerando que as sondas de 590 CF (mostradas em magenta) cruzam a região original 5′ de NDC80luti . (A) imagens do representante smFISH de NDC80luti e NDC80ORF em prófase meiótica, adquiriu sob otimizada contra condições suboptimal. Cepas UB8144 (otimizado condição) e UB1337 (condição suboptimal) foram induzidos a passam por meiose e fixados durante a prófase meiótica. Essas duas linhagens abrigam sistemas de sincronização diferente para induzir a meiose, mas o uso de qualquer sistema não afeta a qualidade de smFISH (dados não mostrados). Na condição de qualidade inferior, as células foram fixadas em temperatura ambiente por 20 min (sem fixação da noite), digerida com zymolyase sem VRC completada e hibridizado em uma concentração mais baixa da VRC. Imagens são mostradas como as projeções de intensidade máxima de z-pilhas. DNA foi manchado com DAPI (mostrado em azul). Barra de escala: 5 µm. Scatterplots (B) exibindo a relação sinal-ruído (SNR) e o sinal de cada smFISH ponto detectado no campo de visão apresentado na Figura 4A, qualquer canal fluorescente, bem como para as condições otimizadas ou qualidade inferior. Na condição otimizada, duas populações dos smFISH locais estiveram presentes. As manchas de smFISH verdadeiro localizavam-se dentro da área cinza, separa o sinal de fundo. Na condição de qualidade inferior, os mRNAs individuais eram difíceis de distinguir a olho nu, e a separação entre o verdadeiras manchas e fundo depois de executar o software de detecção de ponto foi menos óbvia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Expressão de NDC80luti e NDC80ORF transcrições são controladas temporalmente. (A) imagens do representante smFISH de NDC80luti e NDC80ORF durante o crescimento vegetativo e meiose. Vegetativas amostras foram tiradas quando células (UB8144) foram crescendo exponencialmente em meio nutritivo rico. 6 horas depois de células (UB8144) foram transferidas para meio de esporulação, uma vez que quando estas células foram presos em prófase meiótica, foram coletadas amostras de prófase meiótica. As sondas Q 670 (mostradas em verde) cruzam a região comum compartilhada entre NDC80luti e NDC80ORF mRNAs, Considerando que as sondas de 590 CF (mostradas em magenta) cruzam a única 5′ região de NDC80luti . DNA foi manchado com DAPI (mostrado em azul). Cada célula foi encenada por seu sinal Zip1-GFP, um marcador para prófase meiótica. Nosso protocolo de smFISH preserva o sinal forte do GFP sem modificações adicionais. Crescimento vegetativo: Zip1-GFP negativo. Prófase meiótica: Zip1-GFP positivo. Imagens são mostradas como as projeções de intensidade máxima de z-pilhas. Barra de escala: 5 µm. Esta figura é modificada da Figura 2 de Chen et al . 16. (B) NDC80ORF, NDC80,lutie o nível de proteína (Ndc80p) Ndc80 durante a meiose (UB4074). NDC80luti e NDC80ORF níveis foram determinados pelo Borrão do Norte, e Ndc80p nível foi determinada por immunoblot anti-V5 em pontos de tempo indicado. Hxk1p, carregando controle por immunoblot. Como a tensão UB8144, esta variedade também abriga o GAL4 pGAL-NDT80-ER sincronização sistema19,20. As células foram transferidas para meio de esporulação a 0 hora e libertadas da prisão de paquíteno pela adição de β-estradiol 6 horas mais tarde. A transcrição de NDC80luti robustamente foi detectada na prófase meiótica/S, Considerando que o NDC80ORF transcrições foi predominantemente presentes antes da entrada meiótica (0 hora) e durante as divisões meióticas (7-9 horas). Esta figura é modificada da Figura 6J de Chen et al . 16 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.  Figura 6: Bootstrap análise realizada para as amostras de prófase meiótica mostradas na Figura 5 . Todas as células quantificadas foram agrupadas, e um determinado número (n) das células foram amostradas aleatoriamente com 500 vezes. A média e o intervalo de confiança de 95% foram calculados para a fração de mRNA emparelhadas e não emparelhadas por célula. Estes dados foram plotados para cada escolha do número n (Inset). Planalto de variância foi visualizado plotando a variância da amostra dividida pela média, em função do número de células (n) amostrados. O número total de células medido (437) grandemente excedido o número no qual o erro se estabilizou (~ 60 células), indicando que os dados adicionais não iria melhorar a confiança nas medições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: quantificação dos dados smFISH mostrados na Figura 5 , gráfico como os histogramas de frequência relativa das células com um determinado número de NDC80luti e NDC80ORF transcrições por célula, usando os dados agrupados de três experimentos independentes. Linha tracejada indica o número médio de NDC80luti e NDC80ORF transcrições por célula. Cada histograma foi normalizada para que a altura máxima bin foi o mesmo em todos os histogramas. Um número total de 637 células foram analisado para o crescimento vegetativo e 437 para prófase meiótica. Teste de Wilcoxon Rank Sum bicaudal foi realizada por NDC80luti e NDC80ORF, respectivamente, comparando amostras de prófase meiótica e vegetativo. Esta figura é modificada de Figura 2D de Chen et al . 16 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.  Tampão B (estoque de 1 L: 1,2 M sorbitol; tampão de fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,5) 1 x Água livre de nuclease 500 mL Sorbitol g 218,6 KH2PO4 2,18 g K2HPO4 g 14,62 Água livre de nuclease Trazer para o volume final de 1 L * Armazenar no 4 ˚ c em alíquotas de 50 mL após esterilização do filtro Zymolyase 100T (10 mg/mL) * Armazenar em-20 ˚ c em alíquotas Dissolver o pó de zymolyase 10 mg em 1 mL de água MilliQ E. coli tRNA (10 mg/mL) * Armazenar em-20 ˚ c em alíquotas Dissolver o pó de tRNA 10 mg em 1 mL de água MilliQ etanol a 70% (50 mL) 1 x (mL) Etanol puro 35 Água livre de nuclease 15 * Armazenar à temperatura ambiente Tampão de hibridização (10ml) 1 x (mL) Sulfato de dextrano de 50% 2 Escherichia coli tRNA (10 mg/mL) 1 200 mM vanadil ribonucleoside complexo (VRC) 0.1 BSA, 50 mg/mL 0,04 20 x SSC 1 Formamida 1 Água livre de nuclease 4.86 * Armazenar em-20 ˚ c em alíquotas de 250 µ l ou 500 µ l tampão de lavagem formamide 10% (10ml) 1 x (mL) Formamida à temperatura ambiente 1 20 x SSC 1 Água livre de nuclease 8 * fazer fresco, vórtice para 20-30 anos para misturar solução de glicose 10% * Armazenar no 4 ˚ c em alíquotas após a esterilização do filtro Dissolver 1 g de glicose em 10 mL de água livre de nuclease Glicose oxidase * Armazenar em-20 ˚ c em alíquotas Dissolver glicose oxidase de 3,7 mg em 1 mL de 50mm NaOAc, pH 5 Antilixívia (GLOX) Buffer, sem enzimas (1 mL) 1 x (µ l) 10% de glicose em água livre de nuclease 40 1 M Tris, pH 8.0 10 20 x SSC 100 Água livre de nuclease 850 * Certifique-se fresco, também pode armazenar alíquotas no 4 ˚ c Antilixívia (GLOX) Buffer, com enzimas (50 µ l) 1 x (µ l) Catalase (vórtice levemente, instala-se facilmente) 0,5 Glicose oxidase 0,5 100mm Trolox (dissolvido em etanol) 1 Buffer de GLOX 50 * fazer fresco cada vez, prepara-se em gelo, pode ser armazenado no 4 ˚ c, durante 2-3 horas Tabela 1. Buffers e mídia