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Genetics

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

Published: May 25, 2018
doi:
10.3791/57774
, ,
1Department of Molecular and Cell Biology, Barker Hall,University of California, Berkeley, 2Department of Molecular and Cell Biology, Li Ka Shing Center,University of California, Berkeley

Summary

この単一分子蛍光その場で交配のプロトコルは、栄養生長と減数分裂中出芽酵母の RNA 分子の数を数値化に最適です。

Abstract

単一分子蛍光の in situハイブリダイゼーション (smFISH) は、その能力を検出し、個々 の RNA 分子をカウントのための単一細胞における遺伝子発現を研究する強力な手法です。深いシーケンス ベースの方法を補完するもの、smFISH は、トラン スクリプト豊富に細胞間変異と指定された RNA の細胞内分布についてを説明します。最近、我々 は出芽酵母の減数分裂期に遺伝子NDC80の発現を研究する smFISH を使用している、どの 2 つのトラン スクリプトにアイソ フォームが存在する、短い写しアイソ フォーム長いアイソ フォームと共有の全体シーケンス。自信を持って各トラン スクリプト アイソ フォームを識別するため、我々 は知られている smFISH プロトコルを最適化し、新進の中に取得したサンプルの smFISH データの高い一貫性と品質を得られる酵母の減数分裂です。ここでは、この最適化されたプロトコルは、かどうか smFISH データの高品質が得られると他の酵母菌株と成長条件でこのプロトコルを実装するためのいくつかのヒントを決定するために使用する基準について述べる。

Introduction

遺伝子発現の動的な制御は、代謝環境ストレス、感染症、および変更への応答と同様、有機体の開発をドライブします。転写制御に焦点を当てる研究は RNA 量測定技術に頼る。単一分子蛍光性上皮内交配 (smFISH) と呼ばれる 1 つそのような方法は、単一セル1,2で個々 の RNA 分子の検出に使用します。このメソッドでは、遺伝子発現、細胞間の変動の測定と細胞内の RNA の局在性の決定をことができます。

最も一般的に使用される smFISH の手法で個々 の RNA 分子の検出は、複数短い DNA のプローブ (多くの場合 ~ 48 20 mer プローブ) 標的 RNA を補完し、同じ蛍光色素の共役を必要があります。弱い信号における単一蛍光プローブの結合結果が、すべてのプローブのアンサンブルからの信号は堅牢です。にもかかわらず、単一のプローブでは、ターゲットからバインディングを表わすことができる、このような信号は、ターゲット RNA 分子3のに比べて非常に弱いと予想されるので、この機能は信号対雑音比を大幅に向上します。検出の誤差範囲内で RNA 分子の数をカウントし、様々 な成長条件と異なる突然変異体間で比較できます。

その最初の開発以来 smFISH は、遺伝子式4、転写伸長1,2,5,6、7を破裂転写スプライシングなどのさまざまな側面を研究する適応されています,8,9細胞内の対立表現10、11,12RNA 局在13,14,15最近、我々 の同じ遺伝子の 2 つの議事録フォームの発現を研究するこのメソッドを使用している短い写しアイソ フォーム (NDC80ORF) 長いアイソ フォーム (NDC80白頭と共有の全体のシーケンスを)16。2 つのプローブ セットを用いて 2 つの mRNA のアイソ フォームを一意に識別するには、: 1 セットはNDC80白頭一連のユニークな他の設定では、他の蛍光色素の共役を 2 つのアイソ フォームの共通の領域にバインドします。一方では両方の蛍光信号のNDC80白頭RNA をコードして, スポットとして識別、 NDC80ORF RNA は一般的なプローブ セットからの信号のみが含まれています。数、 NDC80ORF自信を持って smFISH スポットを特定し、エラーを削減するプローブの交配の高効率化と高い信号対雑音比が必要、成績証明書を「差分」法による計算伝搬します。

本稿では、出芽酵母酵母の smFISH を実行するための最適化されたプロトコルについて説明します。SK1 ひずみ背景出芽酵母の中の栄養このプロトコル、セル数、固定時間、消化時間、消化バッファー、プローブの濃度および交配の smFISH 実験のために使用されるバッファーに最適化成長または減数分裂です。しかし、我々 はこの原稿でなお: (1) 画像集録、およびプロトコル別の系統の背景と成長条件の最適化が必要で (2) の手順を実行後、smFISH データの品質をチェックするようメソッド。

Protocol

メモ: すべてのバッファーとこのプロトコルで使用されるメディアは、表 1に表示されます。試薬用のベンダー情報は、材料のテーブルに表示されます。 一日 1/一日 1-2: 注: 栄養文化の細胞を好ましい媒体で 0.4 〜 0.6 の OD600に成長します。減数分裂文化受ける減数分裂 (1.85 の OD600で通常養殖) 最寄りのメソッドを使用してセルを誘発します。 1. サンプルの固定法と消化 3% ホルムアルデヒドのセルの ~3.5 OD600の合計を修正します。 植物の文化文化の 5.52 mL を 15 mL の円錐管に 37% ホルムアルデヒドの 480 μ L に追加します。 減数分裂の文化文化の 1840 μ L を 2 mL マイクロ遠心チューブ用の 37% ホルムアルデヒドの 160 μ L に追加します。〜 5 回を逆転してミックスします。注意: ホルムアルデヒドは有毒です。処理、制度上の規則に従って処分してください。 室温で 20 分間のローラー ドラムにチューブを置きます。減数分裂のサンプル、20 分間室温で修正した後継続、4 ° C で一晩固定、回転します。注: 一晩固定再現性と減数分裂のサンプル取得した smFISH データの品質が向上します。固定時間を最適化する必要があります。 サンプルを修正しながら 200 mM バナジル リボヌクレオシド複合体 (VRC) の少なくとも 10 分の 65 ° C に解凍します。 15 mL チューブに消化マスター ミックスを調製: 1 サンプル、200 mm (65 ° C に加温); VRC 40 μ L でバッファー B の 425 μ L をミックス5 つのサンプルで 200 mM (65 ° C に加温) VRC の 200 μ L でバッファー B の 2125 μ L をミックスします。渦 ~ 5 s VRC 添加後明るい茶色緑が表示されます、マスターのミックスに追加する前に、VRC を完全に再懸濁します。注意: 消化中に添加 VRC はザイモリエイスの混合物は、粗抽出物から精製されたによって導入されるヌクレアーゼ汚染物質を阻害することによって可能性があります smFISH 結果の一貫性向上します。VRC のこのステップで必要な量を最適化してください。 植物サンプルの 3 分間 ~ 1057 x g でチューブを遠心します。(一晩固定) 後減数分裂サンプル 1.5 分デカント 21,000 × g で遠心分離機またはホルムアルデヒド無駄に上清を吸引します。注: すべての遠心分離手順は、室温で実行されます。 上下にピペッティングか、チューブを反転してミックスするフリックは、コールド バッファー B の 1.5 mL の細胞を再懸濁します。再懸濁後、植物サンプルを 2 mL チューブに転送します。 21,000 × g で遠心する 1.5 分削除液体のバルクは真空吸引によりピペッティング、〜 100 μ L を残してします。 コールド バッファー B の 1.5 mL の細胞を再懸濁します 21,000 × g で遠心する 1.5 分削除液体のバルクは真空吸引によりピペッティング、〜 100 μ L を残してします。 液体真空によって完全にまたはピペッティングによる冷たいバッファー * 1.5 分吸引 21,000 × g で遠心の 1.5 mL の細胞を再懸濁します。 消化のマスターの組合せ、および簡潔に再懸濁しますに渦の 425 μ L で細胞を再懸濁します。各チューブに 100 t 10 mg/mL ザイモリエイスの 5 μ L を追加します。注: 渦ザイモリエイス前にチューブを追加するたびに。マスターのミックスに追加するのではなく、個別に各チューブにザイモリエイスを追加します。両方の手順は、ザイモリエイスはすぐに析出するため消化管の間で一貫性を維持に役立ちます。 渦 2-3 s をミックスします。ローラー ドラムのチューブを置き、15-30 分のための 30 ° C に消化します。栄養細胞は、減数分裂初期 ~ 15 分かかります、減数分裂前期と減数分裂の部門は、通常かかります 〜 30 分。注: 15 分後 5 分毎に顕微鏡を確認、非透明性と非屈折細胞の約 80% が表示される場合、消化を停止します。この時点から細胞が非常に壊れやすい。セルをそっと扱うし、真空吸引またはボルテックスを使用しないでください。 遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でチューブ液体完全にピペッティングによる。 優しく上下に 1-2 回をピペットで 1 ml のバッファー B の細胞を再懸濁しますミックスします。 ピペッティングで ~ 376 x g で 3 分間削除バッファー B 液でチューブを遠心します。優しく (RNase フリー水で希釈) 70% エタノール 1 mL に細胞を再懸濁します。 3.5-4 時間室温で孵化させなさい。 2. 交配 部屋の温度にホルムアミドをもたらす (50 mL の約数のかかる 〜 30 分湯せんで)。注: ボトル ホルムアミドの酸化を避けるために部屋の温度に達するまでは、ホルムアミド ボトルを開かないでください。注意: ホルムアミドは有毒です。処理、制度上の規則に従って処分してください。 15 mL の円錐管に 10% ホルムアミド洗浄バッファーを準備します。 ピペッティングで 70% のエタノールの 3 分を削除 500 μ L の ~ 376 x g でチューブを遠心します。優しく上下に、残りの細胞を再懸濁します、低接着管にセルを転送ピペット。注: は大幅低接着管を使用後の洗浄中にセル損失を低減します。 ピペッティングによるすべてのエタノール ~ 376 x g で 3 分間削除で再度チューブを遠心します。 上下に 2-3 回の 10% ホルムアミド洗浄バッファー、およびゆっくりピペット 1 mL を追加、細胞を再懸濁します。 交配のソリューションを準備している間 〜 20 分室温に坐るため細胞を許可します。1 サンプルの交配バッファー (部屋の温度) の 50 μ L、5 μ L 200 mM (65 ° C に温めて) VRC の各プローブ (200 nM ファイナル) の 1 μ L をミックスします。5 つのサンプルで交配バッファー (部屋の温度) の 250 μ L、200 mM (65 ° C に温めて) VRC の 25 μ L、5 μ L の各プローブ (200 nM ファイナル) をミックスします。 ホルムアミドの酸化を防ぐために管を開く前に、部屋の温度に交配バッファー (-20 ° C で凍結) を解凍します。 200 mM VRC、渦、プローブを追加する前に 5 10 秒を追加した後して、商業的に購入は、製造元の指示に従って再構成されました。 2 つのプローブが共同培養の場合追加 1 μ L、1:10 のプローブ #1 株だけでなく、1 μ L、1:10 の希釈の最終的な希釈を行うため、プローブ #2 株式の希釈 〜 プローブのレバレッジ。信号対雑音比最高のニーズに必要な濃度を最適化 (詳細についてのディスカッションを参照してください)。 遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でサンプル上清有害廃棄物にピペッティングによる。 各チューブに交配ソリューションの少なくとも 50 μ L を追加します。ミックス チューブをフリックします。 暗闇の中で、少なくとも 16 時間ローラー ドラムの 30 ° C で孵化させなさい。 2 日目/3 日目 3. 洗浄およびイメージング ホルムアミドを室温に戻します。 15 mL の円錐管に 10% ホルムアミド洗浄バッファー (FWB) を準備します。 ローラー ドラムからチューブを外し、光から保護するためにホイルで覆われたボックスにそれらを置きます。 遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でサンプル上清有害廃棄物にピペッティングによる。 優しく上下にピペットで 1 mL の 10 %fwb で再懸濁します 2-3 回。 ホイルで覆われたボックスで 30 分 (回転しない) 30 ° C で孵化させなさい。 3 分は、ピペッティングで有害廃棄物に上清を除去のために ~ 376 x g でサンプルを遠心し、〜 50 μ L のまま。 一方、15 mL の円錐管に DAPI/FWB を準備: 1 サンプル、5 Mg/ml の DAPI の 1 μ L で 10% ホルムアミド洗浄バッファーの 1000 μ L をミックスします。10 個のサンプルの 5 mg/mL DAPI の 10 μ L と 10 mL の 10% ホルムアミド洗浄バッファーをミックスします。優しく上下にピペットで 1 mL DAPI/FWB ので再懸濁します 2-3 回。 ホイルで覆われたボックスで 30 分 (回転しない) 30 ° C で孵化させなさい。 氷の上の反漂白剤試薬を解凍します。 遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でサンプル上清完全にピペッティングによる。必要な場合は遠心上清のすべてを削除する再び。 時に、すぐにサンプル、50 μ L の酵素 GLOX バッファーなしでペレットを再懸濁します。上下ピペット 3-4 回をミックスします。 すべての unimaged サンプル ボックスのままホイルで覆われた 4 ° C で準備が整うまでイメージに。イメージする準備ができたら、2 分間 ~ 376 x g でサンプルを遠心し、ピペッティングで清を完全に除去。以下の酵素と GLOX で再懸濁します。 サンプルをすぐにイメージされる、GLOX バッファーと酵素の 15-20 μ L を追加します。ミックスを上下に優しくピペット。注: 追加ボリューム細胞ペレットのサイズによって異なります。我々 は 15 μ L の酵素とバッファーを GLOX ので、ペレットを再をお勧めし、顕微鏡で細胞密度を確認します。細胞は密度が高すぎる (互いの上に群生していること細胞) である場合は、酵素と余分な GLOX バッファーを追加します。細胞はまばら、遠心分離機のサンプル、~ 5 μ L のバッファーを削除します。 ピペット 5 coverslip (18 mm × 18 mm、第 1)、およびスライドの coverslip を入れて上に μ L。 Coverslip の配置場所研究室ワイプ、スライドの上を置きます。研究室ワイプを軽く押して、スライド (液体、カバーガラスのすべての 4 つのエッジから外れを参照する必要があります) に設定します。 スライドをアルミ箔で覆われた箱で顕微鏡室に転送します。 高倍率 (60 〜 100 倍) と高開口数ワイド フィールド蛍光顕微鏡を使用してイメージ。注: smFISH プローブによって放出されるフォトンの最大数を収集するには、共焦点顕微鏡は推奨されません、彼らが収集する光の量を大幅に制限します。ここでは、データが収集された 100 X 1.4 NA 目的を搭載した顕微鏡を使用してフィルター CY5 1.3 でイメージ (EX632/22, EM679/34) s、100 %t;TRITC (EX542/27、EM597/45)、1.3 s、100 %t;DAPI (EX390/18、EM435/48) 0.05 0.1 s、32%-50 %t.明るいフィールド参照画像も取得する必要があります。0.1 から 0.2 のステップ サイズで 15 25 スライスを取得 μ m から完全に上記のビューのフィールドのフォーカス以下完全すべてのことを確認するために RNA のスポットに対応します。 4. 画像解析 魚クワント17など StarSearch2、公開された smFISH 分析ツールや実験の正確な要件に応じてのオーダー メード プログラム smFISH のデータを分析します。注: 良い解析パイプラインにより、ユーザーは、背景から真の RNA スポットを分離し、X、Y、および Z (オプション) 座標と各スポットでは、各セルでのスポットの数の強さなどの統計情報を出力するしきい値を決定するには、とおそらく誤検出を排除する方法としてパラメーターを調整します。

Representative Results

うまく働いた smFISH のプロトコルです (図 1で説明)、我々 はタイルのNDC80遺伝子の開いたリーディング ・ フレーム 54 プローブのセットを設計を評価する (図 2 a上)。最も 5′ 端にあるプローブはプローブ 1; と呼ばれます次のいずれか、プローブ 2;3 つ目、プローブ 3など。27 プローブ割り当ての奇数番号 (プローブ 1、3、5…) はすべて、CAL Fluor 590 (CF590) 蛍光色素; の共役27 のプローブは、クエーサー 670 (Q670) 蛍光色素の共役 (プローブ 2、4、6…)、偶数を割り当てられます。したがって、これらの交互になるプローブ セットしばしば呼ばれます「奇数/偶数」プローブとして。交配の時に両方のプローブ セットする必要があります同じトラン スクリプトにラベルを付けます。 スポット検出後 smFISH データ セットの品質を判断するのにいくつかの測定値を使用しました。最初の 1 つは、度と奇数/偶数のプローブの共存の品質でした。私たちの場合、すべての smFISH スポットの 88% 結果 (図 2 a と 2 b)、スポット互い (図 2、ペア)、2 ピクセル以内ペア内にある指定した想定値任意波長と検出の 95% を超えると2 蛍光チャネル間収差。比較すると、対になっていないスポットの 10% 未満いたスポット ペアを誤認する確率が低いことを示す未満 2 ピクセルの最近隣距離 (図 2)。対になっていないスポットの 12% 均等に 2 つのチャネル間で分割されました (図 2 b、比較 Q670 専用 CF590 専用);したがって、我々 はセルあたり 45 議事録ゼロ間の表現の範囲を持つ 2.4 kb 遺伝子の RNA 分子の ~ 94% 検出されたこと正確に各蛍光チャネルで締結.SmFISH プロトコルは、最適ではないが場合、は、すべての (1) (,)、2 つの蛍光信号の 1 つだけの smFISH スポットの大きい割合および/または非常に低い信号対雑音比や信号がない (2) セルを観察したい 1 つ。 次に、セルごとの RNA 分子の総数に関して smFISH 信号の検出が偏っていたかどうかと聞きました。人口で各セルに特定の RNA の合計数はいくつかの細胞が他のものよりより多くの RNA 分子をかくまっているとディストリビューションにあります。関係なく数が多いまたは RNA の分子の数が少ないが各セル内に存在するかどうか良い smFISH プロトコル RNA を確実検出する必要があります。セルごとに、これをテストするには、コードして, 信号の smFISH スポットの分数と 1 つだけ 2 つの蛍光信号の割合を計算しました。セルあたり全スポットの同じ数があったセルをグループ化した後の加重平均を計算しました, (ペア) または特定のグループの非結果 (CF590 のみ、または Q670 専用) スポットの合計数の関数としてこの平均をグラフ化し、1 つのセル (図 3) スポット。スポットのカテゴリごとに、セルごとのスポット総数の全範囲にわたっての分数に似ていた。例えば、30 点の合計と、それらのセルあたり 20 蛍光点の合計で細胞を比較すると、平均分数コードして, スポットの類似していた。この結果が示唆我々 のプロトコルが (少なくとも 40 〜 分子セルあたり) までのセル範囲の RNA 分子を検出できます。プロトコル働いて微々 たるもの、1 つはバイアスを観察可能性があります。たとえば、2 つの蛍光信号の 1 つだけのスポットの一部がスポット増加セルごとの合計の数として増加します。 この最適化されたプロトコルを使用して、生育条件で、動原体蛋白質をコードするNDC80遺伝子の発現を調べた。NDC80遺伝子は、2 つの mRNA のアイソ フォームを表現する: 長いデコードされていない転写アイソ フォーム、 NDC80白頭短いと比較して 5′ 端で 〜 400 塩基対拡張子を持つNDC80ORFアイソ フォーム、しかし両方の成績証明書を共有(図 4 aの回路を参照してください) NDC80遺伝子のコーディング領域。プローブの 2 つのセットを考案した: NDC80白頭; のユニークな 5′ 領域にバインド、CF 590 セットQ 670 セットNDC80白頭の共通領域に結合し、 NDC80ORF。NDC80白頭の成績証明書に対し、両方の信号が、結果セットをプローブ smFISH スポットとして検出された、 NDC80ORF成績証明書のみ Q 670 からの信号とのものであった。NDC80白頭の一意のセグメントのサイズのため我々 はのみ推奨 30 に 48 プローブよりも少なくこの領域に沿って 20 のオリゴヌクレオチド プローブをタイルでした。したがって、我々 はまずかどうか最適化されたプロトコル、RNA を確実検出でしたこのプローブ セットを決定します。いずれかの蛍光チャネルは各 smFISH スポットの検出信号と信号対雑音比 (SNR、スポットの強度を基準にしてスポットを周囲の画素の差異として定義されている) をグラフ化し、すべてのスポットの散布図を生成(図 4 aのイメージ例) と図 4 bでプロット全体ビューのフィールドで識別されます。2 つの異なる集団が明確に両方の Q 670 のあり CF 590 プローブ セット (最適化、図 4 b)、バック グラウンド信号から (灰色の領域) 内の真の smFISH スポットを分けることができることを示唆しています。最適ではない状態でこのような分離はあまり明白でない (準最適、図 4 b) に注意してください。 これらの 2 つのプローブ セットを使って表現NDC80白頭の研究とNDC80ORF栄養増殖と減数分裂の間に。植物細胞における Q 670 プローブ セットから堅牢な信号が検出されたが CF 590 からプローブ設定されません (図 5 a、栄養)、北にしみが付くことによって観察に同意して短いアイソ フォームだけ生長16 の中に表現されて.この結果はまた、CF 590 プローブ セットは特定、最適化された smFISH プロトコル低バック グラウンドの降伏を示唆されました。対照的に、減数分裂前期で両方のプローブ セットから堅牢な信号が検出され、スポットの大半は信号 (図 5 a、減数分裂前期) を結果を持っていた。一緒に北のしみの分析 (図 5 b)、この観察は、長いアイソ フォームNDC80白頭が減数分裂で具体的に表現されたことを確認しました。これら 2 種類の Mrna は、両方がプロファイリング データ18リボソームと一貫性のある核からエクスポートされたことを示唆している (DAPI の地域で)、外の細胞質で検出されました。 調べるには、データ セットに固有の生物学的変動を正確に十分なデータが収集されたかどうか、(1) セルと (2) あたりコードして, 点の割合含まれている各セルの統計を使用してブートス トラップの解析を行った2 つの蛍光信号 (CF 590 のみ、Q 670 のみ) のいずれかでスポットの割合です。この解析プログラムは、500 のイテレーションの 437 定量化されたセルから 1 つのセルをランダムに選択。次に、平均と分散これらの 500 の選択したセルに関連付けられているそれぞれの統計情報が計算されます。このプロセスは交換なしのすべてのセルからランダムに 2 つのセルを選択するため、繰り返されました。そして3 つの電池などをランダムに選択するため。1 つまで合計データ セットのサイズの半分に達した。データ セットの分散頭打ちになった後、この時点でほとんどの平均の変動がアンダー サンプリングの成果物ではなく、データに固有の ~ 40 セルの後 (図 6、挿入)。この効果は我々 は標本分散の各イテレーション サイクル (図 6) でサンプリングされたセルの数の関数として標本平均で割った値をグラフ化した場合より明らかになった。データが表示されます、分散の変化は 〜 60 セルの後 diminishingly 小さくなった。SmFISH 実験の定量化のセルの数は、安定した平均と分散の高原を達成するために必要なセルの最小数を超える必要があります。私たちのケースで我々 は以上 95 のセルあたりのサンプル数を定量化しました。(> 400 細胞) の総数も母集団の平均を反映するように必要な細胞 (~ 60 細胞) の最小数を超えました。 カスタムメイド Matlab プログラム165 の中央分離帯を持っている栄養細胞が見つかりましたNDC80ORF 、セル当たり成績減数分裂前期セルで中央値低下 (両側検定ウィルコクソンのセルあたり 4 成績証明書に対し順位和検定、p = 0.026) (図 7)。セルあたりNDC80白頭を成績証明書数の中央値は 21 の成績証明書と 100% の細胞表現NDC80白頭の成績証明書。MRNA の分子の数が離散量ために、我々 は折れ曲がり、相対周波数ヒストグラムとして成績証明書の特定の数を持つセルの割合をグラフ化。各ヒストグラムの最大の箱は、同じ高さに正規化されました。 図 1: フローチャートの smFISH プロトコル。セルは、ホルムアルデヒドと固定 4 ° C、20 分間室温で一晩、生長のサンプルと減数分裂のサンプルのそれぞれ。洗浄バッファー B に 3 回後、細胞はザイモリエイスによって消化され ~ 70%-90% の細胞が消化されるまで。消化液のサンプルは洗浄しザイモリエイスを削除するバッファー B と 1 時間、~3.5 時間の 70% のエタノール (エタノール) でその後グリセリン。交配の準備をするには、サンプルが 10% ホルムアミド洗浄バッファー (FWB) 〜 20 分のために培養しました。次に、サンプルは 30 ° C で暗闇の中一晩インキュベートする、蛍光プローブを含んでいる交配ソリューションの 〜 50 μ L で再停止されます。交配後サンプルを離れて余分なプローブを洗浄する 30 分間 10 %fwb 培養し、培養に 4′, 6-diamidino-2-phenylindole、DNA を染色する (DAPI) 10 %fwb。FWB/DAPI 孵化直後後イメージ サンプル、サンプルはカタラーゼ、地方およびブドウ糖酸化酵素 (GLOX + enz); を添加した GLOX バッファーで再停止されます。その他のサンプルは酵素がなければ、GLOX バッファーで再停止される、4 ° C で保存されているに対し、~ 3 時間まで。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: 奇数/偶数のプローブを用いた smFISH 品質評価します。(A) 上: 図のための奇数/偶数プローブ セット。NDC80遺伝子をタイリング 54 オリゴヌクレオチド プローブを設計されていた。奇数プローブは、1 分子蛍光 (CF590、マゼンタで表示されます) と別蛍光 (Q670、緑色で表示されます) と、偶数プローブで標識しました。下: 減数分裂前期セルの代表 smFISH 画像は、奇数/偶数のプローブ セットを使用して取得。6 時間後に細胞 (UB8144) は、これらの細胞が減数分裂前期で逮捕されたときに胞子形成培地に移されたが採取されました。DNA は、DAPI (青で示されている) で染まっていた。Z スタックの最大強度突起として画像が表示されます。スケール バー: 5 μ m。 ペアまたは対になっていない smFISH スポットの (B) の割合は、奇数/偶数のプローブ セットを使用して得られます。428 減数分裂前期セルの合計は、2 つの独立した実験からプール行った。この図は、図 2から変更-陳らの図サプリメント 416 (C) の累積密度関数 (CDF) 対スポットの各ペアと対になっていない点の最も近い隣人間の距離間の距離の。蛍光チャネルを 1 つで検出された各スポットの”k 最近傍”アルゴリズムが最も近い検出された場所を識別するために適用されました- とその場所までの距離、相補的なチャネルで。ローカライズされた近傍相互は、ペアにすると考えられていた、新しいリストは、ペア、CF590 専用と Q670 のみ検出を記録生成でした。検出のそれぞれのカテゴリに対して距離の CDF ヒストグラムが正しくペアになっているスポットほんとうにはるかに近い距離で他のチャネルに対応するがないものよりも確認する Matlab でプロットしました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: 総 RNA の機能として、ペアとペアになっていないスポットの分数セル当たり番号します。検出と smFISH スポットのペアリングが異なった表現のレベルで偏っていた場合をテストするための個々 のセルは、総 RNA 発現によってグループ化されました。セルの各グループのペア、CF590 専用と Q670 のみ検出の平均比率を求めた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: NDC80白頭用に設計されたプローブを使用して生成された smFISH データ品質評価とNDC80ORF Mrna 。NDC80白頭間で共有、共通領域に交配させる (緑色で表示) Q 670 プローブとNDC80ORF Mrna、 NDC80白頭のユニークな 5′ 領域に交配させる (マゼンタで表示されます) CF 590 プローブに対し.(A) 代表 smFISH NDC80白頭の画像とNDC80ORF減数分裂の前期に取得した対準最適条件下で最適化します。株 UB8144 (最適化条件) と UB1337 (最適ではない状態) 減数分裂を経るように誘導され、減数分裂前期の間に固定します。これらの 2 つの系統を抱く、減数分裂を誘導するためのさまざまな同期システムが、どちらのシステムの使用に smFISH 品質 (データは示されていない) は影響しません。最適な状態で細胞をザイモリエイス VRC 補われるとハイブリダイズ VRC の濃度を低下させることがなく消化され 20 分 (一晩固定なし) 室温で修正しました。Z スタックの最大強度突起として画像が表示されます。DNA は、DAPI (青で示されている) で染まっていた。スケール バー: 5 μ m。 信号対雑音比 (SNR) とビューのフィールドで検出された各 smFISH スポットのシグナルを表示する (B) の散布図は、図 4 a、で提示してどちらかの蛍光チャネルと最適または準最適の条件。最適化された条件で smFISH スポットの 2 つの集団は存在しました。真 smFISH スポットは、背景信号から分離する灰色の領域内に位置していた。最適ではない状態で個々 の mRNAs が目で区別するは難しいとスポットの検出ソフトウェアを実行した後真スポットと背景の分離がわかりにくくしたところ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5: NDC80白頭発現とNDC80ORFトラン スクリプトは、制御一時的。(A) 代表 smFISH NDC80白頭の画像とNDC80ORF栄養増殖と減数分裂の間に。栄養豊富な培地で細胞 (UB8144) が指数関数的に育っていたとき、植物が採取されました。減数分裂前期採取した 6 時間後に細胞 (UB8144) は、これらの細胞が減数分裂前期で逮捕されたときに胞子形成培地に移されました。NDC80白頭間で共有、共通領域に交配させる (緑色で表示) Q 670 プローブとNDC80ORF Mrna、CF 590 プローブ (マゼンタで表示されます) が、一意の 5′ 領域NDC80に交配させるに対し白頭.DNA は、DAPI (青で示されている) で染まっていた。各セルは、その Zip1 gfp、減数分裂前期のマーカーによって上演されました。私たち smFISH プロトコルは、さらに変更することがなく強力な GFP 信号を保持します。生長: Zip1 GFP 負。減数分裂前期: Zip1 GFP 陽性。Z スタックの最大強度突起として画像が表示されます。スケール バー: 5 μ m。陳らの図 2からこの図を変更します。16. (B) NDC80ORF、 NDC80白頭と減数分裂 (UB4074) Ndc80 (Ndc80p) 蛋白質レベル。NDC80白頭とNDC80ORF 、ノーザンブロットによりレベルを求めた、Ndc80p レベルが示された時点でアンチ V5 イムノブロットによって決定されました。Hxk1p、イムノブロットの負荷制御。として UB8144、歪み、この歪みを抱いて、 pGAL NDT80 GAL4-ER同期システム19,20。セルは 0 時間で胞子形成培地に移され、6 時間後 β-エストラジ オールの添加による pachytene の逮捕から解放。対し頑健 S/減数分裂前期で検出されたNDC80白頭トラン スクリプト、 NDC80ORF成績減数分裂 (0 時間) 前に、減数分裂部門 (7-9 時間) 中に主に存在していた。陳らの図 6 jからこの図を変更します。16この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。  図 6: 減数分裂前期のサンプルに示すように分析をブートス トラップ図 5.定量化されたセルのすべての物をプールし、セルの指定した数 (n) 500 回無作為に抽出します。セルごとのペアと対になっていない mRNA 量の平均値と 95% 信頼区間を求めた。番号 n (インセット) の選択肢ごとにこれらのデータがプロットされます。分散の高原は、標本分散がサンプリングされたセル (n) の数の関数として、平均値で割った値をプロットすることによって可視化した.総数細胞測定 (437) の大幅超過で番号エラー頭打ち (~ 60 細胞)、追加データが測定の自信を向上させないことを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 7: で表示される smFISH データの定量化図 5、 NDC80白頭の特定の数を持つセルの相対周波数ヒストグラムとしてグラフとNDC80ORF 3 つの独立した実験からプールされたデータを使用して、セルごとの成績証明書です。破線を示してNDC80白頭数の中央値およびNDC80ORFセルごとの成績証明書。各ヒストグラムは、ヒストグラムのすべての間で同じであった最大箱高さとなるように正規化だった。栄養増殖と減数分裂前期の 437 の 637 のセルの合計数を行った。NDC80白頭2 ウィルコクソンの順位和検定を行ったとNDC80ORF、それぞれ、栄養生長と減数分裂前期のサンプルを比較します。陳らの図 2 Dからこの図を変更します。16この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。  バッファー B (1 L 在庫: 1.2 M ソルビトール; 0.1 M カリウム リン酸バッファー、pH 7.5) 1 x ヌクレアーゼ フリー水 500 mL ソルビトール 218.6 g KH2PO4 2.18 g K2HPO4 14.62 g ヌクレアーゼ フリー水 1 L の最終巻にもたらす * フィルター殺菌後 50 ml で 4 ° C で保存します。 ザイモリエイス 100 t (10 mg/mL) * 因数で-20 ° C で保存します。 MilliQ 水 1 mL に 10 mg ザイモリエイス粉溶解します。 E. 大腸菌tRNA (10 mg/mL) * 因数で-20 ° C で保存します。 MilliQ 水 1 mL に 10 mg tRNA 粉溶解します。 70% のエタノール (50 mL) 1 (mL) x 純粋なエタノール 35 ヌクレアーゼ フリー水 15 * 常温で保存します。 交配バッファー (10 mL) 1 (mL) x 50% デキストラン硫酸 2 大腸菌tRNA (10 mg/mL) 1 200 mM バナジル リボヌクレオシド複雑な (VRC) 0.1 BSA、50 mg/mL 0.04 20 x SSC 1 ホルムアミド 1 ヌクレアーゼ フリー水 4.86 * 250 μ L または 500 μ L の因数で-20 ° C で保存します。 10% ホルムアミド洗浄バッファー (10 mL) 1 (mL) x 室温でホルムアミド 1 20 x SSC 1 ヌクレアーゼ フリー水 8 * 新鮮な 20-30 代の渦に加えるミックス 10% ブドウ糖溶液 * フィルター殺菌後因数で 4 ° C で保存します。 ヌクレアーゼ フリー水 10 mL にブドウ糖の 1 g を溶解します。 グルコースオキシダーゼ * 因数で-20 ° C で保存します。 3.7 mg グルコースオキシダーゼ 50 mM NaOAc、pH 5 の 1 mL に溶解します。 酵素 (1 mL) がなければ、反漂白剤 (GLOX) のバッファー 1 (μ L) x ヌクレアーゼ フリー水で 10% ブドウ糖 40 1 M トリス、pH 8.0 10 20 x SSC 100 ヌクレアーゼ フリー水 850 * 新鮮なを確認、4 ° C で因数を格納することも 反漂白剤 (GLOX) バッファー、酵素 (50 μ L) 1 (μ L) x カタラーゼ (渦穏やかに、それが止まってしまいます) 0.5 グルコースオキシダーゼ 0.5 100 mM トロロックス (エタノールに溶解) 1 GLOX バッファー 50 * 新しくするたびに、氷の上を準備、2-3 時間の 4 ° C で保存できます。 表 1。バッファーとメディア

Discussion

ここで提示されたプロトコルその他公開されている smFISH プロトコル2,3,21,22,23から派生した、酵母のひずみ背景 SK1 用に最適化されました。携帯番号、固定期間、遠心分離速度と期間、消化期間、消化バッファー、プローブの濃度および交配バッファー最適化されたパラメーターが含まれています。交配の温度や時間などの他のパラメーターが最適化されていません。このセクションでは、任意の酵母のひずみ背景および興味の成長条件にこのプロトコルの適応に役立つだろういくつかのメモを共有します。

出芽酵母の細胞壁は細胞壁がプローブの浸透を防ぎますので出芽酵母における高品質 smFISH 画像の取得に対して 1 つの主要な課題です。ザイモリエイスによる細胞壁の不完全な消化力は、プローブと信号の高細胞間変動の非能率的な交配につながります。しかし、過剰消化できる細胞も壊れやすい、洗浄のステップの間に細胞の損失と細胞のイメージングのためのスライドの準備の間に破裂につながる重要です。したがって、消化の時間を最適化することが重要です。時間の量が異なるため同じサンプルの消化によってパイロットの smFISH の実験をお勧めします。細胞の約 80% が非屈折となったとき、我々 は消化を停止された場合私たちのケースでは、最高の smFISH データを得られました。通常、同じ成長条件の異なる遺伝的突然変異系統を似たようなタイミングで消化することができます。ただし、生育条件と出芽酵母における減数分裂のさまざまな段階の間で比較した場合消化の時間が異なります。一度タイミングを決定すると、smFISH の品質、再現できます。注、15 分未満ザイモリエイスの異なるバッチの使用で完了できます消化不良細胞壁合成や組成変異株のも若干消化のタイミングを変更可能性があります。

プローブの最適濃度は、高い信号対雑音比を達成するために必要です。設計し、商業的に私たちの smFISH プローブを購入しました。良いプローブ (多くの場合 20-mers) 35% から 45%、2 塩基プローブや低交差間の最小間隔に至るまで GC の割合が必要です。プローブのリストを生成するメーカーから web ベースのプローブ デザイナーを用いて、オーバー ラップよりも 17 の塩基対のプローブを排除する出芽酵母ゲノムのデータベースで BLAST アルゴリズムに使用私たちから選択する十分な調査があった場合他のゲノムの領域。我々 はこのセットで満足のすべての上記の条件 (20 本) プローブ数が低かったのでNDC80白頭(CF 590) のユニークな地域に焼鈍プローブ セットのためにもっとある蛍光色素 (CAL Fluor 590) を選んだ、(〜 25 プローブ) の製造元の推奨最小数です。製造元の指示に従ってプローブ ソリューションを再構築後、1:10 を行い原液の希釈、-20 ° C で 5 μ 因数で希釈した溶液を保存します。各因数は 1 回だけ使用されました。最適化、1 つはシリアルする必要があります、1:10 からの希釈希釈ソリューションとテスト集中が最高の信号対雑音比が得られます。1: 250、1: 500、1: 1000、および元の在庫から集の希釈系列をお勧めします。私たちの場合、1: 500 希釈倍率結果 CF 590 および Q 670 の両方のプローブ セットのため、最高の信号対雑音比。

最適な固定時間も出芽酵母で成功した smFISH のため重要です。その一晩の固定は 4 ° C、ある我々 は、一貫性と減数分裂のサンプルの smFISH 結果の品質を大幅に向上、20 分間室温で固定するのではなく。我々 がテストしていませんがどのように一晩固定の植物サンプルに影響を与えるかもしれない、この成長条件、室温での固定がうまくいきました。したがって、新種の成長条件 smFISH プロトコルを最適化して、お勧めします室温で短い固定時間から始まると信号の高い変動が発生した場合、固定時間を増やします。

他公開プロトコル3,22,23と比較して、我々 のプロトコルは、消化と交配時 VRC の高濃度の間に RNase 阻害剤 VRC を使用します。VRC のこれらの 2 つの手順を加えて改善 smFISH 結果の一貫性おそらくより良いザイモリエイス ミックス (酵素の粗抽出物から精製した、RNase を含めることができますが導入される可能性がありますのヌクレアーゼ活性に対する RNA 分子を保持します。汚染物質)。したがって、プロトコル最適化の VRC のさらに高い濃度の記載されている VRC の量を使用をお勧めします。

細胞のかなりの部分はバッファー B とホルムアミド洗浄バッファーで洗浄のステップ中に失われます。セル損失を減らすためには、1 つは遠心分離速度を増加可能性があります。私たちのケースでバッファー B 中に我々 のサンプルをペレットに高速 (21,000 x g) を使用して大幅に削減セル損失を洗います。ただし、セルにザイモリエイス消化後非常に壊れやすい、遠心分離速度の変更は推奨されません。代わりに、ホルムアミド洗浄バッファーで洗浄中に細胞のペレットを助ける米国科学から低付着の管の使用をおすすめします。全体的にみて、私達のプロトコルは一貫して効率的なイメージングのため十分な高密度の細胞の膜を生成できます。通常は、7 の視野を得られるはず > 130、定量化のため適当な細胞。

最後に、最適パラメーターおよび画像解析から必要な出力を決定することが重要です。公開されている解析プログラムは smFISH スポットを検出、一般的バック グラウンド信号を削除するガウス カーネルを使用して raw 画像をフィルターし、画像2,17の各セットで使用する信号対雑音比を決定してもらいます。残念ながら、現在、適切なパラメーターが決定する単一の標準はなく、だからこれらさまざまな設定のいくつかの実証的な検証が必要です。これらの各手順に必要なパラメーターを設定するには、繰り返し別のパラメーターのセットを入力し、どれだけ各セットから得られた結果と一致するいくつかの代表的な細胞で手動カウントからチェックが必要です。1 組のパラメーターが見つかると、一度は、生育条件や遺伝的背景にもかかわらず得られた画像のほとんどに使えます。

さらに、1 つは smFISH 画像の最大強度投影できる定量化22の前に実行する場合をテストできます。この手順では、スポットの検出アルゴリズムを簡素化し、彼らの細胞レベル下のローカリゼーションなど、個々 のスポットに関するいくつかの潜在的に有用な情報を犠牲にしても、撮像時間を大幅に短縮します。私たちのケースでNDC80遺伝子によって生成される mRNA の分子の数はこの処理 (新進の転写物酵母3、7のためか珍しく) 後、スポットは分かれても十分に低かった。共局在解析が重要な場合は、解析パイプラインの共存を評価するためにそれぞれのチャネル内の各 smFISH スポットの場所を決定する必要があります。特定の質問に応じて求められている、各スポットの強度などの他の情報も詳しく分析するためパイプラインから抽出する必要があります。プロトコル キーを最適化する手順し、画像解析パイプラインは興味のある質問を研究する smFISH データの高品質を得ることが重要です。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

アン ・ ドッドソン感謝やステファニーハインリッヒ smFISH プロトコルを最適化する方法についてのアドバイスをザビエルの Darzacq 解析プラットフォーム、統計解析に関する提案 Haiyan 黄を助けます。この作品は、ダイムの月 (5-FY15-99)、ピュー慈善信託 (00027344)、デイモン ・ ラニアンがん研究振興財団 (35-15) と EÜ、グレン財団、NSF の大学院研究奨学金の付与号からの資金によって支えられました。JC に DGE 1106400。

Materials

BSA, RNase-free (50 mg/mL) Ambion AM2616 Store at -20 °C.
Catalase Sigma C3515 Store at 4 °C for short-term. Vortex before use.
DAPI Sigma D9564 Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light.
50% Dextran Sulfate Milli Pore S4030 Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.
E. coli tRNA Sigma R4251 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Ethanol (100%, 200 proof) various Flammable.
37% Formaldehyde Fisher F79-500 Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.
Formamide Ambion AM9342 Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. 
Glucose various Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water.
Glucose oxidase Sigma G2133 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.
Nuclease-free water Ambion AM9932 Store at room temperature.
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) various Store at room temperature.
Probe library, diluted in TE, pH 8.0  Biosearch Technologies Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. 
Sorbitol various Store at room temperature.
20X SSC Ambion AM9763 Store at room temperature.
TE, pH 8.0 Ambion AM9849 Store at room temperature.
1 M Tris, pH 8.0 Ambion AM9856 Store at room temperature.
Trolox Sigma 238813 Store at -20 °C in aliquots.
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) NEB S1402S Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.
Zymolyase 100T MP Biomedicals 08320932 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Low-adhesion tubes USA Scientific 1415-2600 Store at room temperature.
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References

  1. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  2. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  3. Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).
  4. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  5. Vargas, D. Y., et al. Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing. Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).
  6. Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).
  7. Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).
  8. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
  9. Senecal, A., et al. Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  10. Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).
  11. Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ. Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).
  12. Ginart, P., et al. Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant. Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).
  13. Long, R. M., et al. Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. Science. 277 (5324), 383-387 (1997).
  14. Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility. Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).
  15. Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses. RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).
  16. Chen, J., et al. Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA. eLife. 6, e27417 (2017).
  17. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  18. Brar, G. A., et al. High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling. Science. 335 (6068), 552-557 (2012).
  19. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  20. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  21. Dodson, A. E., Rine, J. Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae. eLife. 4, e05007 (2015).
  22. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).
  23. Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. Imaging single mRNA molecules in yeast. Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).

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Chen, J., McSwiggen, D., Ünal, E. Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis. J. Vis. Exp. (135), e57774, doi:10.3791/57774 (2018).
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