Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

As cinases são enzimas que tranferem grupos fosfato do ATP para substratos e regulam muitos processos celulares. Esta fosforilação é reversível, rápido, adiciona duas cargas negativas e armazena energia livre e é uma das modificações posttranslational mais comuns usadas pelas células. Cdk1, que é também conhecido como o homólogo de proteína 2 de ciclo de divisão celular (cdc2) é um controlador mestre do ciclo celular em todos os eucariontes^1,2,3,4,5e fosforila um Estima-se 8-13% do proteome^6,7.

Enquanto estudos recentes de proteomic identificaram muitos sítios de fosforilação de proteínas, na maioria dos casos, a quinase responsável por essas modificações é desconhecida. O número de conhecidos destinos Cdk1, particularmente em células humanas é baixo⁷. A identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específico é importante, como permite estudos mecanicistas que estabelecem como Cdk1 controla o ciclo celular. Regulação do ciclo celular é importante para a segregação do cromossomo fiel e divisão celular, e uma miríade de processos celulares precisam ocorrer para apoiar esta importante função fisiológica. Isso inclui travar a transcrição e tradução antes do início da mitose, bem como uma reorganização dramática na estrutura celular e organização, tais como a desmontagem do envoltório nuclear, condensação do cromossomo e montagem do fuso mitótico. Desregulamentação e erros nestes processos causam câncer, defeitos de nascimento ou morte celular mitótica. Inibidores específicos de Cdk1 como RO-3306 foram desenvolvidos⁸, que fornece ferramentas poderosas para estudos funcionais, e alguns destes inibidores são atualmente em ensaios clínicos para tratamento de câncer (veja⁹ para revisão).

Aqui, descrevemos um em vitro quinase que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicos. Neste ensaio, comercialmente disponível humana Cdk1/cyclin B é usado para fosforilar um alvo purificado da proteína em vitro. Fosforilação do substrato aumenta a sua massa e adiciona duas cargas negativas; Portanto, fosforilação sucesso é confirmada por um deslocamento para cima da banda gel de proteína em SDS-PAGE. Sites específicos de Cdk1 fosforilação são posteriormente identificados por análise de espectrometria de massa da proteína em vitro fosforilada. Para ajudar com delineamento experimental, revisamos também ferramentas computacionais e referências para a previsão dos sítios de fosforilação Cdk1 específica da sequência de proteínas. Além disso, podemos também descrever protocolos de purificação que o rendimento de preparações de proteína altamente puro e homogêneo apropriadas para o ensaio da quinase. Finalmente, os sítios de fosforilação identificado devem ser verificados por estudos funcionais, e um ensaio simples é descrito aqui para essa finalidade. Combinada, esta é uma abordagem muito poderosa que produz sites de fosforilação Cdk1 específicos e permite estudos mecanicistas em como Cdk1 controla o ciclo celular^7,10,11. Desde que esse método se baseia em proteínas purified, pode ser aplicado a quaisquer resultados fiáveis modelo organismo e rendimentos. No entanto, é recomendada verificação funcional da fosforilação obtidos sites em vitro , como as células têm mecanismos reguladores adicionais no lugar, como modificações posttranslational, parceiros de interação ou localização celular que pode processar sites fosforilação acessível ou inacessível para reconhecimento por Cdk1.

Cdk1 reconhece um site de fosforilação de consenso que consiste em arquivos em (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), onde X é qualquer resíduo e uma serina ou treonina é o sítio de fosforilação. Especialmente importante para o reconhecimento é a presença da prolina na posição + 1. Além disso, os resíduos básicos são preferidos nas posições + 2 ou + 3, com a maioria dos sites de fosforilação Cdk1 específicas contendo um Lys ou Arg + a 3 posição^6,12.

Ativação de Cdk1 é fortemente regulamentada e leva ao aparecimento de mitose^1,2,3,4,5. A atividade de quinases cyclin-dependente em geral depende de sua associação com ciclinas distintas (ciclina A, B, C, D e E em seres humanos), que são expressos em níveis durante todo o ciclo celular¹³de oscilação. Expressão de Cdk1 é constante em todo o ciclo celular e a regulação da sua actividade baseia-se na sua associação com as subunidades reguladoras cyclin A e cyclin B^5,13,14,15, como bem como modificações borne-translational. Formação do complexo Cdk1/cyclin B é necessária para a quinase ativação^{5,14,15,16,17,18}. Na fase G2, ciclina B é traduzido no citoplasma e importada para o núcleo onde se liga ao Cdk1^{5,14,15,16,17,18}; no entanto, B Cdk1/cyclin realiza inativada por fosforilação em resíduos Thr14 e Tyr15 pelos humano Cdk1-inibitório quinases Myt1 (quinase cdc2-inibitório de membrana-associado tirosina e treonina-específico) e Wee1, respectivamente,^{19, 20,21}. Na fase tardia do G2, desfosforilação de Thr14 e Tyr15 por divisão celular ciclo 25 fosfatase (cdc25) ativa a atividade da quinase do complexo Cdk1/cyclin B e desencadeia o início da mitose^{12,14, 18 , 20 , 22 , 23}. a fosforilação de Thr161 também é necessária para ativação de Cdk1/cyclin B e é mediada por Cdk7, o Cdk-activação da quinase (CAK)¹⁸. Degradação da ciclina B em anáfase inactivates Cdk1, permitindo a saída de mitose^24,25. Ativação de Cdk1/cyclin B, portanto, é um processo complicado. O protocolo aqui apresentado é realizado com b de Cdk1/cyclin comercialmente disponível. Durante a expressão recombinante deste complexo em células de inseto, é ativado na vivo por quinases endógena^14,20 e permanece ativa no estado purificado. Resultante ativo, recombinante humana Cdk1/cyclin B é apropriado para ensaios de quinase em vitro .

Aqui, descrevemos um protocolo para a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicas do centrômero humano proteína F (CENP-F)¹⁰. CENP-F é uma proteína de cinetócoro que reside no núcleo durante a interfase (G1 e S-fase) e é exportada para o citosol no G2 fase^26,,^27,28 em uma maneira dependente Cdk1^{10, 11}. localização nuclear é conferida por um bipartido cNLS²⁶. cNLSs são reconhecidos pelo transporte nuclear factor carioferinas α, que facilita, em conjunto com carioferinas β e RanGDP, a importação de cNLS-carga para o núcleo de²⁹. A exportação nuclear na fase G2 é facilitada através de uma exportação desconhecido caminho¹⁰. Uma vez que o CENP-F reside no citosol, ele é recrutado para o envelope nuclear e recrutas por sua vez o motor proteína Dineína complexo^30,31. Esta via é importante posicionar o núcleo respectivo para a centrossoma durante os estágios iniciais da montagem do fuso mitótico de forma dependente de Dineína, que é importante para o timing correto de entrada mitótica e para um processo fundamental no cérebro desenvolvimento de^31,30,32. Começando na fase G2, CENP-F é também montado no cinetócoro onde tem papéis importantes para cromossomo fiel segregação^{27,28,33,34,35} . Um passo chave reguladora destas vias é a exportação nuclear do CENP-F na fase G2, que é dependente de Cdk1^10,11. Descrevemos aqui um protocolo para a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicos no cNLS do CENP-F. Phosphomimetic mutações desses sites devagar importação nuclear do CENP-F, sugerindo que B Cdk1/cyclin diretamente regula a localização celular do CENP-F por fosforilação de sua cNLS¹⁰.

Em geral, este ensaio da quinase em vitro permite a identificação de substratos específicos para proteínas quinase Cdk1. Purified alvo são fosforilada em vitro pelo complexo B Cdk1/cyclin comercialmente disponível e os locais de fosforilação posteriormente são identificados por espectrometria de massa. A identificação dos sítios de fosforilação específica Cdk1 suporta mecanicistas estudos que revelam como a Cdk1 controla o ciclo celular.