Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test
Summary
Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono attivato nella fase G2 del ciclo cellulare e regola molte vie cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per un’analisi in vitro della chinasi con Cdk1, che permette l’identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici per stabilire obiettivi cellulari di questa chinasi importante.
Abstract
Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono un master controller per il ciclo cellulare in tutti gli eucarioti e fosforilano un stimato 8-13% del proteoma; Tuttavia, il numero degli obiettivi identificati per Cdk1, particolarmente in cellule umane è ancora basso. L’identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici è importante, in quanto forniscono meccanicistici intuizioni come Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Regolazione del ciclo cellulare è fondamentale per la segregazione del cromosoma fedele, e difetti in questo processo complicato portano ad aberrazioni cromosomiche e cancro.
Qui, descriviamo una in vitro analisi della chinasi che è utilizzata per identificare siti di fosforilazione Cdk1 specifici. In questo saggio, una proteina purificata è fosforilata in vitro di commercialmente disponibile umano Cdk1/ciclina B. Successful fosforilazione è confermata da SDS-PAGE, e siti di fosforilazione sono successivamente identificate mediante spettrometria di massa. Descriviamo anche protocolli di purificazione che producono preparati proteici altamente puro e omogeneo adatti per l’analisi della chinasi e un’analisi obbligatoria per la verifica funzionale dei siti di fosforilazione identificati, che l’interazione tra le sonde un segnale di localizzazione nucleare classica (cNLS) e relativo trasporto nucleare del ricevitore karyopherin α. Per aiutare con disegno sperimentale, passiamo in rassegna gli approcci per la stima dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici da sequenze proteiche. Insieme questi protocolli presentano un approccio molto potente che produce siti di fosforilazione Cdk1 specifici e consente studi meccanicistici in modo Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Poiché questo metodo si basa su proteine purificate, può essere applicato a qualsiasi modello organismo e rendimenti risultati affidabili, specialmente se combinata con studi funzionali delle cellule.
Introduction
Le chinasi sono enzimi che regolano molti processi cellulari e trasferiscono gruppi fosfato da ATP su substrati. Questa fosforilazione è reversibile, veloce, aggiunge due cariche negative e memorizza l’energia libera ed è uno delle modificazioni post-traduzionali più comune usate dalle cellule. CDK1, che è anche conosciuto come omologo di proteina 2 ciclo di divisione cellulare (cdc2) è un master controller per il ciclo cellulare in tutti gli eucarioti1,2,3,4,5e fosforila un orario 8-13% del proteoma6,7.
Mentre gli studi di proteomica recenti hanno identificato molti siti di fosforilazione di proteine, nella maggior parte dei casi, la chinasi responsabile di queste modificazioni è sconosciuta. Il numero di bersagli Cdk1 noti, in particolare nelle cellule umane è basso7. L’identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici è importante, in quanto consente studi meccanicistici che stabiliscono come Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Regolazione del ciclo cellulare è importante per la segregazione del cromosoma fedele e la divisione cellulare, e una miriade di processi cellulari devono verificarsi per supportare questa importante funzione fisiologica. Questo include arrestare trascrizione e traduzione prima dell’inizio della mitosi, come pure una riorganizzazione drammatica nella struttura cellulare e organizzazione, ad esempio lo smontaggio dell’involucro nucleare, condensazione cromosomica, Assemblea del fuso mitotico e. Deregolamentazione e gli errori in questi processi causano cancro, difetti di nascita o morte cellulare mitotica. Inibitori specifici di Cdk1 come RO-3306 sono stati sviluppati8, che forniscono potenti strumenti per studi funzionali, e alcuni di questi inibitori sono attualmente nei test clinici per il trattamento del cancro (Vedi9 per la revisione).
Qui, descriviamo una in vitro analisi della chinasi che permette l’identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici. In questo test, disponibili in commercio umano Cdk1/ciclina B è utilizzato per fosforilare un obiettivo purificato della proteina in vitro. Fosforilazione di un substrato aumenta la sua massa e aggiunge due cariche negative; di conseguenza, fosforilazione successo è confermata da uno spostamento verso l’alto della band gel di proteina su SDS-PAGE. Siti di fosforilazione CDK1 specifici sono successivamente identificati dall’analisi di spettrometria di massa della proteina in vitro fosforilato. Per aiutare con disegno sperimentale, esaminiamo anche strumenti computazionali e riferimenti per la previsione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici dalla sequenza della proteina. Inoltre, descriviamo anche protocolli di purificazione che producono preparati proteici altamente puro e omogeneo adatti per l’analisi della chinasi. Infine, i siti di fosforilazione identificata devono essere verificati da studi funzionali e un’analisi di associazione semplice è descritto qui per tale scopo. Combinato, questo è un approccio molto potente che produce siti di fosforilazione Cdk1 specifici e consente studi meccanicistici in modo Cdk1 controlla il ciclo cellulare7,10,11. Poiché questo metodo si basa su proteine purificate, può essere applicato a qualsiasi risultati affidabili di modello, organismo e rendimenti. Tuttavia, è consigliabile verifica funzionale dei siti fosforilazione ottenuti in vitro , come le cellule hanno ulteriori meccanismi di regolamentazione in vigore, come modifiche di posttranslational, partner di interazione o localizzazione cellulare che può rendere siti di fosforilazione accessibile o inaccessibile per il riconoscimento di Cdk1.
CDK1 riconosce un sito di fosforilazione di consenso che si compone di (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), dove X è ogni residuo e una serina o treonina è il sito di fosforilazione. Particolarmente importante per il riconoscimento è la presenza della prolina in posizione + 1. Inoltre, i residui di base sono preferiti nelle posizioni + 2 o + 3, con la maggior parte dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici contenenti un Lys o Arg presso il + 3 posizione6,12.
Attivazione di Cdk1 è strettamente regolato e conduce all’inizio della mitosi1,2,3,4,5. L’attività di chinasi ciclina-dipendenti in generale dipende dalla loro associazione con distinte cicline (ciclina A, B, C, D ed E in esseri umani), che si sono espressi a livelli durante il ciclo cellulare13di oscillazione. L’espressione CDK1 è costante attraverso il ciclo cellulare e la regolazione della sua attività si basa sulla sua associazione con la subunità regolatorie cicline A e ciclina B5,13,14,15, come Beh come modificazioni post-traduzionali. Formazione del complesso Cdk1/ciclina B è necessaria per le chinasi attivazione5,14,15,16,17,18. Nella fase G2, ciclina B è tradotto nel citosol e importato nel nucleo dove si lega a Cdk15,14,15,16,17,18; Tuttavia, Cdk1/ciclina B è detenuto inattivato da fosforilazione in residui Thr14 e Tyr15 dalla chinasi Cdk1-inibitorio umani Myt1 (chinasi cdc2-inibitorio di membrana-collegato della tirosina e treonina-specifiche) e Wee1, rispettivamente19, 20,21. La fine della fase G2, defosforilazione di Thr14 e Tyr15 dalla divisione cellulare ciclo 25 fosfatasi (cdc25) attiva l’attività della chinasi del complesso Cdk1/cyclin B e innesca l’inizio della mitosi12,14, 18 , 20 , 22 , 23. fosforilazione di Thr161 è anche necessaria per l’attivazione di chinasi ciclina Cdk1/B ed è mediato da Cdk7, l’attivazione di Cdk chinasi (CAK)18. Degradazione del cyclin B in anafase inattiva Cdk1, permettendo l’uscita dalla mitosi24,25. L’attivazione della chinasi Cdk1/ciclina B è pertanto un processo complicato. Il protocollo presentato qui viene eseguito con commercialmente disponibili Cdk1/ciclina B. Durante espressione ricombinante di questo complesso in cellule di insetto, essa è attivata in vivo di chinasi endogene14,20 e resta attiva nello stato purificato. La risultante attiva, ricombinante umano Cdk1/ciclina B è adatto per le analisi in vitro della chinasi.
Qui, descriviamo un protocollo per l’identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici nel centromero umano proteina F (CENP-F)10. CENP-F è una proteina di cinetocore che risiede nel nucleo durante la maggior parte di interfase (G1 e fase S) e viene esportata nel citosol in G2 fase26,27,28 in un dipendente Cdk1 modo10, 11. localizzazione nucleare è conferita da un bipartito cNLS26. cNLSs sono riconosciuti dal trasporto nucleare di fattore α karyopherin, che facilita, insieme a β di karyopherin e RanGDP, l’importazione del cNLS-carico nel nucleo29. Export nucleare nella fase G2 è facilitata tramite un percorso di esportazione sconosciuto10. Una volta CENP-F risiede nel citosol, esso viene reclutato alla busta nucleare e reclute a sua volta il motore della proteina dineina complesso30,31. Questo percorso è importante posizionare il nucleo rispettivo per il centrosoma durante le fasi iniziali di assemblaggio del fuso mitotico in modo dineina-dipendente, che è importante per la corretta fasatura della voce mitotica e per un processo fondamentale nel cervello sviluppo30,31,32. A partire dalla fase G2, CENP-F è anche assemblati nel cinetocore dove ha ruoli importanti per fedele cromosoma segregazione27,28,33,34,35 . Un passo fondamentale di regolamentazione di queste vie è l’esportazione nucleare di CENP-F nella fase G2, che è dipenda Cdk110,11. Descriviamo qui un protocollo per l’identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici in cNLS CENP-f. Le mutazioni di Phosphomimetic di questi siti rallentano importazione nucleare di CENP-F, suggerendo che Cdk1/ciclina B regola direttamente la localizzazione cellulare di CENP-F da fosforilazione di sua cNLS10.
Nel complesso, questa analisi in vitro della chinasi permette l’identificazione di substrati specifici per proteine chinasi Cdk1. depurata bersaglio sono fosforilati in vitro di commercialmente disponibile Cdk1/ciclina B complesso e i siti di fosforilazione Successivamente vengono identificati mediante spettrometria di massa. L’identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici supporta studi meccanicistici che rivelano come Cdk1 controlla il ciclo cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
La nostra analisi in vitro della chinasi sono un metodo molto potente per identificare bersagli molecolari per la chinasi Cdk1, che è un regolatore matrice del ciclo cellulare e regola molti processi cellulari importanti. Il metodo determina se una proteina purificata è un substrato per Cdk1 e permette l’identificazione di siti di fosforilazione specifici. Questo facilita gli studi meccanicistici per regolazione di processi cellulari da fosforilazione attraverso Cdk1.
Il fattore pi?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California a Berkeley per analisi di spettrometria di massa e utili commenti. Si ringrazia il Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, istituti per le scienze biologiche, Accademia delle scienze cinese, Shanghai, Cina per la fornitura di un costrutto di CENP-F full-length. Infine, ringraziamo Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan e Dr. Christof Grewer at Binghamton University per l’accesso alle apparecchiature. Questa ricerca è stata finanziata dalla Fondazione di ricerca per la State University di New York e il dipartimento di chimica, State University of New York at Binghamton.
Materials
| 2800 ml baffled Fernbach flask | Corning | 44232XL | |
| ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-25 | |
| ATP | Fisher Scientfiic | BP413-25 | |
| benzamidine hydrochloride | Millipore Sigma | B6506-25 | |
| bottletop filter | Corning | 431161 | |
| Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL | New England Biolabs | P6020 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | EMD Millipore | 14-450 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | Invitrogen | PV3292 | |
| Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer | New England Biolabs | P6020 | |
| CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid | Available upon request. | ||
| centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor | Thermo Scientific | 10033-778 | |
| centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes | EMD Millipore | UFC900324 | |
| chlorampenicol | Gold Biotechnology | C-105-100 | |
| D/L methionine | Agros Organics / Fisher | 125650010 | |
| desalting pipet tips: Zip tips | Millipore Sigma | ZTC18S008 | |
| disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm | Biorad | 7321010 | |
| dithiothreitol | Gold Biotechnology | DTT50 | |
| E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain | EMD Millipore | 71403 | |
| electrospray ionization Fourier transform ion | Bruker Amazon | Apex III | |
| cyclotron resonance mass spectrometer | |||
| electrospray ionization ion trap mass spectrometer | Bruker Amazon | custom | |
| fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy | Thermo Scientific | 97040-276 | |
| FPLC system: Äkta Pure FPLC | GE Healthcare | 29032697 | |
| Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| glutathione agarose | Pierce | 16101 | |
| glutathione, reduced | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| incubation shaker: multitron shaker | Infors | I10102 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| kanamycin | Gold Biotechnology | K-120-25 | |
| karyopherin α pet-28a pres plasmid | Available upon request. | ||
| Luria Bertani medium | Fisher Scientfiic | BP1426-2 | |
| microcentrifuge 5418R, refrigerated | Eppendorf | 5401000013 | |
| microtubes (0.5 ml) | Eppendorf | 30121023 | |
| microtubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30120086 | |
| Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel | Millipore Sigma | P6611-100ml | |
| pGEX-6P-1 plasmid | Millipore Sigma | GE28-9546-48 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Gold Biotechnology | P470-10 | |
| PS protease: PreScission protease | GE Healthcare | 27084301 | |
| Phos-tag acrylamide | Wako Pure Chem. Ind. | 304-93521 | |
| reduced gluthathione | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) | Fisher Scientfiic | 055291D | |
| site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning | Agilent | 210518 | |
| Site-Directed Mutagenesis Kit | |||
| sonifier: Branson S-250D sonifier | Branson | 15 338 125 | |
| Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) | Spectrum Labs | 08 670B | |
| swing out rotor TX-1000 | Thermo Scientific | 10033-778 |
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