Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Kinases zijn enzymen die overdracht van fosfaat groepen van ATP op substraten en veel cellulaire processen regelen. Deze fosforylatie is omkeerbaar, snel, voegt twee negatieve ladingen, vrije energie worden opgeslagen en is een van de meest voorkomende posttranslationele modificaties gebruikt door cellen. Cdk1, die ook bekend staat als celdeling cyclus eiwit 2 homolog (cdc2) is een meester-controller voor de celcyclus in alle eukaryoten^1,2,3,4,5, en kinaseenzym een naar schatting 8-13% van de Proteoom^6,7.

Terwijl recente proteomic studies dat veel fosforylatie plaatsen in eiwitten, in de meeste gevallen gebleken is de kinase verantwoordelijk voor deze wijzigingen onbekend. Het aantal bekende Cdk1 doelen, met name in menselijke cellen is laag⁷. De identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites is belangrijk, omdat hierdoor mechanistische studies die stellen hoe Cdk1 controleert de celcyclus. Celcyclus-verordening is belangrijk voor trouwe chromosoom segregatie en celdeling, en een groot aantal cellulaire processen moeten optreden ter ondersteuning van deze belangrijke fysiologische functie. Dit omvat stoppen transcriptie en vertaling vóór het begin van de mitose, evenals een dramatische reorganisatie in cellulaire structuur en organisatie, zoals de demontage van de nucleaire envelop chromosoom condensatie en de mitotische spindel vergadering. Deregulering en fouten in deze processen veroorzaken kanker, aangeboren afwijkingen of mitotische celdood. Specifieke remmers van Cdk1 zoals RO-3306 waren ontwikkelde⁸, die bieden krachtige hulpprogramma’s voor functionele studies, en sommige van deze remmers zijn momenteel in klinische proeven voor de behandeling van kanker (Zie⁹ voor beoordeling).

Hier beschrijven we een in vitro kinase bepaling die het mogelijk de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites maakt. In deze test, wordt commercieel beschikbare menselijke Cdk1/cycline B gebruikt om een gezuiverde doel eiwit in vitrophosphorylate. Fosforylering van een substraat verhoogt zijn massa en voegt twee negatieve ladingen; Dus, succesvol fosforylatie wordt bevestigd door een opwaartse verschuiving van de band van de gel eiwit op SDS-pagina. Cdk1-specifieke fosforylatie sites worden vervolgens geïdentificeerd door analyse van de Spectrometrie van de massa van het eiwit in vitro phosphorylated. Steun met experimenteel design, bekijken we ook computerhulpmiddelen en referenties voor de voorspelling van Cdk1-specifieke fosforylatie sites van de eiwit-reeks. Daarnaast beschrijven we ook zuivering protocollen die zeer zuiver en homogene eiwit preparaten geschikt voor de kinase assay opleveren. Tot slot, de geïdentificeerde fosforylatie sites moeten worden gecontroleerd door functionele studies, en een eenvoudige bindende test wordt hier beschreven voor dat doel. Gecombineerd, is dit een zeer krachtige aanpak waarmee de opbrengsten Cdk1-specifieke fosforylatie sites en kunnen mechanistisch onderzoek naar hoe Cdk1 de celcyclus^{7,10,11 controleert}. Aangezien deze methode is gebaseerd op zuivere eiwitten, kan het worden toegepast op elk model organisme en opbrengsten betrouwbare resultaten. Functionele controle van de verkregen fosforylatie sites in vitro wordt echter aanbevolen, zoals cellen extra regulerende mechanismen, zoals posttranslationele modificaties, interactie partners of cellulaire lokalisatie op plek hebben die fosforylering sites kan toegankelijk of ontoegankelijk voor erkenning door Cdk1 maken.

Cdk1 herkent een consensus fosforylatie site die uit (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), bestaat waarbij X een residu en een serine of threonine de site van fosforylering is. Vooral belangrijk voor erkenning is de aanwezigheid van de proline in de + 1 positie. Bovendien, fundamentele residuen in de + 2 of + 3 posities zijn voorkeur, met de meeste Cdk1-specifieke fosforylatie sites met een Lys of Arg op de + 3 positie^6,12.

Activering van Cdk1 strak geregeld is en leidt tot het begin van de mitose^1,2,3,4,5. De activiteit van cycline-afhankelijk kinases is in het algemeen afhankelijk van hun associatie met verschillende cyclinen (cycline A, B, C, D en E bij de mens), die op het niveau van de celcyclus¹³oscillerende zijn uitgedrukt. Cdk1 expressie is constant over de celcyclus en de regulering van de activiteit is afhankelijk van zijn associatie met de regelgevende subeenheden A cycline en cycline B^5,13,14,15, als goed als posttranslationele modificaties. Vorming van het B-complex met Cdk1/cycline is vereist voor de kinase activation^{5,14,15,16,17,18}. In de G2-fase, is cycline B vertaald in het cytosol en geïmporteerd in de kern waar het bindt aan de Cdk1^{5,14,15,16,17,18}; echter de Cdk1/cycline B geïnactiveerd door fosforylering op residuen van Thr14 en Tyr15 door de menselijke Cdk1-remmende kinases Myt1 (membraan-geassocieerde tyrosine – en threonine-specifieke cdc2-remmende kinase) en Wee1, respectievelijk^{19, wordt gehouden 20,21}. In de late fase van de G2, defosforylerings van Thr14 en Tyr15 door celdeling cyclus 25 fosfatase (cdc25) het kinaseactiviteit van de Cdk1/cycline B complex activeert en triggers van de initiatie van mitose^{12,14, 18 , 20 , 22 , 23}. phosphorylation van Thr161 is ook vereist voor Cdk1/cycline B activering en wordt gemedieerd door Cdk7, de Cdk-activeren kinase (CAK)¹⁸. Afbraak van cycline B in anafase inactiveert Cdk1, zodat de uitgang van mitose^24,25. Activering van Cdk1/cycline B is dus een ingewikkeld proces. Het protocol hier gepresenteerd wordt uitgevoerd met verkrijgbare Cdk1/cycline B. Tijdens de recombinante uitdrukking van dit complex in insect cellen, het is geactiveerd in vivo door endogene kinases^14,20 en blijft actief in de gezuiverde staat. De resulterende actief, recombinante menselijke Cdk1/cycline B is geschikt voor in vitro kinase testen.

Hier beschrijven we een protocol voor de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites in de menselijke centromeer eiwit F (RETOREN-F)¹⁰. RETOREN-F is een kinetochoor eiwit dat zich bevindt in de kern gedurende het grootste deel van de interfase (G1 en S-fase) en wordt geëxporteerd naar het cytosol in de G2 fase^26,27,28 in een Cdk1-afhankelijke wijze^{10, 11}. nucleaire localisatie wordt verleend door een bipartiete cNLS²⁶. cNLSs worden herkend door de nucleaire vervoer factor karyopherin α, dat, samen met karyopherin β en RanGDP, de invoer van cNLS-cargo in de nucleus^{29 vergemakkelijkt}. Nucleaire export in de G2-fase wordt bevorderd via een onbekende export traject¹⁰. Zodra RETOREN-F in het cytosol woont, het wordt gerekruteerd om de nucleaire envelop en op zijn beurt werft de motor eiwit complex dynein^30,31. Dit traject is belangrijk om de positie van de respectieve aan de centrosoom kern tijdens de eerste stadia van de mitotische spindel vergadering in een dynein-afhankelijke manier, dat belangrijk voor de juiste timing van de mitotische ingang en voor een fundamentele proces in de hersenen is ontwikkeling^30,31,32. Beginnend in de G2-fase, is RETOREN-F ook samengevoegd tot de kinetochoor waar het heeft een belangrijke rol voor trouwe chromosoom segregatie^{27,28,33,34,35} . Een belangrijke regelgevende stap van deze trajecten is de nucleaire export van RETOREN-F in de G2-fase, die afhankelijk is van Cdk1^10,11. We beschrijven hier een protocol voor de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites in de cNLS van RETOREN-F. Phosphomimetic mutaties van deze sites is vertragen van nucleaire invoer van RETOREN-F, suggereren dat Cdk1/cycline B direct cellulaire lokalisatie van RETOREN-F door fosforylering van de cNLS¹⁰regelt.

Globaal, dit kinase in vitro assay maakt het mogelijk de identificatie van specifieke substraten voor de kinase Cdk1. Purified doel eiwitten gefosforyleerd in vitro door de verkrijgbare Cdk1/cycline B-complex en de fosforylatie sites zijn vervolgens worden geïdentificeerd door de Spectrometrie van de massa. De identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites ondersteunt mechanistische studies die onthullen hoe Cdk1 controleert de celcyclus.