Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Киназы являются ферменты, которые регулируют многие клеточные процессы и передачи фосфатные группы от АТФ на субстраты. Этот фосфорилирование является обратимым, быстро, добавляет два отрицательными зарядами и хранит свободной энергии и является одним из наиболее распространенных Посттрансляционная изменений используется клетками. Cdk1, который также известен как гомолога белка 2 цикла деления клеток (cdc2) — это главный контроллер для клеточного цикла в всех эукариот^1,2,3,4,5и фосфорилирует оценкам, 8-13% протеома^6,7.

Хотя последние протеомических исследований выявили многие сайты фосфорилирование белков, в большинстве случаев, ответственных за эти изменения киназы неизвестна. Количество известных Cdk1 целевые показатели, особенно в клетках человека является низкий⁷. Определение участков фосфорилирование Cdk1-конкретных имеет важное значение, как он позволяет механистический исследования, которые устанавливают, как Cdk1 управляет клеточного цикла. Регуляции клеточного цикла важно для верных хромосома сегрегации и деление клеток, и множество клеточных процессов должны произойти для поддержки этой важной физиологические функции. Это включает в себя прекращение транскрипции и трансляции до начала митоза, а также драматические реорганизации в клеточной структуры и организации, например разборка ядерная оболочка, конденсация хромосом и митотического шпинделя собраний. Ошибки в этих процессах и дерегулирование вызывают рак, врожденные дефекты или митотическая клеточной смерти. Специфичные ингибиторы Cdk1 как RO-3306 были развитыми⁸, которые обеспечивают мощные инструменты для функциональных исследований, и некоторые из этих ингибиторов в настоящее время в клинических испытаниях для лечения рака (см.⁹ для обзора).

Здесь мы описываем в vitro киназы assay который позволяет идентифицировать фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов. В этот assay коммерчески доступных человека Cdk1/циклин B используется для фосфорилировать очищенный целевого белка в пробирке. Фосфорилирование субстрата увеличивает его массы и добавляет два негативных обвинения; Таким образом успешные фосфорилирование подтверждается сдвигу вверх группы гель белка на SDS-PAGE. Впоследствии фосфорилирование Cdk1-конкретные сайты идентифицируются по масс-спектрометрии анализа белка в vitro фосфорилированных. Для помощи с экспериментального дизайна, мы также обзор вычислительных средств и ссылки для прогнозирования фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов из последовательности белка. Кроме того мы также описывают протоколы очищения, которые дают очень чистые и однородные белковых препаратов подходит для assay киназы. Наконец выявленных фосфорилирование сайты должны быть проверены на функциональные исследования, и простой привязки пробирного описан здесь для этой цели. Комбинированные, это очень мощный подход, который дает фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов и позволяет механистический исследования в как Cdk1 управляет клеточного цикла^7,10,11. Поскольку этот метод опирается на очищенных белков, он может применяться к любой модели организма и дает надежные результаты. Однако, рекомендуется функциональной верификации полученных фосфорилирование сайтов в пробирке , поскольку клетки имеют дополнительные механизмы регулирования в месте, например Посттрансляционная модификаций, взаимодействия партнеров или клеточной локализации, может сделать фосфорилирование сайты доступными или недоступными для признания Cdk1.

Cdk1 признает консенсус фосфорилирование сайт, который состоит из (Ser/Чет-Pro-X-Lys/Arg), где X — это остатки и серина или треонин сайт фосфорилирования. Особенно важное значение для признания является наличие пролина в положении + 1. Кроме того, основные остатков предпочтительны в позиции + 2 и + 3, большинство сайтов фосфорилирование Cdk1-конкретным, содержащий Lys или Arg на + 3 позиция^6,12.

Активация Cdk1 жестко регулируется и приводит к возникновению митоз^1,2,3,4,5. Деятельность циклин зависимых киназ в целом зависит от их ассоциации с собственный циклинов (циклин A, B, C, D и E в организме человека), которые выражаются в колебательных уровнях на протяжении клеточного цикла¹³. Выражение Cdk1 является постоянным по всей клеточного цикла и регулирование своей деятельности опирается на его связь с нормативной субблоков циклин A и циклин B^5,13,14,15, как Ну как столб-поступательные изменения. Формирование комплекса Cdk1/циклин B требуется для киназы активации^{5,14,,1516,17,18}. В G2 фазе циклин B переведен в цитозоле и импортированы в ядре, где он привязывается к Cdk1^{5,14,,1516,17,18}; Однако Cdk1/циклин B проводится инактивированных фосфорилирования в остатки Thr14 и Tyr15 на человека Cdk1-тормозящий киназы Myt1 (связанный мембранами перст-тирозин треонин конкретных и cdc2-тормозящий киназы) и Wee1, соответственно^{19, 20,21}. В конце фазы G2 дефосфорилирование Thr14 и Tyr15 путем деления клеток цикла 25 фосфатазы (cdc25) активизирует деятельность киназы Cdk1/циклин B комплекса и инициирует начало митоз^{12,14, 18 , 20 , 22 , 23}. фосфорилирование Thr161 также необходим для активации Cdk1/циклин B и опосредовано Cdk7, Cdk активации киназы (ЦАК)¹⁸. Деградации циклин b в анафазе инактивирует Cdk1, позволяя выход из митоз^24,25. Активация Cdk1/циклин B поэтому является сложным процессом. Протокола, представленные здесь выполняется с коммерчески доступных Cdk1/циклин б. В ходе рекомбинантных выражение этого комплекса в клетках насекомых это активированные в vivo эндогенного киназы^14,20 и остается активным в состоянии очищенных. Итоговый активная, рекомбинантного человеческого Cdk1/циклин B подходит для в vitro киназы анализов.

Здесь мы описываем протокол для идентификации конкретных Cdk1 фосфорилирования сайтов в человека центромер протеина F (CENP-F)¹⁰. CENP-F это Кинетохор белок, который проживает в ядре в течение большей части межфазовые изолирующие (G1 и S-фазы) и экспортируется в цитозоль в G2 фазе^26,27,28 Cdk1-зависимых образом^{10, 11}. ядерной локализации присуждается двудольных жизнь²⁶. cNLSs распознаются α karyopherin фактор ядерного транспорта, который облегчает, вместе с karyopherin β и RanGDP, импорт жизнь грузов в ядро²⁹. Ядерного экспорта в G2 фазе обеспечивается через путь неизвестным экспорта¹⁰. После того, как CENP-F находится в цитозоле, он нанят для того, чтобы ядерная оболочка и в свою очередь набирает^30,комплекс Динеин двигательные белки³¹. Этот путь имеет важное значение для позиции соответствующих Центросома ядро на начальных стадиях митотического шпинделя Ассамблеи образом Динеин зависимых, который имеет важное значение для правильного времени митотическая входа и основных процессов в мозге развития^30,,3132. Начиная с этапа G2, CENP-F является также смонтирован в Кинетохор где он имеет важную роль для верных хромосома сегрегации^{27,28,33,34,35} . Ключевым шагом регулирования этих путей является ядерным экспортом CENP-F в G2 фазе, которая зависит от Cdk1^10,11. Мы здесь описать протокол для идентификации Cdk1-конкретных сайтов фосфорилирования в жизнь CENP-F. Phosphomimetic перегласовок этих сайтов замедлить ядерного импорта CENP-f, предполагая, что Cdk1/циклин B непосредственно регулирует клеточной локализации CENP-F, фосфорилирование его жизнь¹⁰.

В целом этот assay в vitro киназы позволяет выявлять конкретные субстраты для киназы Cdk1. очищенные целевых белков, фосфорилированных в vitro коммерчески доступных Cdk1/циклин B комплекс и фосфорилирование сайты Впоследствии идентифицируются по масс-спектрометрии. Определение участков фосфорилирование Cdk1-конкретных поддерживает механистический исследования, которые показывают, как Cdk1 управляет клеточного цикла.