JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Published: May 03, 2018
doi:
10.3791/57674
, , ,
1Department of Chemistry,State University of New York at Binghamton

Summary

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Abstract

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün bütün Ökaryotlarda bir ana denetleyicisidir ve Proteom yaklaşık 8-%13 phosphorylates; Ancak, özellikle insan hücrelerinde Cdk1 için belirlenen hedeflerin sayısı hala düşük. Nasıl Cdk1 hücre döngüsü kontrol içine mekanik anlayışlar sağladıkları gibi Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlanması önemlidir. Hücre döngüsü Yönetmeliği sadık kromozom ayrımı için önemlidir ve bu karmaşık bir süreç içinde kusurları kromozom anomalileri ve kanser neden.

Burada, biz Cdk1 özgü fosforilasyon siteleri tanımlamak için kullanılan bir vitro kinaz tahlil açıklayın. Bu tahlil fosforile vitro arıtılmış bir proteindir ticari olarak mevcut insan Cdk1/siklin B. başarılı tarafından fosforilasyon SDS-PAGE tarafından onaylandıktan ve fosforilasyon siteleri daha sonra kütle spektrometresi tarafından tanımlanır. Ayrıca son derece saf ve homojen protein kinaz tahlil ve bağlama tahlil için uygun hazırlıklar arasındaki etkileşimi probları tanımlanan fosforilasyon siteleri fonksiyonel doğrulanması için verim arıtma iletişim kurallarını açıklar bir klasik nükleer yerelleştirme sinyal (cNLS) ve onun nükleer taşıma reseptör karyopherin α. Deneysel tasarım ile yardımcı olmak için protein dizilerinden Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tahmin için yaklaşımlar gözden geçirin. Birlikte bu protokollerin Cdk1 özgü fosforilasyon siteler verimleri ve mekanik çalışmaları nasıl Cdk1 hücre döngüsü kontrol eder içine sağlayan çok güçlü bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yöntem üzerinde saf protein dayanıyor beri bu herhangi bir model organizma ve verimleri güvenilir sonuçlar için özellikle hücre fonksiyonel çalışmalar ile birlikte uygulanabilir.

Introduction

Kinazlar fosfat grupları ATP yüzeyler transfer ve birçok hücresel süreçler düzenleyen enzimlerdir. Bu fosforilasyon geri alınabilir, hızlı, iki negatif ücretleri, ekler ve serbest enerji depolar ve hücreleri tarafından kullanılan en yaygın ardından değişiklikler biridir. Hücre bölünmesi döngüsü protein 2 homolog (cdc2) olarak da bilinen olan Cdk1 hücre döngüsünün bütün Ökaryotlar1,2,3,4,5ana bir denetleyicisidir ve phosphorylates bir yaklaşık 8-%13 Proteom6,7.

Bu değişiklikler için sorumlu kinaz bilinmeyen ise son proteomik çalışmalar proteinler, çoğu durumda, çok sayıda fosforilasyon site belirledik. Özellikle insan hücrelerinde bilinen Cdk1 hedeflerin sayısı düşük7var. Nasıl Cdk1 hücre döngüsü kontrol kurmak mekanik çalışmalar kullanmasına olanak tanır Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlanması önemlidir. Hücre döngüsü Yönetmeliği sadık kromozom segregasyon ve hücre bölünmesi için önemlidir ve hücresel sayısız bu önemli fizyolojik işlevi desteklemek için ortaya çıkması gereken. Bu transkripsiyon ve translasyon hücre yapısı ve organizasyon, nükleer zarf, kromozom yoğunlaşma ve Mitotik iğ Montaj Demontaj gibi dramatik bir yeniden yapılanma yanı sıra mitoz başlangıcı öncesinde durdurma içerir. Deregülasyon ve hataları bu süreçlerde kanser, doğum kusurları veya Mitotik hücre ölümüne neden olur. Cdk1 RO-3306 gibi belirli inhibitörleri fonksiyonel çalışmaları için güçlü araçlar sağlayan gelişmiş8, vardı ve bu inhibitörleri şu anda kanser tedavisi için klinik çalışmalarda bazı (9 inceleme için bakınız).

Burada, biz Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar bir vitro kinaz tahlil açıklayın. Bu tahlil, ticari olarak mevcut insan Cdk1/siklin B arıtılmış hedef protein vitrofazdan için kullanılır. Bir substrat fosforilasyon kütlesi artar ve iki negatif ücretleri ekler; Bu nedenle, başarılı fosforilasyon SDS-sayfa protein jel grubu yukarı doğru bir kayma tarafından onaylanır. Cdk1 özgü fosforilasyon siteleri daha sonra kütle spektrometresi fosforile vitro protein analizi tarafından tanımlanır. Deneysel tasarım ile yardımcı olmak için biz de Hesaplama araçları ve protein serisinden Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tahmin için başvurular gözden geçirin. Ayrıca, aynı zamanda son derece saf ve homojen protein kinaz tahlil için uygun hazırlıklar verim arıtma iletişim kuralları açıklar. Son olarak, tanımlanan fosforilasyon siteleri fonksiyonel çalışmaları tarafından doğrulanması gerekir ve bir basit bağlama tahlil burada bu amaçla kullanılmıştır. Birlikte, bu Cdk1 özgü fosforilasyon siteler verimleri ve mekanik çalışmaları nasıl hücre döngüsü7,10,11Cdk1 denetler içine sağlayan çok güçlü bir yaklaşım olacaktır. Bu yöntem üzerinde saf protein dayanıyor beri herhangi bir model organizma ve verimleri güvenilir sonuçlar için uygulanabilir. Yerde, ardından değişiklikleri, etkileşim ortakları veya hücrede yerleşimi gibi ek düzenleyici mekanizmaları hücre var gibi Ancak, elde edilen fosforilasyon siteleri vitro işlevsel doğrulaması, tavsiye bu fosforilasyon siteleri erişilebilir veya Cdk1 tarafından tanınması için erişilebilir hale gelebilir.

Cdk1 (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), burada X herhangi bir kalıntı ve serin veya treonin fosforilasyonu sitedir oluşur bir fikir birliği fosforilasyon site tanır. + 1 pozisyon prolin varlığı tanıma için özellikle önemlidir. Buna ek olarak, temel kalıntıları + 2 veya 3 pozisyonlarda tercih edilmektedir, Lys veya Arg 3 içeren çoğu Cdk1 özgü fosforilasyon site ile6,12konum.

Cdk1 aktivasyonu sıkı bir şekilde düzenlenir ve mitoz1,2,3,4,5başlangıcı için yol açar. Siklin bağımlı kinaz aktivitesinin genel olarak onların dernek ile farklı siklinlere (siklin A, B, C, D ve E insanlarda), hücre döngüsü13boyunca düzeyleri salınan ifade edilir bağlıdır. Cdk1 ifade hücre döngüsü boyunca sabittir ve siklin A ve B5,13,14,15, olarak siklin düzenleyici alt birimleri ile dernek, düzenleme, faaliyete dayanan de translasyon modifikasyon. Cdk1/siklin B kompleks oluşumu kinaz harekete geçirmek5,14,15,16,17,18için gereklidir. G2 evresinde, siklin B sitozol tercüme ve nerede Cdk15,14,15,16,17,–18bağlar çekirdeği’a içe aktarılan; Ancak, B Cdk1/siklin fosforilasyon (membran ilişkili tirozin ve treonin özel cdc2 inhibitör kinaz) artıkları Thr14 ve Tyr15 insan Cdk1 inhibitör kinaz Myt1 tarafından ve Wee1, sırasıyla19tarafından Inaktif tutulur, 20,21. Geç G2 aşamasında, hücre bölünmesi döngüsü 25 fosfataz (cdc25) tarafından Thr14 ve Tyr15 dephosphorylation Cdk1/siklin B kompleks kinaz aktivitesinin etkinleştirir ve mitoz12,14, inisiyasyon tetikler 18 , 20 , 22 , 23. Thr161 fosforilasyon da Cdk1/siklin B harekete geçirmek için gereklidir ve Cdk7, Cdk aktive kinaz (CAK)18aracılık ettiği. Siklin B anafaz bozulma Cdk1, mitoz24,25dan çıkış sağlayan inaktive. B Cdk1/siklin aktivasyonu bu nedenle karmaşık bir süreçtir. Burada sunulan Protokolü piyasada bulunan Cdk1/siklin b ile gerçekleştirilir Böcek hücrelerinde rekombinant ifade bu kompleksin sırasında bu harekete geçirmek içinde vivo endojen kinaz14,20 ve arıtılmış durumda etkin kalır. Elde edilen aktif, rekombinant insan Cdk1/siklin B vitro kinaz deneyleri için uygundur.

Burada, biz Cdk1 özgü fosforilasyon siteler insan şeması protein F (CENP-F)10tanımlaması için bir iletişim kuralı tanımlamak. CENP-F, interfaz (G1 ve S-fazlı) en sırasında çekirdeğinde bulunan ve Cdk1 bağımlı bir şekilde10, G2 aşama26,27,28 sitozol verilir bir kinetochore protein 11. nükleer yerelleştirme önerebilirim cNLS26tarafından haiz. kolaylaştırır, birlikte karyopherin β ve RanGDP, cNLS-yük alma çekirdeği29içine nükleer taşıma faktörü karyopherin α cNLSs algılanır. G2 aşamasında nükleer verme yolu ile an bilinmeyen verme yolu10kolaylaştırılmıştır. CENP-F sitozol içinde bulunduğu nükleer zarf oluşturulmuştur ve sırayla motor protein kompleksi dinein30,31acemi. Bu yol için centrosome ilgili çekirdek Mitotik Milli Meclisi ilk aşamalarında Mitotik girdinin doğru zamanlama ve beyin temel bir işlemde önemlidir dinein bağımlı bir şekilde konumlandırmak önemlidir geliştirme30,31,32. G2 aşamasında başlayan, CENP-F de kinetochore sadık kromozom segregasyon27,28,33,34,35 için önemli roller bulunduğu monte edilir . Bir anahtar düzenleyici bu yollar CENP-F nükleer ihracat Cdk110,11tarihinde bağlıdır G2 aşamasında adımdır. Biz burada bir protokol Cdk1 özgü fosforilasyon siteler CENP-F. cNLS içinde tanımlanması için tarif Phosphomimetic mutasyonlar bu sitelerin CENP-F B Cdk1/siklin doğrudan CENP-F Hücrede yerleşimi onun cNLS10fosforilasyon tarafından düzenleyen düşündüren, nükleer alınmasıyla yavaşlatacak.

Kinaz Cdk1. saf hedef proteinler fosforile vitro piyasada bulunan Cdk1/siklin B kompleks ve fosforilasyon siteler için genel olarak, bu vitro kinaz tahlil belirli yüzeylerde tanımlaması sağlar daha sonra kütle spektrometresi tarafından tanımlanır. Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması nasıl Cdk1 hücre döngüsü kontrol ortaya mekanik çalışmaları destekler.

Protocol

1. tahmini Protein serisinden Cdk1 özgü fosforilasyon sitelerin Kinaz tahlil başlamadan önce tahmin edilen Cdk1 özgü fosforilasyon siteler için protein sırasını analiz ve bilinmeyen kinaz özgüllük ile edebiyat deneysel olarak kurulan fosforilasyon siteler için arama. Aşağıdaki araçlar, veritabanları ve özetlenen başvuruları kullanın. Üreticisinin 3.0 yazılım36,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php) Cdk1 özgü fo…

Representative Results

Son zamanlarda bir cNLS10bulunan bir CENP-F parçadaki Cdk1 özgü fosforilasyon siteleri tanımlamak için bir vitro kinaz tahlil (şekil 1) kullandık. Bu sinyal CENP-F nükleer yerelleştirme Interphase lerin confers. G2 evresinde, CENP-F sitozol Cdk1 bağlı şekilde çekirdek verilir. Nasıl CENP-f Hücrede yerleşimi Cdk1 düzenleyen üzerinde mekanik anlayışlar elde etmek için biz üreticisinin sunucu<sup class="xref…

Discussion

Bizim vitro kinaz tahlil hangi hücre döngüsünün ana denetleyicisi ve birçok önemli hücresel süreçler düzenleyen kinaz Cdk1, moleküler hedefleri tanımlamak için çok güçlü bir yöntem olduğunu. Yöntem bir saf protein bir substrat Cdk1 için ve belirli fosforilasyon sitelerin kimlik sağlar Eğer belirler. Bu Cdk1 aracılığıyla fosforilasyon tarafından mekanik çalışmaları, düzenleme, hücresel süreçler için kolaylaştırır.

En kritik kütle spektrometresi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Dr David King, Howard Hughes tıp Enstitüsü, University of California Berkeley kütle spektrometresi analiz ve yararlı yorumlar için teşekkür ederiz. Biz Dr Xuelian Zhu, Shanghai, Biyoloji Bilimleri enstitüleri, Çin Bilimler Akademisi, tam uzunlukta bir CENP-F yapı sağlamak için Shanghai, Çin teşekkür ederim. Son olarak, biz Dr Susan Bane, Dr Brian Callahan ve Dr Christof Grewer Binghamton Üniversitesi’nde ekipmana için teşekkür ederim. Bu araştırma State University of New York ve State University of New York Binghamton, Kimya bölümü için Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi.

Materials

2800 ml baffled Fernbach flask Corning 44232XL
ampicillin Gold Biotechnology A-301-25
ATP Fisher Scientfiic BP413-25
benzamidine hydrochloride Millipore Sigma B6506-25
bottletop filter Corning 431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL New England Biolabs P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source) EMD Millipore 14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source) Invitrogen PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer New England Biolabs P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor Thermo Scientific 10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes EMD Millipore UFC900324
chlorampenicol Gold Biotechnology C-105-100
D/L methionine Agros Organics / Fisher 125650010
desalting pipet tips: Zip tips Millipore Sigma ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm Biorad 7321010
dithiothreitol Gold Biotechnology DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain EMD Millipore 71403
electrospray ionization Fourier transform ion Bruker Amazon Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer Bruker Amazon custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy Thermo Scientific 97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC GE Healthcare 29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
glutathione agarose Pierce 16101
glutathione, reduced Millipore Sigma G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker Infors I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Gold Biotechnology I2481C50
kanamycin Gold Biotechnology K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid Available upon request.
Luria Bertani medium Fisher Scientfiic BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated Eppendorf 5401000013
microtubes (0.5 ml) Eppendorf 30121023
microtubes (1.5 ml) Eppendorf 30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel Millipore Sigma P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid Millipore Sigma GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride Gold Biotechnology P470-10
PS protease: PreScission protease GE Healthcare 27084301
Phos-tag acrylamide Wako Pure Chem. Ind. 304-93521
reduced gluthathione Millipore Sigma G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) Fisher Scientfiic 055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning Agilent 210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier Branson 15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) Spectrum Labs 08 670B
swing out rotor TX-1000 Thermo Scientific 10033-778
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nurse, P. Cyclin dependent kinases and cell cycle control (Nobel Lecture). ChemBioChem. 3 (7), 596-603 (2002).
  2. Lee, M. G., Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. Nature. 327, 31 (1987).
  3. Lohka, M. J., Hayes, M. K., Maller, J. L. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad of Sci U S A. 85 (9), 3009-3013 (1988).
  4. Gautier, J., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P., Maller, J. Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene. Cell. 54 (3), 433-439 (1988).
  5. Gautier, J., Minshull, J., Lohka, M., Glotzer, M., Hunt, T., Maller, J. L. Cyclin is a component of maturation-promoting factor from Xenopus. Cell. 60 (3), 487-494 (1990).
  6. Ubersax, J. A., Woodbury, E. L., Quang, P. N., Paraz, M., Blethrow, J. D., Shah, K., Shokat, K. M., Morgan, D. O. Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1. Nature. 425 (6960), 859-864 (2003).
  7. Petrone, A., Adamo, M. E., Cheng, C., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2448-2461 (2016).
  8. Vassilev, L. T., Tovar, C., Chen, S., Knezevic, D., Zhao, X., Sun, H., Heimbrook, D. C., Chen, L. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  9. Balakrishnan, A., Vyas, A., Deshpande, K., Vyas, D. Pharmacological cyclin dependent kinase inhibitors: Implications for colorectal cancer. World J Gastroenterol. 22 (7), 2159-2164 (2016).
  10. Loftus, K. M., Coutavas, E., Cui, H., King, D., Ceravolo, A., Pereiras, D., Solmaz, S. Mechanism for G2 phase-specific nuclear export of the kinetochore protein CENP-F. Cell Cycle. 16 (15), 1414-1429 (2017).
  11. Baffet, A. D., Hu, D. J., Vallee, R. B. Cdk1 activates pre-mitotic nuclear envelope dynein recruitment and apical nuclear migration in neural stem cells. Dev Cell. 33 (6), 703-716 (2015).
  12. Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland, N., Hoekstra, M. F., Piwnica-Worms, H., Cantley, L. C. Use of an oriented peptide library to determine the optimal substrates of protein kinases. Curr Biol. 4 (11), 973-982 (1994).
  13. Malumbres, M. Cyclin-dependent kinases. Genome Biol. 15 (6), 122 (2014).
  14. Peeper, D. S., Parker, L. L., Ewen, M. E., Toebes, M., Hall, F. L., Xu, M., Zantema, A., van der Eb, A. J., Piwnica-Worms, H. A- and B-type cyclins differentially modulate substrate specificity of cyclin-cdk complexes. EMBO J. 12 (5), 1947-1954 (1993).
  15. Trembley, J., Ebbert, J., Kren, B., Steer, C. Differential regulation of cyclin B1 RNA and protein expression during hepatocyte growth in vivo. Cell Growth Differ. 7 (7), 903-916 (1996).
  16. Pines, J., Hunter, T. The differential localization of human cyclins A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. EMBO J. 13 (16), 3772-3781 (1994).
  17. Morgan, D. O. Principles of CDK regulation. Nature. 374, 131 (1995).
  18. Larochelle, S., Merrick, K. A., Terret, M. -. E., Wohlbold, L., Barboza, N. M., Zhang, C., Shokat, K. M., Jallepalli, P. V., Fisher, R. P. Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol cell. 25 (6), 839-850 (2007).
  19. Parker, L. L., Sylvestre, P. J., Byrnes, M. J., Liu, F., Piwnica-Worms, H. Identification of a 95-kDa WEE1-like tyrosine kinase in HeLa cells. Proc Natl Acad of Sci U S A. 92 (21), 9638-9642 (1995).
  20. Atherton-Fessler, S., Parker, L. L., Geahlen, R. L., Piwnica-Worms, H. Mechanisms of p34cdc2 regulation. Mol Cell Biol. 13 (3), 1675-1685 (1993).
  21. Liu, F., Stanton, J. J., Wu, Z., Piwnica-Worms, H. The human Myt1 kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. Mol Cell Biol. 17 (2), 571-583 (1997).
  22. McGowan, C. H., Russell, P. Human Wee1 kinase inhibits cell division by phosphorylating p34cdc2 exclusively on Tyr15. EMBO J. 12 (1), 75-85 (1993).
  23. Strausfeld, U., Labbé, J. C., Fesquet, D., Cavadore, J. C., Picard, A., Sadhu, K., Russell, P., Dorée, M. Dephosphorylation and activation of a p34cdc2/cyclin B complex in vitro by human CDC25 protein. Nature. 351, 242 (1991).
  24. Leuken, R., Clijsters, L., Wolthuis, R. To cell cycle, swing the APC/C. Biochim Biophys Acta. 1786 (1), 49-59 (2008).
  25. Acquaviva, C., Pines, J. The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci. 119 (12), 2401-2404 (2006).
  26. Zhu, X., Chang, K. -. H., He, D., Mancini, M. A., Brinkley, W. R., Lee, W. -. H. The C-terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem. 270 (33), 19545-19550 (1995).
  27. Liao, H., Winkfein, R. J., Mack, G., Rattner, J. B., Yen, T. J. CENP-F is a protein of the nuclear matrix that assembles onto kinetochores at late G2 and is rapidly degraded after mitosis. J Cell Biol. 130 (3), 507-518 (1995).
  28. Rattner, J. B., Rao, A., Fritzler, M. J., Valencia, D. W., Yen, T. J. CENP-F is a ca 400 kDa kinetochore protein that exhibits a cell-cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton. 26 (3), 214-226 (1993).
  29. Christie, M., Chang, C. -. W., Rona, G., Smith, K. M., Stewart, A. G., Takeda, A. A. S., Fontes, M. R. M., Stewart, M., Vertessy, B. G., Forwood, J. K., Kobe, B. Structural biology and regulation of protein import into the nucleus. J Mol Biol. 428 (10A), 2060-2090 (2016).
  30. Zuccolo, M., Alves, A., Galy, V., Bolhy, S., Formstecher, E., Racine, V., Sibarita, J. B., Fukagawa, T., Shiekhattar, R., Yen, T., Doye, V. The human Nup107/160 nuclear pore subcomplex contributes to proper kinetochore functions. EMBO J. 26, 1853-1864 (2007).
  31. Bolhy, S., Bouhlel, I., Dultz, E., Nayak, T., Zuccolo, M., Gatti, X., Vallee, R., Ellenberg, J., Doye, V. A Nup133-dependent NPC-anchored network tethers centrosomes to the nuclear envelope in prophase. J Cell Biol. 192 (5), 855-871 (2011).
  32. Hu, D. J., Baffet, A. D., Nayak, T., Akhmanova, A., Doye, V., Vallee, R. B. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154 (6), 1300-1313 (2013).
  33. Vergnolle, M. S., Taylor, S. S. Cenp-F links kinetochores to Ndel1/Nde1/Lis1/Dynein microtubule motor complexes. Curr Biol. 17 (13), 1173-1179 (2007).
  34. Yang, Z. Y., Guo, J., Li, N., Qian, M., Wang, S. N., Zhu, X. L. Mitosin/CENP-F is a conserved kinetochore protein subjected to cytoplasmic dynein-mediated poleward transport. Cell Res. 13 (4), 275-283 (2003).
  35. Yang, Z., Guo, J., Chen, Q., Ding, C., Du, J., Zhu, X. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25 (10), 4062-4074 (2005).
  36. Xue, Y., Ren, J., Gao, X., Jin, C., Wen, L., Yao, X. GPS 2.0, a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites in hierarchy. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1598-1608 (2008).
  37. Song, C., Ye, M., Liu, Z., Cheng, H., Jiang, X., Han, G., Songyang, Z., Tan, Y., Wang, H., Ren, J., Xue, Y., Zou, H. Systematic analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data. Mol Cell Proteomics. 11 (10), 1070-1083 (2012).
  38. UniProt-Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D158-D169 (2017).
  39. Olsen, J. V., Vermeulen, M., Santamaria, A., Kumar, C., Miller, M. L., Jensen, L. J., Gnad, F., Cox, J., Jensen, T. S., Nigg, E. A., Brunak, S., Mann, M. Quantitative phosphoproteomics reveals widespread full phosphorylation site occupancy during mitosis. Science Signal. 3 (104), ra3 (2010).
  40. Dephoure, N., Zhou, C., Villén, J., Beausoleil, S. A., Bakalarski, C. E., Elledge, S. J., Gygi, S. P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad of Sci U S A. 105 (31), 10762-10767 (2008).
  41. Rona, G., Marfori, M., Borsos, M., Scheer, I., Takacs, E., Toth, J., Babos, F., Magyar, A., Erdei, A., Bozoky, Z., Buday, L., Kobe, B., Vertessy, B. G. Phosphorylation adjacent to the nuclear localization signal of human dUTPase abolishes nuclear import: structural and mechanistic insights. Acta Cryst D. 69 (12), 2495-2505 (2013).
  42. Harreman, M. T., Kline, T. M., Milford, H. G., Harben, M. B., Hodel, A. E., Corbett, A. H. Regulation of nuclear import by phosphorylation adjacent to nuclear localization signals. J Biol Chem. 279 (20), 20613-20621 (2004).
  43. Kosugi, S., Hasebe, M., Tomita, M., Yanagawa, H. Systematic identification of cell cycle-dependent yeast nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10171-10176 (2009).
  44. McLachlin, D. T., Chait, B. T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 591-602 (2001).
  45. Van Berkel, G. J., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Electrospray ionization combined with ion trap mass spectrometry. Anal Chem. 62 (13), 1284-1295 (1990).
  46. Hodel, A. E., Harreman, M. T., Pulliam, K. F., Harben, M. E., Holmes, J. S., Hodel, M. R., Berland, K. M., Corbett, A. H. Nuclear localization signal receptor affinity correlates with in vivo localization in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 281 (33), 23545-23556 (2006).
  47. Hong, K. U., Kim, H. -. J., Kim, H. -. S., Seong, Y. -. S., Hong, K. -. M., Bae, C. -. D., Park, J. Cdk1-Cyclin B1-mediated Phosphorylation of Tumor-associated Microtubule-associated Protein/Cytoskeleton-associated Protein 2 in Mitosis. J Biol Chem. 284 (24), 16501-16512 (2009).
  48. Meraldi, P., Lukas, J., Fry, A. M., Bartek, J., Nigg, E. A. Centrosome duplication in mammalian somatic cells requires E2F and Cdk2–Cyclin A. Nature Cell Biol. 1, 88 (1999).
  49. Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  50. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding Tag, a New Tool to Visualize Phosphorylated Proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  51. Takeda, H., Kawasaki, A., Takahashi, M., Yamada, A., Koike, T. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of phosphorylated compounds using a novel phosphate capture molecule. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (18), 2075-2081 (2003).
  52. Linder, M. I., Köhler, M., Boersema, P., Weberruss, M., Wandke, C., Marino, J., Ashiono, C., Picotti, P., Antonin, W., Kutay, U. Mitotic Disassembly of Nuclear Pore Complexes Involves CDK1- and PLK1-Mediated Phosphorylation of Key Interconnecting Nucleoporins. Dev Cell. 43 (2), (2017).
  53. Arai, T., Haze, K., Iimura-Morita, Y., Machida, T., Iida, M., Tanaka, K., Komatani, H. Identification of β-catenin as a novel substrate of polo-like kinase 1. Cell Cycle. 7 (22), 3556-3563 (2008).
  54. Hansen, D. V., Tung, J. J., Jackson, P. K. CaMKII and Polo-like kinase 1 sequentially phosphorylate the cytostatic factor Emi2/XErp1 to trigger its destruction and meiotic exit. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (3), 608-613 (2006).
  55. Zhang, Y., Dong, Z., Nomura, M., Zhong, S., Chen, N., Bode, A. M., Dong, Z. Signal Transduction Pathways Involved in Phosphorylation and Activation of p70S6K Following Exposure to UVA Irradiation. J Biol Chem. 276 (24), 20913-20923 (2001).
  56. Richard, D. E., Berra, E., Gothié, E., Roux, D., Pouysségur, J. p42/p44 Mitogen-activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) and Enhance the Transcriptional Activity of HIF-1. J Biol Chem. 274 (46), 32631-32637 (1999).

Tags

CDK1PhosphorylationKinase AssayCell CycleCENP-FProtein ExpressionE. ColiLB MediumAntibioticsProtein Purification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay. J. Vis. Exp. (135), e57674, doi:10.3791/57674 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image