Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

İletişim kuralları bizim yerel insan Araştırma Etik Komitesi kuralları, hem de hayvan bakımı yönergeleri izleyin. 1. izolasyon ikamet fare Peritoneal makrofajlar Kurban fare (3-4 ay-in yaş (her iki cinsiyetten); Örneğin C57BL/6 zorlanma) uçucu anestezik isoflurane aşırı dozda kullanarak (> havada % 5) veya karbon dioksit13servikal çıkığı tarafından takip,. Anestezi indüksiyon kolayca refleks14keşfetmiş kaybı yanı sıra pençe çekilme refleks kaybı tarafından tespit edilebilir. Fare ile % 80 etanol suda göbek temizlendikten sonra cilt ensizyon yapmak ve temel karın duvarı bulaşmasına neden. Peritonium ve lavaj boşluğu ile 2 x 4.5 mL buz gibi Hank tamponlu tuz solüsyonu (HBSS), Ca2 + ve Mg2 +5 mL plastik enjektör üzerinden olmadan bir 24-G plastik kateter yerleştirin. Enjekte ederken, yaklaşık 0,5 mL artık terk HBSS (5-4.5 (enjekte) mL 0.5 mL =) şırınga durumda doku kateter ucu sucked ve okuldan gerekiyor. Emişli süspansiyon 14 mL polipropilen yuvarlak alt tüp ve 300 x g , santrifüj 6,5 dakika oda sıcaklığında içine aktarın.Not: Plastik kateter ucu olduğunu blunt, iğne için karşılaştırıldığında, hangi en aza indirir karın içindekilere yaralanma. Genellikle, aşağıdaki karın masaj nazik, 8 mL periton hücre süspansiyon periton boşluğundan alınabilir. Süpernatant atmak ve periton RPMI 1640 orta bikarbonat ücretsiz 1 mL 20 mM Hepes, % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum ve antibiyotikler penisilin (100 adet/mL) ve streptomisin (100 µg/mL), tarafından hazırlanan gibi içeren hücrelerde resuspend 100 x penisilin/streptomisin 1: 100 sulandrarak. Bu genellikle yaklaşık 6 x 106 hücre/mL bir konsantrasyon sağlar.Not: ise (küçük) diğer hücreleri lenfositler, ağırlıklı olarak B hücreleri makrofajlar, izole periton hücreleri yaklaşık % 30’u vardır. 2. Kanal periton hücrelerinin tohum slaytlar Yukarı ve aşağı topaklanma azaltmak için hücre süspansiyon pipetting sonra 100 µL süspansiyon doldurulmuş Kanal Kanal fibronektin kaplı slayt (hacim, 100 µL) pipet (100 µL kanal boyutları vardır (uzunluk x Genişlik x yükseklik): 50 x 5 mm 0.4 mm). 1 mL serum takıma RPMI 1640 (Hepes) orta kanal slayt iki rezervuarlar birine ekleyerek, slayt devirme ve daha sonra aşağı akım rezervuar (Şekil 1) ortamından aspirating odası prefill. Kaldır istenmeyen hava kabarcıkları, ya da 1-2 mL orta iki rezervuarlar birine ekleyerek, sıkıca bir rezervuar kap uygulamak ve sonra kapağı üzerinde ritmik başparmak baskı havada dışarı pompalama ve, gerekli hallerde, slayt devirme kanaldaki hava uzun şeritler. Hava kovma sonra kapağını rezervuar slaytla eğilme (ve orta içeren) aşağıya doğru hava kanal içine sucked önlemek için kapağı çıkarmadan önce. Hücrelerle yokluğunda CO2 , 37 ° C’de 2 h için nemli bir odasında numaralı seribaşı kanal slayt kuluçkaya (CO2 gerekli değildir beri HCO3-Co2 tampon sistemi Hepes tarafından değiştirilmiştir). Kanal slaytlar elverişli bir konuma sahip sekiz slaytlar tutan bir rafa yerleştirilebilir. Tipik olarak, yukarıya için 10 veya daha fazla mümkün olsa da 6-8 slaytlar bir fareden hazırlanır. Rafa kaldırmak ve her bir slayt için penisilin/streptomisin yanı sıra % 10 fetal Sığır serum ile desteklenmiş RPMI 1640 orta içeren bikarbonat RPMI 1640 (Hepes) ortamda değişimi. Slayt eğilme ve orta ilk alt rezervuar ve sonra üst rezervuar Aspire edin. Ardından, yeni orta 1 mL rezervuar birine ekleyin, kanalı ile aktı sonra aşağı akım depo, slayt ve Aspire edin ortamından yatır. Bu yıkama (medyası takası) adımdan sonra rezervuarlar için 1 mL orta ekleyerek kanal slayt doldurun.Not: Kanal slaytlar kullanarak adımları yıkama çok basit ve etkili çözüm değişimi ve yapışık olmayan hücreleri çıkarmadan açısından. RPMI 1640 (bikarbonat) orta normalde önceden termal ve pH denge sağlamak için % 5 CO2 ile gecede inkübe olduğuna dikkat edin. Gecede 37 ° C’de % 5 CO2ile oksijen bir kuluçka hücreleri kuluçkaya. Deneyler ertesi gün gerçekleştirmek. 3. yalıtım insan kırmızı kan hücrelerinin Günde 2 (ikinci gün deneyler; izole periton makrofajlar gecede kuluçka sonra), 1-2 mL periferik venöz kan sağlıklı bir verici, heparinized tüp içine toplamak. Bir yuvarlak alt 2.0 mL (Polipropilen) microcentrifuge Tüp, 18 ° c (ampirik ayarı) 5 min için 300 x g, santrifüj içine 1 mL transfer ve süpernatant (plazma ve buffy kat) kaldırın. Yavaşça posalı kırmızı kan hücrelerinin 100 µL Aspire edin ve bu Cilt 1:1 (aşağıda açıklanmıştır) değiştirilmiş RPMI 1640 (Hepes) orta bir yuvarlak alt 2.0 mL microcentrifuge tüp ile karıştırın. Tüp “1:1” etiket.Not: hücreleri izole sonra günde 2 (deneyleri için) kullanılan RPMI 1640 (Hepes) orta, % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum, penisilin (100 adet/mL), streptomisin (100 µg/mL) ve (azaltmak için 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) glisin yanı sıra içerir fototoksisite). Bu orta, bundan sonra “tarihinde” RPMI 1640 (Hepes) aracı olarak adlandırılır. 1:1 seyreltilmiş kırmızı kan hücre süspansiyon 4 µL 2 mL pipet RPMI 1640 (Hepes) orta değiştiren, 2.0 mL microcentrifuge tüp içine önceden pipetted (Bu işlemi tekrarlayın, yani 2 tüpler hazırlamak). Her tüp “4:2000” etiket. “1:1” ve “4:2000” tüpler buza koyun. 4. makrofaj plazma membran etiketleme Numaralı seribaşı kanal slaytlar CO2 kuluçka kaldırmak ve her bir slayt için değiştirilmiş RPMI 1640 (Hepes) orta RPMI 1640 (bikarbonat) ortamda değişimi. Daha sonra hücreleri yokluğunda CO2, 37 ° C’de nemli bir odaya yerleştirin.Not: gece kuluçka ve yıkama sonra lenfositler çoğunu kanaldan kaldırılır. Kalan yapışık hücreleri makrofajlar, morfolojik veya ayirt boyama tarafından anti-F4/80 antikor kullanılarak belirlenebilir çoğu. Etrafında fare ikamet periton makrofajlar % 95’i F4/80 olumlu vardır. Fluorescently yeşil etiketli Anti-fare F4/80 antikor (4 ° C’de depolanan) 1:40 tarihinde RPMI 1640 (Hepes) orta sulandırmak. Bir slayt al, tilt ve antikor karışımı (damla damla) 100 µL 100 µL kanal slaydın açılış içine pipet (bkz. Şekil 1). Akış aşağı göle akan orta Aspire edin. 20 dk 37 ° C’de (CO2olmadan oksijen çevre) için hücreleri kuluçkaya. Kuluçka döneminde insan kırmızı kan hücreleri (bkz Bölüm 5) etiketleyin.Not: Yukarıdaki için sorar gibiydi, CO2 HCO3′ ten beri gerekli değildir-Co2 tampon sistemi Hepes tarafından değiştirilir. 1 mL ekleyerek slayt RPMI 1640 (Hepes) orta bir rezervuar ve kanalı ile aktı sonra orta aspirating değiştirme (hangi sırasında insan kırmızı kan hücreleri lekeli opsonized ve) 20 dk kuluçka zamanı, yıkama tarafından kolaylaştırdı sonra Slayt devirme. 1 mL orta kısa süreli depolama için ekleyebilir veya bir deney (parçacıklar (opsonized kırmızı kan hücreleri) pipetting ve hızlandırılmış dönen disk confocal mikroskobu tarafından fagositoz Imagingyani ) geçin. 5. insan kırmızı kan hücrelerinin plazma zarı etiketleme İnsan kırmızı kan hücreleri makrofajlar yeşil fluorescently etiketli anti-F4/80 antikor ile slayt (sonra Bölüm 4.2) hemen kuluçka sonra etiketleme başlayın. Nazik karıştırma sonra birinden (bkz. Kısım 3.3) “4:2000” tüpler 400 µL al ve bir (yuvarlak alt) 2.0 mL microcentrifuge tüp içine dağıtmak. Süspansiyon yaklaşık 37 ° C sıcak zaman tanıyın (paragraf aşağıya bakınız). 0.4 µL turuncu/kırmızı floresan plazma zarı leke (aliquots-20 ° C’de depolanan) ekleyin, karıştırın ve 5 min için 37 ° C’de kuluçkaya.Not: laminar akış başlık içinde yerleştirilen bir ısıtmalı Alüminyum blok slaytlar hazırlarken ısı kaybını en aza indirmek için yararlıdır. Tüpleri Isıtma blok ve ayrı bir geçişli kuyu yerleştirilebilir veya entegre, ısıtmalı alüminyum levha bir çalışma alanı hizmet verebilir. Sonra 5 dk kuluçka süresi, ilk yıkama adım 1600 µL modifiye RPMI 1640 (Hepes) Orta (2.0 mL microcentrifuge tüp doldurmak için) ekleyerek hazırlayın. Santrifüj tüpü 300 x g 18 ° c (ampirik ayarı) 5 min için de kapasitesi. Kompakt bir kırmızı Pelet tüp altındaki (Yani, kapalı-merkezi) duvar görünür olmalıdır. Tüp Pelet yukarı bakacak şekilde döndürme ve tüm 1 – 1,5 mL pipet ucu kullanarak süpernatant gittikçe (iki adımda) dikkatli bir şekilde çıkarın. Süpernatant aspirating sonra (resuspend hücreleri) 2000 µL modifiye RPMI 1640 (Hepes) orta, mix ekleyin ve yukarıdaki Santrifüjü ve süpernatant aspirasyon adımları tekrarlayın. Pelet (plazma zarı lekeli ve 2 x kırmızı kan hücreleri yıkanmış) değiştirilmiş RPMI 1640 (Hepes) Orta 400 µL ile resuspend. Tüp PMS (plazma zarı leke kısaltması) etiketleyin.Not: Alternatif olarak, succinimidyl ester daha fazla olur bir pH duyarlı rodamine türev şiddetle floresan Asidik pH, insan kırmızı kan hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Bu durumda, parçacıklar içselleştirilmiş var sonra floresan yoğunluğu phagosome olgunlaşma bir ölçüsü olarak ek olarak hizmet vermektedir. 6. opsonizasyonla (insan (IgG) alyuvarlar fare immünoglobulin G ile etiketleme) 1 µL fare (Igg2b) monoklonal (klon HIR2) Anti-insan CD235a Ekle (-20 ° C’de depolanan) (1 mg/mL) antikor plazma zarı içeren PMS (bkz: bölümler 5.2-5,5), etiketli tüp lekeli insan kırmızı kan hücreleri 400 µL ortamda askıya alındı. CD235a (glycophorin A da bilinir) bir erythroid lineage özel membran sialoglycoprotein var. 8 dk. Not insan kırmızı kan hücreleri (hücre topaklanma) IgG nedenleri aglutinasyon ile o opsonizasyonla 37 ° C’de kuluçkaya. Aglutinasyon opsonizasyonla görsel bir gösterge hizmet verebilir, tek fagositik efektleri görüntüleme için istenmeyen olsa da. Aglutinasyon aşmak, art arda, örneğin, bir değişken kullanarak hücre süspansiyon (her 1 dk.) 20-200 µL birim pipet mix için 200 µL için ayarlayın. 8 dk. kuluçka dönemi sonundaki Eğer istenen, yıkama fluorescently yeşil ile inkübe makrofaj slayt anti-F4/80 antikor etiketli, RPMI 1640 (Hepes) orta 1 mL ile değiştirilmiş. Her iki rezervuarlar kanal slaydın çamaşır adımlardan sonra orta ücretsiz olduğundan emin olun. 7. plazma zarı fagositoz Imaging lekeli ve IgG insan kırmızı kan hücreleri kaplı Anti-CD235a antikor (Bölüm 6.2) ile 8 dk kuluçka sonra plazma zarı lekeli ve IgG opsonized insan kırmızı kan hücreleri makrofajlar yeşil flüoresan anti-F4 ile etiketli içeren bir slayt kanalı içine içeren 100 µL süspansiyon pipet / 80 antikor (adım 4). Böylece, kırmızı floresan, IgG opsonized insan kırmızı kan hücreleri yeşil flüoresan fagositler (makrofajlar) eklenir. En kısa zamanda insan kırmızı kan hücreleri eklendi, kanal slayt üzerinde dönen disk confocal mikroskop (37 ° C için ayarla sahne kuluçka makinesi ile) Örneğin, bir 60 X görüntüleme için mount / 1,49 petrol-daldırma objektif lens. Parçacıklar 1 dk içinde yerleşmeye başlar bu yana en kısa zamanda görüntüleme başlatın.Not: floresan boncuk 100 çapı ile kullanarak nm, şiddetindeydi, işlevler, XY çözünürlük x noktası analizi tarafından yayılan 0,22 µm, = y 0,23 µm (488 nm lazer) ve x = 0,27 µm, = y 0,27 µm (561 nm lazer) =. Ancak, photobleaching ve fototoksisite canlı hücreler hızlandırılmış 3D görüntüleme sırasında azaltmak için biz Uzaysal Çözünürlük 2 x 2 binning kullanarak uzlaşma. Binning duyarlılık (geliştirir sinyal-gürültü oranı) ve izin verilen kare hızı artar ama uzaysal çözünürlük pahasına. Mükemmel bir odak kullanmak (veya benzeri) sistem kayıtları sırasında odak kayması önlemek için. Mükemmel odaklama sistemi aktive sonra makrofaj lamellipodial çıkıntılar hemen üstündeki coverslip üzerine odaklanmak için mahsup denetimini kullanın (aşağıdaki nota bakın) Kanal slayt. Bu odak düzeyi karşılık gelen 0 µm. elde edilir Z-yığınlar-1 µm den 22 Z-dilimlere tutarlar 0.8 µm adımlar, 16 µm için =. Z-yığınlar Örneğin, elde edilebilir (her kanal için) 1 yığın oranında her 15 16 dk toplam s.Not: Kayıp ana toprak dolay iden photobleaching görüntü kalitesi daha uzun kayıt süre muzdarip. Z-yığınlar her iki kanalı için satın: makrofajlar görüntüsü 488 nm lazer (yeşil kanal) kullanarak ve insan kırmızı kan hücreleri yansıma 561 nm lazer (kırmızı kanalı) kullanarak. Bu yaklaşımı kullanarak, farklı timepoints, insan kırmızı kan hücreleri IgG opsonized sindirerek makrofajlar görünümü elde edilebilir (örneğin, bkz: Şekil 2).Not: (2 x 2 binning ile) sistemin tipik ayarlar şunlardır: yeşil kanal (,5 lazer (50 mW; 488 nm) güç, 101 duyarlılık (Aralık, 0-255) ve 200 ms çekim hızı); kırmızı kanalı (% 10,5 lazer (50 mW; 561 nm) güç, 101 duyarlılık (Aralık, 0-255) ve 98 ms çekim hızı).Not: Kanal slayt alt bir polimer #1.5 cam coverslip ve cam aynı optik özellikleri olarak aynı kalınlığı ile ancak, özellikle, malzeme gaz geçirgenliği avantajı vardır. 8. fagositoz plazma zarı lekeli ve tamamlayıcı kaplı insan kırmızı kan hücreleri görüntüleme Tamamlayıcı opsonize plazma zarı lekeli ve insan kırmızı kan IgG opsonized benzer şekilde bölümler 5 ve 6, dışında 2 mL modifiye RPMI 1640 (Hepes) orta, içine 1:1 seyreltilmiş kırmızı kan hücre süspansiyon pipetting 4 µL yerine kısım 3.3 içinde açıklandığı gibi hücreleri, 4 µL 1 mL modifiye RPMI 1640 (Hepes) orta pipet ve buna göre tüp 4:1, 000 etiket. Böylece, insan kırmızı kan hücreleri 2 x daha fazla konsantre vardır. Bölüm 4 ve 5 adımda devam, ama insan kırmızı kan hücrelerinin 4:2,000 seyreltilmiş hisse senedi yerine 4:1,000 ile yola çıkıp (4:1, 000 ve 4:2,000 başlangıçta 1:1 seyreltilmiş insan kırmızı kan hücrelerinin bölümlerde açıklanan sonraki dilutions bakın 3.1 ve 3.2). C5 null fare (Örneğin, B10. kurban D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Jackson Laboratory) işten çıkarma ve toplama kan tarafından takip (havada % > 5) isoflurane Solunduğunda. Genellikle yaklaşık 0.8 mL kan isoflurane inhalasyon ve işten çıkarma hemen ardından bir yuvarlak alt 14 mL plastik tüp damla. Kan tamamen pıhtılaşmış, 1 h sonra içine a 2.0 mL microcentrifuge tüp ve oda sıcaklığında 5 min için 300 x g , santrifüj kalan sıvı aktarın. Daha sonra dikkatle sarımsı serum toplamak. Tipik olarak, en az 200 µL C5 boş serum yeniden elde etmek. C5 boş serum buza koyun. İnsan kırmızı kan hücreleri ile IgG plazma zarı 4 dk kuluçka lekeli sonra anti-CD235a antikor (2 x konsantre veren), başka bir 1 µL ekleyin ve sonra hücre süspansiyon 50 µL alıp 50 µL C5 boş içeren bir ayrı 2.0 mL microcentrifuge tüp içinde karıştırın serum. Bölüm 6.2 olduğu gibi başka bir 4 dk için yukarı ve aşağı, pipetting tarafından (her 1 dk.) tekrar tekrar karıştırmak devam edin. Böylece, bu adımdan sonra insan kırmızı kan hücreleri ile anti-CD235a antikor 8 min Toplam inkübe.Not: 4 dk kuluçka dönemi C5 boş serum ile klasik kompleman cascade etkinleştirip insan kırmızı kan hücreleri oranında ben iC3b için i ciddi C3b ile opsonize yeterlidir. 9. onay, IgG – ve C3b-opsonizasyonla insan kırmızı kan hücrelerinin Fare anti-CD235a (Igg2b; bkz: Bölüm 6.1) IgG antikor ile insan kırmızı kan hücrelerinin opsonizasyonla yeşil veya kırmızı floresan fluorophore için Birleşik keçi Anti-fare (ikincil) IgG antikor ile hücreleri kuluçka onaylayın. 1 µL fare anti-CD235a IgG antikor ve 1 µL fluorescently etiketli Anti-fare ikincil antikor insan kırmızı kan hücreleri 400 µL askıya alınmasına ekleyip için 8 dk. 37 ° C’de kuluçkaya. Daha sonra iki kez (Bölüm 5.2-5,5 olduğu gibi) yıkayın. Resuspend hücre Pelet 400 µL ile modifiye RPMI 1640 (Hepes) orta ve pipet 100 µL süspansiyon bir kanal içine confocal floresan görüntüleme için slayt (bkz. Şekil 1 c).Not: Hücreleri olacak takip yıkama ve resuspension ama yıkama yığın (agglutinate) arka plan floresans ilişkisiz ikincil antikor nedeniyle azaltmak gereklidir. Opsonizasyonla insan kırmızı kan hücrelerinin, fare IgG ile önceden etiketli ve C3b/iC3b, örneğin kullanarak, fare Anti-fare C3b/iC3b/C3c antikor ve ikincil bir antikor, örneğin, C5 null fare serum ile Birleşik keçi Anti-sıçan IgG antikor inkübe onaylayın yeşil flüoresan fluorophore için. Bölüm 8 günahı insan kırmızı kan hücreleri kullanarak adımlarını yineleyin. 0,25 µL Fluorescently etiketli Anti-fare C3b/iC3b/C3c antikor (50 µL IgG etiketli insan kırmızı kan hücreleri + 50 µL C5 null fare serum) 100 µL karışıma ekleyin ve 8 dk 37 ° C’de kuluçkaya. İki kere yıka, Pelet 100 µL modifiye RPMI 1640 (Hepes) orta ve pipet süspansiyon bir kanal içine confocal floresan görüntüleme için slayt (bkz. Şekil 1 c) resuspend.