Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Die Protokolle folgen den Leitlinien unserer lokalen Humanforschung Ethik-Kommission sowie die Tierpflege-Richtlinien. 1. Isolation von Resident Maus peritonealen Makrophagen Opfern Sie die Maus (3 – 4 Monate alt (beiderlei Geschlechts); z.b. C57BL/6 Stamm) mit einer Überdosis des volatilen Anästhetikums Isofluran (> 5 % in Luft) oder Kohlendioxid13, gefolgt von zervikale Dislokation. Induktion der Anästhesie kann leicht durch Verlust der aufrichtenden reflex14sowie durch Verlust der Pfote Rückzug Reflex beurteilt werden. Nach der Reinigung des Bauches der Maus mit 80 % Ethanol in Wasser stellen einen Mittellinie Hautschnitt und Aussetzen der zugrunde liegenden Bauchwand. Legen Sie einen 24-G Kunststoff-Katheter in die Peritonium und Lavage der Hohlraum mit 2 x 4,5 mL eiskaltes Hank gepufferte Salzlösung (HBSS) ohne Ca2 + und Mg2 +über eine 5 mL kunststoffspritze. Während der Injektion, verlassen ca. 0,5 mL residual HBSS (5-4,5 mL (injiziert) = 0,5 mL) in der Spritze im Fall Gewebe in der Spitze des Katheters gesaugt und muss ausgeschlossen werden. Übertragen Sie die angesaugte Aussetzung in eine 14 mL Polypropylen Rundboden Röhrchen und Zentrifuge bei 300 X g 6,5 min bei Raumtemperatur.Hinweis: Die Spitze des Katheters Kunststoff ist stumpf, die im Vergleich zu einer Nadel, minimiert Verletzungen des Abdominal-Inhalts. In der Regel folgende sanfte Bauchmassage, 8 mL peritonealen Zellsuspension aus der Bauchhöhle abgerufen werden kann. Den überstand verwerfen und die peritonealen Zellen in 1 mL Bikarbonat-freie RPMI 1640 Medium mit 20 mM Hepes, 10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum und Antibiotika wie Penicillin (100 Einheiten/mL) und Streptomycin (100 µg/mL), vorbereitet durch Aufschwemmen 100 X Penicillin/Streptomycin 1: 100 Verdünnung. Dadurch werden in der Regel eine Konzentration von etwa 6 x 106 Zellen/mL.Hinweis: Etwa 30 % der isolierten peritonealen Zellen sind Makrophagen, während der andere (kleineren) Zellen Lymphozyten, überwiegend B-Zellen sind. 2. Aussaat von peritonealen Zellen im Kanal gleitet Nach dem pipettieren der Zellsuspension rauf und runter zur Reduzierung Verklumpung, pipette 100 µL Aussetzung in den vorgefüllten Kanal (Volume, 100 µL) einen Kanal Fibronektin-beschichtete Folie (100 µL Kanal hat die Abmessungen (Länge x Breite x Höhe): 50 x 5 mm 0,4 mm). Vorausfüllen von der Kammers durch eines der beiden Stauseen der Kanal Folie 1 mL Serum ergänzt RPMI 1640 (Hepes) Medium hinzufügen, kippen die Folie und dann Absaugen des Mediums aus dem nachgeschalteten Reservoir (Abbildung 1). Entfernen Sie unerwünschte Luftblasen, oder lange Streifen von Luft in den Kanal durch Hinzufügen 1 – 2 mL Medium auf eines der beiden Stauseen, fest Anwendung ein Deckel und dann Abpumpen der Luft durch rhythmische Daumendruck auf die Kappe und, wo nötig, kippen die Folie. Nach Vertreibung Luft, kippen Sie die Folie mit der nicht begrenzten Reservoir (und Medium enthalten) nach unten vor dem Entfernen der Kappe zur Vermeidung von Luft, zurück in den Kanal gesaugt. Inkubieren Sie die Kanal-Folie ausgesät mit Zellen in einer feuchten Kammer für 2 h bei 37 ° C in der Abwesenheit von CO2 (CO2 ist nicht erforderlich, da die HCO3-Co2 -Puffer-System wird durch Hepes ersetzt). Die Kanal-Folien können bequem auf einem Gestell enthält acht Folien platziert werden. In der Regel sind 6 – 8 Dias von einem Mausklick bereit, obwohl bis zu 10 oder mehr möglich ist. Entfernen Sie den Ständer und tauschen Sie das RPMI 1640 (Hepes) Medium in jede Folie für RPMI 1640 Medium enthält Bikarbonat, mit 10 % fötalen Rinderserum sowie Penicillin/Streptomycin ergänzt. Kippen Sie die Folie und Aspirieren Sie Medium zuerst aus der untere Behälter und dann aus dem oberen Becken. Als Nächstes fügen Sie 1 mL des neuen Mediums zu einem der Stauseen, kippen Sie die Rutsche und aspirat Medium aus dem nachgeschalteten Reservoir zu, nachdem es durch den Kanal geflossen ist. Füllen Sie nach dieser Waschschritt (Datenträgeraustausch) die Kanal-Folie durch Zugabe von 1 mL Medium zu einem der Stauseen.Hinweis: Waschschritten mit Kanal-Folien ist sehr einfach und effektiv im Hinblick auf die Lösung Austausch und nicht anhaftende Zellen entfernen. Beachten Sie, dass das Medium RPMI 1640 (Bicarbonat) normalerweise vorher inkubierten mit 5 % CO2 über Nacht um Wärme- und pH Gleichgewicht zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Am folgenden Tag durchführen Sie Experimente. 3. Isolation der menschlichen Erythrozyten Am Tag 2 (zweite Tag der Experimente; nach der Übernachtung Inkubation von isolierten peritonealen Makrophagen), 1 – 2 mL peripheren venösen Blut eines gesunden Spenders in einer heparinisierten Röhrchen zu sammeln. 1 mL zu einem Rundboden 2,0 mL (Polypropylen) Microcentrifuge Schlauch, Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 18 ° C (empirische Einstellung) zu übertragen, und den überstand (Plasma und buffy Coat) zu entfernen. Vorsichtig Aspirieren Sie 100 µL sedimentierten Erythrozyten und mischen Sie diese Band 1:1 mit modifizierten RPMI 1640 (Hepes) Medium (siehe unten) in einem Rundboden 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch. Beschriften Sie das Rohr “1:1”.Hinweis: Das Medium RPMI 1640 (Hepes) am 2. Tag (für Assays) nach Zellen zu isolieren enthält, zusätzlich 10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, Penicillin (100 Einheiten/mL), Streptomycin (100 µg/mL) und 1 mM N-(2-Mercaptopropionyl) Glycin (zu reduzieren Phototoxizität). Im folgenden wird dieses Medium als “modifizierte” RPMI 1640 (Hepes) Medium bezeichnet. 4 µL der 1:1 verdünnt erythrozytensuspension in 2 mL Pipette geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium, vorab zu einem 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch pipettiert (wiederholen Sie diesen Schritt, d. h. Vorbereitung 2 Röhren). Beschriften Sie jedes Rohr “4:2000”. Legen Sie die “1:1” und “4:2000” Röhren auf Eis. 4. Kennzeichnung der Plasmamembran Makrophagen Entfernen Sie die gesetzte Kanal Folien aus dem CO2 Inkubator und tauschen Sie RPMI 1640 (Bicarbonat) Medium in jede Folie für modifizierte RPMI 1640 (Hepes) Medium. Dann geben Sie die Zellen in einer feuchten Kammer bei 37 ° C in der Abwesenheit von CO2.Hinweis: Nach der Inkubation über Nacht und waschen, sind die meisten der Lymphozyten aus dem Kanal entfernt. Die Mehrheit der verbleibenden adhärenten Zellen sind Makrophagen, die morphologisch oder durch Immunfluoreszenz-Färbung mit Anti-F4/80 Antikörper identifiziert werden können. Etwa die 95 % der Maus resident peritonealen Makrophagen F4/80 positiv. Verdünnen Sie fluoreszent grün markierten Anti-Maus-F4/80 Antikörper (bei 4 ° C gelagert) 01:40 in veränderter RPMI 1640 (Hepes) Medium. Nehmen Sie eine Folie, kippen und pipette (tropfenweise) 100 µL der Antikörper-Mischung in die Öffnung des Kanals 100 µL der Folie (siehe Abbildung 1). Aspirieren Sie Medium, das in den nachgelagerten Stausee mündet. Inkubieren Sie die Zellen für 20 min bei 37 ° C (feuchte Umgebung, ohne CO2). Während der Inkubationszeit beschriften Sie die menschlichen Erythrozyten (siehe Abschnitt 5).Hinweis: Wie oben erwähnt, CO2 ist nicht erforderlich da die HCO3-Co2 -Puffer-System wird durch Hepes ersetzt. Nach 20 min Inkubationszeit (während die menschlichen Erythrozyten gebeizt und opsonized sind), waschen die Folie durch Zugabe von 1 mL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium zu den Stauseen und das Medium absaugen, nachdem es durch den Kanal geflossen ist durch erleichtert kippen die Folie. Fügen Sie 1 mL Medium für eine kurzfristige Speicherung oder fahren Sie mit einem Experiment (d. h. pipettieren in Partikel (opsonized rote Blutkörperchen) und imaging Phagozytose von Time-Lapse drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopie). 5. Kennzeichnung der Plasmamembran der menschlichen Erythrozyten Beginnen Sie, die Kennzeichnung der menschlichen Erythrozyten unmittelbar nach der Inkubation einer Folie von Makrophagen mit grünen eindringmittel beschriftete Anti-F4/80 Antikörper (nach Abschnitt 4.2). Nach schonendes mischen, 400 µL von einer der “4:2000” Röhren (siehe Abschnitt 3.3) zu nehmen und zu einem (Rundboden) 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch zu verzichten. Planen Sie Zeit für die Aussetzung auf etwa 37 ° C erwärmen (siehe Abschnitt unten). 0.4 µL Orange/rot fluoreszierende Plasmamembran Fleck (Aliquote bei-20 ° C gelagert), mischen und bei 37 ° C für 5 min inkubieren.Hinweis: Einen beheizten Aluminiumblock, platziert in der Laminar-Flow-Kapuze, eignet sich zur Minimierung der Wärmeverluste während der Vorbereitung Folien. Rohre können in Bohrbrunnen Heizblock und einem separaten platziert werden, oder integrierte, beheizte Aluminiumplatte dient als ein Arbeitsraum. Nach der Inkubationszeit 5 min Vorbereitung der ersten Waschschritt durch Zugabe von 1600 µL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium (um 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch zu füllen). Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g für 5 min bei 18 ° C (empirische Einstellung). Ein kompakte rote Pellet sollten an der Wand (d. h. außerhalb der Mitte) an der Unterseite des Rohres sichtbar. Drehen Sie das Rohr, so dass die Kugel nach oben zeigt, und entfernen Sie vorsichtig alle des Überstands nacheinander (in zwei Stufen) mit einer 1 – 1,5 mL PIPETTENSPITZE. Nach dem Absaugen des Überstands, durchmischen Sie 2.000 µL geändert RPMI 1640 (Hepes) mittlere, (um die Zellen zu Aufschwemmen), und wiederholen Sie die oben genannten Zentrifugation und überstand Aspiration Schritte. Aufzuwirbeln Sie das Pellet (der Plasmamembran gebeizt und 2 X gewaschen roten Blutkörperchen) mit 400 µL des modifizierten RPMI 1640 (Hepes) Medium. Beschriften Sie das Rohr PMS (Abkürzung für Plasmamembran Fleck).Hinweis: Alternativ der Succinimidyl Ester eines pH-Sensitive Rhodamin-Derivats, das mehr wird stark Leuchtstofflampen bei sauren pH genutzt werden, um menschliche Erythrozyten zu beschriften. In diesem Fall dient der Fluoreszenzintensität zusätzlich als Maß für die Phagosom Reifung nach Partikel verinnerlicht zu haben. 6. Opsonization (Beschriftung) der menschlichen Erythrozyten mit Maus Immunglobulin G (IgG) Fügen Sie 1 µL Maus (IgG2b) monoklonalen (Klon HIR2) Anti-Human CD235a (1 mg/mL) Antikörper (bei-20 ° C gelagert) in das Röhrchen mit der Bezeichnung PMS (siehe Abschnitte 5.2 – 5.5), mit der Plasmamembran gebeizt menschlichen Erythrozyten in 400 µL Medium suspendiert. CD235a (auch bekannt als Glycophorin A) ist ein erythroiden Abstammung-spezifischen Membran Sialoglycoprotein. Inkubation bei 37 ° C für 8 min. Beachten Sie, dass Opsonization der menschlichen Erythrozyten mit IgG Ursachen Agglutination (Verklumpung Zelle). Obwohl Agglutination als eine visuelle Anzeige der Opsonization dienen kann, ist es für die Darstellung der einzelnen phagocytic Effekte unerwünscht. Auf Agglutination umgehen, immer wieder mischen der Zellsuspension (alle 1 min) verwenden, zum Beispiel eine Variable 20-200 µL Volumen Pipette festgelegt zu 200 µL. Gegen Ende der Inkubationszeit von 8 min wenn gewünscht, waschen die Makrophagen-Folie, mit grün eindringmittel inkubiert beschriftet Antikörper Anti-F4/80, mit 1 mL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium. Sicherstellen Sie, dass die beiden Stauseen der Kanal Folie nach der Waschschritte Medium sind. 7. die Phagozytose der Plasmamembran imaging gebeizt und IgG beschichtet menschlichen roten Blutkörperchen Nach 8 min Inkubation mit Anti-CD235a Antikörper (Abschnitt 6.2), pipette 100 µL Aufhängung mit Plasmamembran gebeizt und IgG opsonized menschlichen roten Blutkörperchen in den Kanal eines Dias mit Makrophagen beschriftet mit grün fluoreszierenden Anti-F4 / 80 Antikörper (Schritt 4). So werden rote Fluoreszenz, IgG-opsonized menschlichen roten Blutkörperchen grün fluoreszierenden Fresszellen (Makrophagen) hinzugefügt. Als menschliche Erythrozyten hinzugekommen sind, montieren die Kanal-Folie auf einer drehenden Scheibe confocal Mikroskop (mit der Bühne Inkubator, eingestellt auf 37 ° C) für bildgebende Verfahren, z. B. über ein 60 X / 1,49 Ölimmersion Objektiv. Beginnen Sie imaging-so bald wie möglich, da Partikel beginnen, innerhalb von 1 min. zu begleichen.Hinweis: Wenn Sie fluoreszierende Kügelchen mit einem Durchmesser von 100 nm, wir gemessen, durch Analyse der Punkt verbreitet Funktionen, XY-Auflösungen von X = 0,22 µm, y = 0,23 µm (488 nm Laser) und X = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 nm-Laser). Jedoch um Immunofluoreszenz und Phototoxizität während Zeitraffer 3D-Bildgebung lebender Zellen zu verringern, gefährden wir räumliche Auflösung mit 2 x 2 binning. Binning erhöht die Empfindlichkeit (verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis) und der zulässigen Frame-Rate, aber auf Kosten der räumlichen Auflösung. Verwenden Sie einen perfekten Fokus (oder ähnlichen) System Fokus Drift bei Aufnahmen zu verhindern. Nach der Aktivierung der perfekte Fokus-System, verwenden Sie das Offset Steuerelement Fokus auf Makrophagen Lamellipodial Vorsprünge unmittelbar über dem Deckglas (siehe Hinweis unten) von der Kanal-Folie. Dieser Fokus-Ebene entspricht Z = 0 µm. erhalten Z-Stapel von-1 µm bis + 16 µm bei 0,8 µm Schritten die beläuft sich auf 22 Z-Scheiben. Z-Stapel, beispielsweise erzielt werden mit einer Rate von 1 Stapel (für jeden Kanal) alle 15 s für eine Gesamtmenge von 16 Minuten.Hinweis: Längere Aufnahme leiden unter Verlust der Bildqualität, vor allem durch Immunofluoreszenz. Z-Stacks sind für jeden der beiden Kanäle erworben: Makrophagen sind abgebildet mit einem 488 nm Laser (grün-Kanal) und menschlichen Erythrozyten werden mit einem 561 nm Laser (Rot-Kanal) abgebildet. Bei dieser Vorgehensweise erhalten Sie verschiedene Ansichten von Makrophagen, die Einnahme von IgG-opsonized menschlichen roten Blutkörperchen an verschiedenen Zeitpunkten (z. B. siehe Abbildung 2).Hinweis: Die Standardeinstellungen des Systems (mit 2 x 2 binning) sind: grün-Kanal (20,5 % Laser (50 mW; 488 nm) macht, 101 Empfindlichkeit (Bereich 0-255) und 200 ms Belichtungszeit); Rot-Kanal (10,5 % Laser (50 mW; 561 nm) macht, 101 Empfindlichkeit (Bereich 0-255) und 98 ms Belichtungszeit).Hinweis: Die unten auf der Kanal-Folie ist ein Polymer mit der gleichen Dicke wie ein Glas #1.5-Deckglas und die gleichen optischen Eigenschaften des Glases, aber vor allem das Material hat den Vorteil der Gasdurchlässigkeit. 8. imaging die Phagozytose der Plasmamembran gebeizt und Ergänzung-beschichtete menschlichen roten Blutkörperchen Ergänzung opsonize Plasmamembran gebeizt und IgG-opsonized roten Menschenblut Zellen ähnlich Abschnitte 5 und 6, außer statt pipettieren 4 µL der 1:1 verdünnt erythrozytensuspension in 2 mL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium, wie in Abschnitt 3.3 beschrieben, Pipette 4 µL in 1 mL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium, und die Röhre 4:1, 000 entsprechend zu kennzeichnen. So sind die menschlichen Erythrozyten 2 X mehr konzentriert. Die Schritte in den Abschnitten 4 und 5, aber beginnend mit der 4:1,000 anstatt der 4:2,000 verdünnt bestand der menschlichen Erythrozyten (4:1, 000 und 4:2,000 beziehen sich auf die spätere Verdünnungen von zunächst 1:1 verdünnt menschlichen roten Blutkörperchen in Abschnitten beschriebenen 3.1 und 3.2). Opfern einer C5 null Maus (z. B. B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Jackson-Labor) durch (> 5 % in Luft) Isofluran Inhalation gefolgt von Enthauptung und sammeln das Blut. Wir Tropfen in der Regel etwa 0,8 mL Blut in ein Rundboden 14 mL Plastikrohr unmittelbar nach Isofluran Inhalation und Enthauptung. Nach 1 h wenn das Blut vollständig koaguliert, übertragen Sie die Restflüssigkeit in einem 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Sammeln Sie anschließend, sorgfältig die gelbliche Serum. In der Regel erholen wir mindestens 200 µL C5 null Serum. Legen Sie das C5 null Serum auf Eis. Nach 4 min Inkubation der Plasmamembran menschlichen Erythrozyten mit IgG gebeizt, fügen Sie ein weiteres 1 µL Anti-CD235a Antikörper (mit 2 x konzentriert), und dann nehmen Sie 50 µL Zellsuspension und mischen Sie es in einem separaten 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch mit 50 µL C5 null Serum. Weiterhin wiederholt (alle 1 min) durch pipettieren rauf und runter wie in Abschnitt 6.2 für weitere 4 Minuten mischen. So, nach diesem Schritt haben die menschlichen Erythrozyten mit Anti-CD235a Antikörper für eine Gesamtmenge von 8 min inkubiert worden.Hinweis: Die Inkubationszeit von 4 min mit C5 null Serum genügt zur Aktivierung der klassischen Komplementkaskade und opsonize der menschlichen roten Blutkörperchen mit C3b, die um Faktor ich zu iC3b gespalten ist. 9. Bestätigung des IgG – und C3b-Opsonization der menschlichen Erythrozyten Bestätigen Sie Opsonization der menschlichen Erythrozyten mit Maus Anti-CD235a (IgG2b; siehe Abschnitt 6.1) IgG Antikörper durch Inkubation der Zellen mit Ziege Anti-Maus (sekundären) IgG Antikörper konjugiert, eine grüne oder rote fluoreszierende Fluorophor. 400 µL Aussetzung der menschlichen roten Blutkörperchen 1 µL Maus Anti-CD235a IgG Antikörper und 1 µL eindringmittel beschrifteten Anti-Maus Sekundärantikörper hinzu, und bei 37 ° C 8 min inkubieren. Anschließend waschen Sie zweimal (wie in den Abschnitten 5.2 – 5,5). Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 400 µL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium und Pipette 100 µL der Suspension in einen Kanal für die konfokale Fluoreszenz-Bildgebung schieben (siehe Abbildung 1).Hinweis: Die Zellen werden Büschel (agglutinieren) nach Waschen und Wiederfreisetzung, aber Waschen ist notwendig, um Hintergrundfluoreszenz durch ungebundene Sekundärantikörper zu reduzieren. Bestätigen Sie Opsonization der menschlichen Erythrozyten, vorab mit Maus IgG beschriftet und Ziege Anti-Ratte IgG Antikörper konjugiert mit C5 null Maus Serum mit C3b/iC3b verwenden, zum Beispiel, Ratte Anti-Maus C3b, iC3b/C3c Antikörper und z. B. Sekundärantikörper inkubiert um eine grüne fluoreszierende Fluorophor. Wiederholen Sie die Schritte in Abschnitt 8 mit ungefärbten menschlichen roten Blutkörperchen. Fügen Sie 0,25 µL eindringmittel beschriftet Anti-Maus C3b, iC3b/C3c Antikörper zu 100 µL-Mischung (50 µL IgG-Label menschlichen Erythrozyten + 50 µL C5 null Maus Serum) und bei 37 ° C 8 min inkubieren. Zweimal waschen Sie, Aufschwemmen Sie das Pellet in 100 µL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium und Pipette die Aussetzung in einen Kanal für die konfokale Fluoreszenz-Bildgebung schieben (siehe Abbildung 1).