Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

De protocollen volgen de richtlijnen van onze lokale menselijke onderzoek ethisch comité, alsmede de dierenverzorgers richtsnoeren. 1. isolatie van Resident muis peritoneale macrofagen Offeren van de muis (3-4 maanden van leeftijd (of geslacht); bv C57BL/6 stam) met behulp van een overdosis van de vluchtige verdoving Isofluraan (> 5% in lucht) of kooldioxide13, gevolgd door cervicale dislocatie. Inductie van de anesthesie kan gemakkelijk worden beoordeeld door verlies van de wetswijziging reflex14, alsmede door verlies van paw terugtrekking reflex. Na het schoonmaken van de buik van de muis met 80% ethanol in water, maken een middellijn huid incisie en de onderliggende buikwand blootstellen. Plaats een 24-G kunststof katheter in de peritonium en de lavage de holte met 2 x 4.5 mL ijskoud Henks gebufferde zoutoplossing (HBSS), zonder Ca2 + en Mg2 +via een kunststof spuit 5 mL. Terwijl het injecteren, verlaten ongeveer 0,5 mL residuele HBSS (5-4.5 mL (geïnjecteerd) = 0,5 mL) in de spuit in geval weefsel wordt meegezogen in het puntje van de katheter en moet worden uitgezet. Spoel de aanzuiging suspensie in een 14 mL polypropyleen ronde-onderkant-buis en centrifuge op 300 x g gedurende 6,5 minuten bij kamertemperatuur.Opmerking: De tip van de plastic katheter is blunt, die, vergeleken met een naald, minimaliseert letsel aan de buik inhoud. Typisch, volgende zachte buik massage, 8 mL peritoneale celsuspensie worden teruggehaald uit de peritoneale holte. Verwijder het supernatant en resuspendeer de peritoneale cellen in 1 mL natriumbicarbonaat-vrije RPMI 1640 medium met 20 mM Hepes, 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum en antibiotica, zoals penicilline (100 eenheden/mL) en streptomycine (100 µg/mL), opgesteld door 100 x penicilline/streptomycine 1:100 te verdunnen. Dit geeft meestal een concentratie van ongeveer 6 x 106 cellen/mL.Opmerking: Ongeveer 30% van de geïsoleerde peritoneale cellen zijn macrofagen, terwijl de andere (kleinere) cellen lymfocyten, voornamelijk B cellen zijn. 2. zaaien van peritoneale cellen in kanaal dia ‘s Na de celsuspensie omhoog en omlaag om te verkleinen samendoen pipetteren, Pipetteer 100 µL schorsing in het ingevulde kanaal (volume, 100 µL) van de dia van een fibronectine beklede kanaal (een 100 µL-kanaal heeft de afmetingen (lengte x breedte x hoogte): 50 x 5 mm 0,4 mm). Prefill de zaal door 1 mL serum-aangevuld RPMI 1640 (Hepes) medium toe te voegen aan een van de twee stuwmeren van de dia kanaal, kantelen van de dia en klik vervolgens aspirating het medium uit het stroomafwaarts reservoir (Figuur 1). Verwijder ongewenste luchtbellen of lange stroken van lucht, in het kanaal door 1-2 mL medium toe te voegen aan een van de twee stuwmeren, strak toe te passen een reservoir dop en dan pompen uit de lucht door de druk van de ritmische duim over het GLB en eventueel kantelen de dia. Na uitzetting van lucht, tilt de dia met de afgetopte reservoir (en bevattende medium) neerwaartse voordat het verwijderen van het GLB om te voorkomen dat de lucht gezogen terug in het kanaal. Incubeer de kanaal dia, bezaaid met cellen, in een vochtige kamer voor 2 uur bij 37 ° C in afwezigheid van CO2 (CO2 is niet verplicht sinds de HCO3-/CO2 buffersysteem is vervangen door Hepes). De kanaal-dia’s kunnen gemakshalve worden geplaatst op een rek, waarin acht dia’s. 6 – 8 dia’s zijn meestal bereid uit één muis, hoewel van 10 of meer mogelijk is. Verwijderen van het rek en het RPMI 1640 (Hepes) medium in elke dia voor RPMI 1640 middellange met bicarbonaat, aangevuld met 10% foetale runderserum, evenals penicilline/streptomycine uit te wisselen. Kantelen van de dia en gecombineerd medium eerst uit het onderste reservoir en vervolgens uit het bovenste reservoir. Daarna, voeg 1 mL van het nieuwe medium toe aan een van de stuwmeren, kantelen van de dia en aspirate medium uit de stroomafwaartse reservoir, nadat het door het kanaal is gestroomd. Na deze stap wassen (middellange exchange), de kanaal-dia te vullen door toevoeging van 1 mL medium aan een van de stuwmeren.Opmerking: Wassen stappen met behulp van kanaal dia’s is zeer eenvoudig en efficiënt in termen van de uitwisseling van de oplossing en niet-aanhanger cellen verwijderen. Merk op dat het medium RPMI 1640 (bicarbonaat) normaal vooraf bebroede met 5% CO2 ‘s nachts om thermische en pH evenwicht. Incubeer de cellen ‘s nachts bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Het uitvoeren van experimenten op de volgende dag. 3. isolatie van menselijke rode bloedcellen Op dag 2 (tweede dag van experimenten; na overnachting incubatie van de geïsoleerde peritoneale macrofagen), 1-2 mL perifeer veneuze bloed van een gezonde donor, in een heparinized buis verzamelen. Breng 1 mL in een ronde bodem 2,0 mL (polypropyleen) microcentrifuge buis, centrifuge op 300 x g gedurende 5 minuten bij 18 ° C (empirische instelling), en verwijder de bovendrijvende substantie (plasma en buffy coat). Zachtjes gecombineerd 100 µL van de gesedimenteerd rode bloedcellen en meng dit volume 1:1 met gemodificeerde RPMI 1640 (Hepes) medium (hieronder beschreven) in een ronde bodem 2,0 mL microcentrifuge buis. Label de buis “1:1”.Opmerking: Het RPMI 1640 (Hepes) medium gebruikt op dag 2 (voor testen) na isoleren cellen bevat, naast de 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, penicilline (100 eenheden/mL), streptomycine (100 µg/mL) en 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) glycine (te verminderen Fototoxiciteit). Dit medium is hierna te noemen “gewijzigde” RPMI 1640 (Hepes) medium. Pipetteer 4 µL van de 1:1 verdunde rode bloedcellen schorsing in 2 mL gemodificeerde RPMI 1640 (Hepes) medium, vooraf afgepipetteerde in een tube van 2,0 mL microcentrifuge (Herhaal deze stap, d.w.z. bereiden 2 buizen). Label elke buis “4:2000”. Plaats de buizen “1:1” en “4:2000” op het ijs. 4. etikettering van het plasmamembraan Macrophage De geplaatste kanaal dia’s te verwijderen uit de incubator van CO2 en het RPMI 1640 (bicarbonaat) medium in elke dia voor gemodificeerde RPMI 1640 (Hepes) medium uit te wisselen. Vervolgens plaatst u de cellen in een vochtige kamer bij 37 ° C in afwezigheid van CO2.Opmerking: Na overnachting incubatie en wassen, allermeest naar de lymfocyten worden verwijderd uit het kanaal. De meeste van de resterende Adherente cellen zijn macrofagen, die morfologisch of door immunofluorescentie kleuring met behulp van anti-F4/80 antilichaam kunnen worden geïdentificeerd. Ongeveer zijn 95% van de muis resident peritoneale macrofagen F4/80 positieve. Verdun fluorescently groene gelabelde anti-muis F4/80 antilichaam (opgeslagen bij 4 ° C) 1:40 in gewijzigde RPMI 1640 (Hepes) medium. Nemen van een dia, kantelen en Pipetteer 100 µL van de (druppel voor druppel) van de antilichaam-mengsel in de opening van het kanaal van de 100 µL van de dia (Zie Figuur 1). Gecombineerd medium dat mondt uit in het stroomafwaarts reservoir. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij 37 ° C (bevochtigde omgeving, zonder CO2). Label tijdens de incubatietijd, de menselijke rode bloedcellen (zie sectie 5).Opmerking: Zoals zinspeelde op bovenstaande, CO2 is niet vereist sinds het HCO3-/CO2 buffersysteem is vervangen door Hepes. Na 20 min incubatietijd (waarin menselijke rode bloedcellen zijn gekleurd en opsonized), was de dia door toevoeging van 1 mL RPMI 1640 (Hepes) middellange tot één van de reservoirs en de aspirating van het medium bewerkt, nadat het is gestroomd via het kanaal, vergemakkelijkt door de dia te kantelen. Voeg 1 mL medium voor korte termijn opslag of overgaan tot een experiment (dat wil zeggen, pipetting in deeltjes (opsonized rode bloedcellen) en imaging fagocytose door time-lapse draaiende schijf confocale microscopie). 5. het labelen van het Plasma-membraan van menselijke rode bloedcellen Om te beginnen de etikettering van menselijke rode bloedcellen onmiddellijk na een dia aan van macrofagen met groene fluorescently geëtiketteerde anti-F4/80 antilichaam aan het broeden (na punt 4.2). Na het zacht mengen, neem 400 µL van een van de buizen van de “4:2000” (zie punt 3.3) en afzien van het in een buis (ronde onderkant) 2,0 mL microcentrifuge. Tijd voor de schorsing te warm tot ongeveer 37 ° C (zie alinea hieronder). Toevoegen van 0.4 µL oranje/rood fluorescerende plasmamembraan vlek (aliquots opgeslagen bij-20 ° C), meng en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.Opmerking: Een verwarmde aluminium blok, geplaatst binnen de laminaire flow-kap, is handig voor het minimaliseren van warmteverlies bij de voorbereiding van de dia’s. Buizen kunnen worden geplaatst in boring putjes van het blok van de verwarming en een separaat of geïntegreerd, verwarmde aluminiumplaat kan dienen als een werkruimte. Na de incubatieperiode 5 min bereiden u eerst wassen door toevoeging van 1600 µL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) medium (om te vullen de 2,0 mL microcentrifuge buis). Centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 5 min bij 18 ° C (empirische instelling). Een compacte rode pellet moet zichtbaar zijn op de muur (dat wil zeggen, uit het midden) van de onderkant van de buis. Draai de buis zo dat de pellet naar boven zijn gericht en verwijder voorzichtig alle van het supernatans achtereenvolgens (in twee stappen) met behulp van een 1-1.5 mL pipet tip. Na aspirating het supernatant, 2.000 µL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) middellange, mix (om resuspendeer de cellen) toevoegen en herhaal de bovenstaande stappen voor centrifugeren en supernatant aspiratie. Resuspendeer de pellet (van plasmamembraan gekleurd en 2 x gewassen rode bloedcellen) met 400 µL van gemodificeerde RPMI 1640 (Hepes) medium. Label de buis PMS (afkorting voor plasmamembraan vlek).Opmerking: U kunt ook de succinimidyl ester van een pH-gevoelige rhodamine derivaat, die meer wordt sterk fluorescerende bij zure pH, kan worden gebruikt om menselijke rode bloedcellen label. In dit geval, fungeert de intensiteit van de fluorescentie daarnaast als een maatregel van phagosome rijping nadat deeltjes hebben zijn geïnternaliseerd. 6. opsonization (etikettering) van menselijke rode bloedcellen met muis immunoglobuline G (IgG) Voeg 1 µL muis (IgG2b) monoclonal (kloon HIR2) anti-menselijke CD235a (1 mg/mL) antilichaam (opgeslagen bij-20 ° C) aan de buis PMS (Zie secties 5.2 – 5.5), aangeduid met plasmamembraan gekleurd menselijke rode bloedcellen geschorst in 400 µL medium. CD235a (ook bekend als glycophorin A) is een erythroid afstamming-specifieke membraan-sialoglycoprotein. Incubeer bij 37 ° C gedurende 8 minuten opmerking dat opsonization van menselijke rode bloedcellen met IgG oorzaken agglutinatie (cel samendoen). Hoewel agglutinatie als een visuele indicator van opsonization dienen kan, is het onwenselijk zijn voor de beeldvorming van afzonderlijke fagocytische effecten. Ingesteld op 200 µL te omzeilen agglutinatie, herhaaldelijk Meng de celsuspensie (elk 1 min) gebruikt, bijvoorbeeld een variabele 20-200 µL volume pipet. Tegen het einde van de incubatieperiode 8 min, als gewenste, wassen op de macrofaag dia, geïncubeerd met groene fluorescently-label anti-F4/80 antilichaam, met 1 mL gemodificeerde RPMI 1640 (Hepes) medium. Zorgen ervoor dat beide reservoirs van de dia kanaal vrij van medium na de stappen wassen. 7. de fagocytose van plasmamembraan imaging gekleurd en IgG-gecoate menselijke rode bloedcellen Na de incubatie 8 min met anti-CD235a antistof (punt 6.2) Pipetteer 100 µL schorsing met plasmamembraan-gekleurd en IgG-opsonized menselijke rode bloedcellen in het kanaal van een dia waarin macrofagen gemarkeerd met groen fluorescent anti-F4 / 80 antilichaam (stap 4). Dus worden rood fluorescerende, IgG-opsonized menselijke rode bloedcellen toegevoegd aan de groen fluorescente fagocyten (macrofagen). Zodra de menselijke rode bloedcellen bijgekomen, mount de kanaal dia op een draaiende schijf confocal microscoop (met de fase incubator ingesteld op 37 ° C) voor imaging, bijvoorbeeld via een 60 X / 1,49 olie-immersie objectief. Start zo snel mogelijk, imaging aangezien deeltjes beginnen te vestigen binnen 1 min.Opmerking: Het gebruik van fluorescerend parels met een diameter van 100 nm, we gemeten, door analyse van punt verspreiding functies, XY resoluties voor x = 0,22 µm, y = 0,23 µm (488 nm laser) en x = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 nm laser). Echter, verklein photobleaching en fototoxiciteit tijdens time-lapse 3D beeldvorming van levende cellen en wij compromissen sluiten ruimtelijke resolutie met behulp van 2 x 2 weggooien. Weggooien verhoogt de gevoeligheid (verbetert de signal-to-noise verhouding) en de toegestane framesnelheid, maar ten koste van ruimtelijke resolutie. Gebruik een perfecte focus (of soortgelijke) systeem om te voorkomen dat focus drift tijdens opnames. Na het activeren van de perfecte focus systeem, met de opdracht verschuiving te concentreren op macrophage lamellipodial uitsteeksels direct boven het dekglaasje aan (zie hieronder nota) van de dia van het kanaal. Deze focus-niveau correspondeert met Z = 0 µm. verkrijgen Z-stacks van-1 µm in +16 µm 0.8 µm stappen, wat neerkomt op 22 Z-segmenten. Z-stacks, bijvoorbeeld bekomen worden met een snelheid van 1 stapel (voor elk kanaal) elke 15 s voor een totaal van 16 min.Opmerking: Langere opname lijdt verlies van beeldkwaliteit, voornamelijk als gevolg van photobleaching. Z-stacks zijn verworven voor elk van de twee kanalen: macrofagen zijn beeld met behulp van een 488 nm laser (groene kanaal) en menselijke rode bloedcellen zijn beeld met behulp van een 561 nm laser (rode kanaal). Met behulp van deze aanpak, verschillende weergaven van de macrofagen inname van IgG-opsonized menselijke rode bloedcellen op verschillende tijdstippen kunnen worden verkregen (bijvoorbeeld, Zie Figuur 2).Opmerking: De standaardinstellingen van het systeem (met 2 x 2 weggooien) zijn: groene kanaal (20,5% laser (50 mW; 488 nm) macht, 101 gevoeligheid (bereik 0 – 255) en 200 ms belichtingstijd); rode kanaal (10,5% laser (50 mW; 561 nm) macht, 101 gevoeligheid (bereik 0-255) en 98 ms belichtingstijd).Opmerking: De onderkant van de dia van het kanaal is een polymeer met dezelfde dikte als een dekglaasje #1.5 glas aan en dezelfde optische eigenschappen van glas, maar met name het materiaal heeft het voordeel van gas permeabiliteit. 8. imaging de fagocytose van plasmamembraan gekleurd en menselijke rode bloedcellen aanvulling beklede Aanvulling-opsonize plasmamembraan gekleurd en IgG-opsonized rode bloed cellen op dezelfde manier aan de punten 5 en 6, behalve, in plaats van pipetting 4 µL van de schorsing van de 1:1 verdunde rode bloedcel in 2 mL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) medium, zoals beschreven in punt 3.3, Pipetteer 4 µL in 1 mL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) medium, en dienovereenkomstig label de buis 4:1, 000. De menselijke rode bloedcellen zijn dus 2 x meer geconcentreerd. Verder met de stappen in de secties 4 en 5, maar beginnen met de 4:1,000 in plaats van de voorraad 4:2,000 verdund van menselijke rode bloedcellen (4:1, 000 en 4:2,000 verwijzen naar de volgende verdunningen van de aanvankelijk 1:1 verdunde menselijke rode bloedcellen beschreven in secties 3.1 en 3.2). Offeren een C5 null muis (bijvoorbeeld B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Jackson Laboratory) inademing (> 5% in lucht) Isofluraan gevolgd door onthoofding, en verzamelen van het bloed. Meestal druipen we ongeveer 0,8 mL bloed in een ronde bodem 14 mL plastic buis onmiddellijk na Isofluraan inhalatie en onthoofding. Na 1 uur wanneer het bloed is volledig gecoaguleerd, overdracht van de resterende vloeistof in een tube van 2,0 mL microcentrifuge en centrifuge op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, zorgvuldig verzamelen de gelige serum. Meestal herstellen wij minstens 200 µL C5 null serum. Plaats de C5 null serum op ijs. Nadat 4 min incubatie van plasmamembraan menselijke rode bloedcellen met IgG bevlekt, voeg een ander 1 µL van anti-CD235a antistof (het geven van 2 x geconcentreerd), en vervolgens 50 µL van de celsuspensie nemen en meng het in een aparte 2,0 mL microcentrifuge buis met 50 µL C5 null serum. Blijven herhaaldelijk Meng (elk 1 min) door pipetteren op en neer, zoals in punt 6.2, voor een andere 4 min. Dus, na deze stap, de menselijke rode bloedcellen hebben zijn geïncubeerd met anti-CD235a antistof voor een totaal van 8 min.Opmerking: De incubatietijd 4 min met C5 null serum is voldoende om te activeren van de klassieke complement cascade en opsonize de menselijke rode bloedcellen met C3b, die is cleaved met Factor ik naar iC3b. 9. bevestiging van IgG – en C3b-opsonization van menselijke rode bloedcellen Opsonization van menselijke rode bloedcellen met muis anti-CD235a IgG (IgG2b; zie punt 6.1) antilichaam bevestigen door het broeden van de cellen met de geit anti-muis (secundaire) IgG antilichamen geconjugeerd met een groen of rood fluorescerende fluorophore. Voeg 1 µL muis anti-CD235a IgG antilichamen en 1 µL fluorescently geëtiketteerde anti-muis secundair antilichaam tot 400 µL opschorting van menselijke rode bloedcellen, en Incubeer bij 37 ° C gedurende 8 minuten. Vervolgens wassen twee keer (zoals in secties 5.2 – 5.5). Resuspendeer de pellet cel met 400 µL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) medium en Pipetteer 100 µL van de schorsing in een kanaal (Zie Figuur 1 c) schuif voor beeldvorming van de confocal fluorescentie.Opmerking: De cellen zal klomp (agglutineert) na wassen en resuspensie, maar wassen is nodig om de achtergrond fluorescentie als gevolg van niet-afhankelijke secundair antilichaam. Bevestigen van de opsonization van menselijke rode bloedcellen, vooraf aangeduid met muis IgG en geïncubeerd met C5 null muis serum, met C3b/iC3b gemaakt met, bijvoorbeeld, rat anti-muis C3b/iC3b/C3c antilichaam en een secundair antilichaam, bijvoorbeeld geit anti-rat IgG antilichamen zijn geconjugeerd om een groen fluorescerend fluorophore. Herhaal de stappen in sectie 8 met behulp van onbevlekt menselijke rode bloedcellen. Voeg 0,25 µL fluorescently label anti-muis C3b/iC3b/C3c antilichaam aan de 100 µL mengsel (50 µL IgG-geëtiketteerden menselijke rode bloedcellen + 50 µL C5 null muis serum) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 8 minuten. Twee keer wassen, resuspendeer de pellet in 100 µL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) medium en Pipetteer de schorsing in een kanaal (zie figuur 1 c) schuif voor beeldvorming van de confocal fluorescentie.