Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Os protocolos sigam as orientações da nossa Comissão de ética de pesquisa humana local, bem como as orientações de cuidados com animais. 1. isolamento de macrófagos peritoneais Mouse residente Sacrificar o mouse (3 – 4 meses de idade (ambos os sexos); por exemplo C57Bl/6 COE) usando uma overdose do isoflurano anestésico voláteis (> 5% no ar) ou dióxido de carbono13, seguido por deslocamento cervical. Indução da anestesia pode ser facilmente avaliada pela perda de endireitamento reflexo14, bem como pela perda do reflexo de retirada de pata. Depois de limpar a barriga do mouse com 80% de etanol na água, fazer uma incisão de pele e expor a parede abdominal subjacente. Colocar um cateter plástico 24-G na peritonium e sal solução (HBSS), sem Ca2 + e Mg2 +através de uma seringa de plástico de 5 mL de tampão de lavagem da cavidade com 2 x 4,5 mL gelada do Hank. Enquanto injetando, deixar cerca de 0,5 mL residual HBSS (5 – 4,5 mL (injetado) = 0,5 mL) em seringa no caso tecido é sugado para dentro da ponta do cateter e precisa ser expulso. Transferi a aspirado suspensão em um tubo de fundo redondo 14 mL polipropileno e centrifugar x g por 6,5 min à temperatura ambiente.Nota: A ponta do cateter plástico é blunt, que, em comparação com uma agulha, minimiza o prejuízo para o conteúdo abdominal. Normalmente, a seguir suave massagem abdominal, suspensão de células peritoneais de 8 mL pode ser recuperada da cavidade peritoneal. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células peritoneais 1ml livre de bicarbonato RPMI 1640 meio contendo 20 mM Hepes, 10% inactivadas pelo calor fetal bovino soro e antibióticos, como penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 µ g/mL), elaborado pelo diluindo 100 x penicilina/estreptomicina 1: 100. Isso normalmente dá uma concentração de cerca de 6 x 106 células/mL.Nota: Cerca de 30% de células isoladas peritoneais são macrófagos, enquanto as outras células (menores) são linfócitos, predominantemente as células B. 2. semeadura de células Peritoneal no canal Slides Depois de pipetagem a suspensão de células acima e para baixo para reduzir a aglutinação, Pipetar 100 suspensão µ l para o canal pré-carregadas (volume, 100 µ l) de um slide fibronectina revestido canal (um canal de 100 µ l tem as dimensões (comprimento x largura x altura): 50 mm x 5 mm 0,4 mm). Prefill câmara adicionando 1 mL de meio de RPMI 1640 (Hepes) de soro-completado para um dos dois reservatórios do slide canal, inclinando o slide e depois aspirar o meio do reservatório de jusante (Figura 1). Bolhas de ar remover indesejado, ou longas tiras de ar, no canal da mancha, adicionando 1 a 2 mL de meio para um dos dois reservatórios, firmemente aplicando um tampão do reservatório e então bombear para fora o ar através da pressão do polegar rítmica na tampa e, sempre que necessário, inclinando o slide. Após a expulsão de ar, incline o slide com o reservatório sem tampa (e contendo meio) para baixo antes de remover a tampa para evitar o ar sendo sugado para dentro do canal. Incubar o slide de canal, semeado com células, em uma câmara úmida para 2 h a 37 ° C, na ausência de CO2 (CO2 não é necessário desde o HCO3-/CO2 sistema de tampão Hepes redacção). Os slides de canal podem ser convenientemente colocados em uma cremalheira, que detém oito slides. Normalmente, 6 – 8 slides são preparados a partir de um rato, embora acima de 10 ou mais são possível. Retire o cesto e trocar o meio RPMI 1640 (Hepes) em cada slide para o bicarbonato contendo meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino, bem como a penicilina/estreptomicina. Incline o slide e aspire o médio primeiro do reservatório inferior e, em seguida, do reservatório superior. Em seguida, adicionar 1 mL do meio de novo para um dos reservatórios, incline o slide e aspirado médio do reservatório a jusante, depois tem fluiu através do canal. Após esta etapa de lavagem (câmbio médio), preencha o slide do canal, adicionando 1 mL de meio de um dos reservatórios.Nota: Lavar etapas usando slides de canal é muito simples e eficaz em termos de troca de solução e a remoção de células não-aderentes. Observe que o meio RPMI 1640 (bicarbonato) é normalmente pré-incubado com 5% CO2 durante a noite para garantir o equilíbrio térmico e pH. Incube as células durante a noite a 37 ° C, numa incubadora umidificado com 5% de CO2. Realizar experiências no dia seguinte. 3. isolamento de células vermelhas do sangue humano No dia 2 (segundo dia de experimentos; após incubação overnight de macrófagos peritoneais isolados), coletar sangue venoso periférico de 1 a 2 mL de um doador saudável, em um tubo heparinizado. Transferir 1 mL para um tubo de microcentrifugadora fundo redondo 2,0 mL (polipropileno), centrifugar 300 x g por 5 min à 18 ° C (configuração empírica) e remover o sobrenadante (plasma e buffy coat). Delicadamente, Aspire 100 µ l de células vermelhas do sangue sedimentadas e misturar este volume 1:1 com RPMI 1640 (Hepes) meio modificado (descrito abaixo) em um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL de fundo redondo. Rotule o tubo “1:1”.Nota: O meio RPMI 1640 (Hepes) usado no dia 2 (para ensaios) depois de isolar as células contém, além de 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, penicilina (100 unidades/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) glicina (para reduzir fototoxicidade). Doravante, este meio é referido como “modificado” meio RPMI 1640 (Hepes). Pipetar 4 µ l de suspensão de células de sangue vermelho diluído 1:1 para 2 mL modificou o meio RPMI 1640 (Hepes), pre-pipetado em um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL (repita essa etapa, ou seja, preparar 2 tubos). Etiquete cada tubo “4:2000”. Coloque os tubos “1:1” e “4:2000” no gelo. 4. rotulagem de membrana plasmática macrófago Retire os slides canal semeado a incubadora de CO2 e trocar o meio RPMI 1640 (bicarbonato) em cada slide para meio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Em seguida, coloca as células em uma câmara úmida a 37 ° C, na ausência de CO2.Nota: Após incubação durante a noite e lavar, a maioria dos linfócitos é removida do canal. A maioria das restantes células aderentes são macrófagos, que podem ser identificados morfologicamente ou pela mancha da imunofluorescência usando anticorpo anti-F4/80. Cerca de 95% de macrófagos peritoneais residente do rato são F4/80 positivo. Dilua o verde fluorescente etiquetado anti-rato F4/80 anticorpo (armazenado a 4 ° C) 01:40 em meio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Pegue um slide, incliná-lo e pipetar (gota a gota), 100 µ l da mistura de anticorpos para a abertura do canal 100 µ l do slide (ver Figura 1). Meio de aspirado que flui para o reservatório a jusante. Incube as celulas por 20 min a 37 ° C (ambiente umidificado, sem CO2). Durante o período de incubação, rotule as células vermelhas do sangue humanas (ver secção 5).Nota: Como aludido acima, CO2 não é necessário desde o HCO3-/CO2 sistema de tampão Hepes redacção. Depois de 20 min tempo de incubação (durante o qual células vermelhas do sangue humanas são manchadas e opsonizadas), lavagem do slide, adicionando 1 mL modificado meio RPMI 1640 (Hepes) a um dos reservatórios e aspirando o meio depois que fluiu através do canal, facilitada pela inclinando o slide. Adicionar 1 mL de meio para armazenamento a curto prazo ou proceder a um experimento (ou seja, pipetagem em partículas (opsonized células vermelhas do sangue) e imaging fagocitose pela microscopia confocal do disco girando lapso de tempo). 5. rotulagem da membrana plasmática das células vermelhas do sangue humano Começa a rotulagem das células vermelhas do sangue humanas imediatamente após incubação de um slide de macrófagos com verde fluorescente etiquetadas de anticorpos anti-F4/80 (depois da seção 4.2). Após a mistura suave, tomar 400 µ l de um dos tubos de “4:2000” (ver seção 3.3) e dispense-lo em um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL (fundo redondo). Um prazo para a suspensão aquecer em torno de 37 ° c (Veja o parágrafo abaixo). Adicionar a mancha de vermelho/laranja fluorescente a membrana plasmática de 0,4 µ l (alíquotas armazenadas a-20 ° C), misturar e incubar a 37 ° C por 5 min.Nota: Um bloco de alumínio aquecido, colocado dentro do capô de fluxo laminar, é útil para minimizar a perda de calor durante a preparação de slides. Os tubos podem ser colocados em poços do bloco de aquecimento e um separado, ou placa de alumínio integrado, aquecida pode servir como um espaço de trabalho. Após o período de incubação de 5 min, prepare a primeira etapa de lavagem, adicionando 1600 µ l modificado RPMI 1640 (Hepes) médio (para encher o tubo de microcentrifuga 2,0 mL). Centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 min à 18 ° C (configuração empírica). Um sedimento compacto vermelho deve ser visível na parede (ou seja, fora do centro) na parte inferior do tubo. Girar o tubo, de modo que o sedimento é virada para cima e remova cuidadosamente todo o sobrenadante sucessivamente (em duas etapas) usando uma ponta de pipeta de 1-1,5 mL. Depois de aspirar o sobrenadante, adicionar 2.000 µ l modificado RPMI 1640 (Hepes) médio, mistura (para Ressuspender as células) e repita os passos acima de aspiração de centrifugação e o sobrenadante. Resuspenda o pellet (da membrana plasmática manchado e 2x lavado de células vermelhas do sangue) com 400 µ l de meio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Rotule o tubo PMS (abreviatura de membrana plasmática mancha).Nota: Como alternativa, o succinimidil éster de um derivado de rodamina sensíveis ao pH, o que torna-se mais fortemente fluorescente em pH ácido, pode ser usado para rotular células vermelhas do sangue humanas. Neste caso, a intensidade da fluorescência além disso serve como uma medida da maturação do fagossoma depois de partículas têm sido internalizadas. 6. opsonização (etiquetagem) de humano glóbulos vermelhos com Mouse imunoglobulina G (IgG) Adicionar 1 µ l do mouse (IgG2b) anticorpo monoclonal (clone HIR2) anti-humano CD235a anticorpo (1 mg/mL) (armazenado a-20 ° C) ao tubo rotulado PMS (ver secções 5.2 – 5.5), contendo membrana plasmática manchado humanas hemácias suspendidas no meio de 400 µ l. CD235a (também conhecido como glucoforina A) é um sialoglycoprotein de membrana específicas de linhagem eritroide. Incube a 37 ° C por 8 min. nota a opsonização das células vermelhas do sangue humanas com IgG causas aglutinação (aglutinação de células). Apesar de aglutinação pode servir como um indicador visual de opsonização, é indesejável para a imagem do único efeitos fagocíticas. Para contornar a aglutinação, repetidamente misturar a suspensão de eritrócitos (cada 1 min), usando, por exemplo, uma variável pipeta de volume 20-200 µ l definir a 200 µ l. No final do período de incubação de 8 min, se desejado, lave o slide do macrófago, incubado com verde fluorescente etiquetado anticorpo anti-F4/80, com 1 mL modificado meio RPMI 1640 (Hepes). Certifique-se de que ambos os reservatórios do slide canal são livres de médio após as etapas de lavagem. 7. a fagocitose de membrana plasmática de imagem manchada e IgG-revestido de células vermelhas do sangue humano Após a incubação de 8 min com anticorpo anti-CD235a (seção 6.2), Pipetar 100 suspensão de µ l contendo manchadas de membrana plasmática e IgG-opsonizada humanas células vermelhas do sangue dentro do canal de um slide contendo macrófagos rotulados com verde fluorescente anti-F4 / 80-anticorpo (passo 4). Assim, vermelhos fluorescentes, IgG-opsonizada humanos glóbulos vermelhos são adicionados ao verdes fluorescentes fagócitos (macrófagos). Quando células vermelhas do sangue humanas foram adicionadas, montar o slide de canal em um microscópio confocal de disco girando (com a incubadora de estágio definida a 37 ° C) para a imagem latente, por exemplo, através de um 60 X / 1.49 lente objetiva de imersão de óleo. Começa a imagem logo que possível, desde que as partículas começarem a resolver dentro de 1 min.Nota: Usando grânulos fluorescentes com um diâmetro de 100 nm, medimos, através da análise de ponto de espalhar funções, resoluções XY de x = 0,22 µm, y = 0,23 µm (488 nm do laser) e x = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 laser nm). No entanto, para reduzir o fotobranqueamento e fototoxicidade durante o lapso de tempo de imagem 3D de células vivas, comprometemos a resolução espacial usando binning 2×2. Binning aumenta a sensibilidade (melhora a relação sinal-ruído) e a taxa de quadros permissível, mas à custa de resolução espacial. Use um foco perfeito (ou similar) sistema para evitar o desvio de foco durante as gravações. Depois de ativar o sistema de foco perfeito, use o controle de deslocamento de foco para saliências de lamellipodial macrófago imediatamente acima a lamela (ver nota abaixo) do slide canal. Este nível de foco corresponde a Z = 0 µm. obter Z-pilhas de µm-1 a + 16 µm, 0,8 µm passos, que se eleva a 22 Z-fatias. Z-pilhas, por exemplo, contactar a uma taxa de 1 pilha (para cada canal) a cada 15 s para um total de 16 min.Nota: Longos períodos de gravação sofrem perdas de qualidade de imagem, principalmente devido ao fotobranqueamento. Z-pilhas são adquiridos por cada um dos dois canais: os macrófagos são fotografados usando um laser de 488 nm (canal verde) e células vermelhas do sangue humanas são fotografadas usando um laser de nm 561 (canal vermelho). Usando essa abordagem, várias visões de macrófagos ingerindo opsonizada-IgG humanas células vermelhas do sangue em momentos diferentes podem ser obtidos (por exemplo, ver Figura 2).Nota: As configurações típicas do sistema (com binning 2×2) são: canal verde (laser de 20,5% (50 mW; 488 nm) de potência, sensibilidade 101 (intervalo, 0-255) e tempo de exposição de 200 ms); canal vermelho (laser de 10,5% (50 mW; 561 nm) de potência, sensibilidade 101 (intervalo, 0-255) e tempo de exposição 98 ms).Nota: A parte inferior do slide canal é um polímero com a mesma espessura que uma lamela de vidro #1.5 e as mesmas propriedades ópticas de vidro, mas, notadamente, o material tem a vantagem de permeabilidade de gás. 8. a fagocitose de membrana plasmática manchada revestida complemento humano glóbulos vermelhos e de imagem Membrana de plasma complemento-opsonize manchado e IgG-opsonizada vermelho sangue células da mesma forma para seções 5 e 6, exceto, em vez de pipetagem µ 4 l de suspensão de células de sangue vermelho diluído 1:1 em meio RPMI 1640 (Hepes) de 2 mL modificado, conforme descrito na seção 3.3, Pipetar 4 µ l meio RPMI 1640 (Hepes) de 1 mL modificado e por conseguinte rotular o tubo 4:1, 000. Assim, as células vermelhas do sangue humanas são 2x mais concentrado. Prossiga com as etapas nas seções 4 e 5, mas começando com o 4:1,000, ao invés do estoque de 4:2,000 diluído de células vermelhas do sangue humanos (4:1, 000 e 4:2,000 se referem as diluições subsequentes de inicialmente de 1:1 diluídas humanas células vermelhas do sangue descritas nas seções 3.1 e 3.2). Sacrificar um C5 nula do mouse (por exemplo, B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Laboratório de Jackson) por inalação de isoflurano (> 5% no ar) seguida por decapitação e coletar o sangue. Nós geralmente gotejamento cerca de 0,8 mL de sangue em um tubo de plástico 14 mL de fundo redondo imediatamente após a decapitação e inalação de isoflurano. Após 1 h, quando o sangue é totalmente coagulado, transferi o líquido residual em um tubo de microcentrifuga de 2,0 mL e centrifugar 300 x g por 5 min à temperatura ambiente. Posteriormente, cuidadosamente colete o soro amarelado. Normalmente, recuperar pelo menos 200 µ l C5 nulo soro. Coloca o soro nulo C5 no gelo. Após incubação de 4 min da membrana plasmática manchadas de células vermelhas do sangue humanas com IgG, adicione outro 1 μl do anticorpo anti-CD235a (dando 2 x concentrada), pegar 50 µ l de suspensão de célula e misturá-lo em um tubo de microcentrifuga separado 2,0 mL contendo nulo de C5 50 µ l soro. Continue a misturar várias vezes (a cada 1 min) pipetando acima e para baixo, como na seção 6.2, por mais 4 minutos. Assim, após esta etapa, as células vermelhas do sangue humanas foram incubadas com anticorpo anti-CD235a para um total de 8 min.Nota: O período de incubação de 4 min com soro nulo C5 é suficiente para ativar a cascata do complemento clássica e opsonize os glóbulos vermelhos humanos com C3b, o qual é clivado pelo Factor eu iC3b. 9. confirmação de IgG – e C3b-opsonização das células vermelhas do sangue humano Confirme a opsonização das células vermelhas do sangue humanas com anticorpo de IgG (IgG2b; ver secção 6.1) anti-CD235a rato incubando-se as células com cabra anti-rato (secundário) anticorpo IgG conjugado com um fluoróforo fluorescente verde ou vermelho. Adicione o anticorpo de IgG 1 µ l do mouse anti-CD235a e 1 µ l fluorescente etiquetadas anti-rato anticorpo secundário a uma suspensão de 400 µ l de células vermelhas do sangue humanas e incubar a 37 ° C durante 8 min. Posteriormente, lavar duas vezes (como em secções 5.2 – 5.5). Ressuspender o centrifugado com 400 µ l modificado RPMI 1640 (Hepes) médio e pipetar 100 µ l de suspensão em um canal de deslize (ver Figura 1) para a imagem latente confocal de fluorescência.Nota: As células serão moita (aglutinação) após a lavagem e ressuspensão, mas de lavagem é necessária reduzir fluorescência de fundo devido ao anticorpo secundário não acoplado. Confirmar a opsonização de glóbulos vermelhos humanos, previamente rotulado com mouse IgG e incubadas com o soro de rato nula de C5, com C3b/iC3b usando, por exemplo, rato anti-rato C3b/iC3b/C3c anticorpo e um anticorpo secundário, por exemplo, anticorpo de IgG anti-rato cabra conjugado para um fluoróforo fluorescente verde. Repita as etapas na seção 8 usando imaculados humanos glóbulos vermelhos. Adicione 0,25 µ l fluorescente etiquetado anticorpos de C3b/iC3b/C3c anti-rato à mistura de 100 µ l (50 µ l rotulado de IgG humana glóbulos vermelhos + 50 µ l de soro rato nula C5) e incubar a 37 ° C durante 8 min. Lave duas vezes, resuspenda o pellet em 100 µ l modificado RPMI 1640 (Hepes) médio e pipeta a suspensão em um canal de deslize (ver Figura 1) para a imagem latente confocal de fluorescência.