Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.
Fagocitosis juega un papel clave en la defensa del huésped, así como en el mantenimiento y desarrollo de tejido y consiste en los cambios rápidos, mediada por el receptor del citoesqueleto de actina, envuelven y fagocitar las partículas grandes. Aunque se han identificado receptores fagocíticos, vías de señalización corriente abajo y efectores, tales como Rho GTPasas, la remodelación citoesqueleto dinámico de eventos fagocíticas mediada por receptores específicos siguen siendo confusos. Hace cuatro décadas, dos mecanismos distintos de la fagocitosis, ejemplificado por receptores de Fcγ (FcγR) y receptor de complemento (CR) – mediada por la fagocitosis, se identificaron mediante microscopía electrónica. Atascamiento de la inmunoglobulina G (IgG)-partículas opsonizadas a FcγRs provoca la protuberancia de extensiones de membrana fina, que inicialmente forman una copa fagocítica llamada alrededor de la partícula antes de que se convierte en totalmente incluido y retraído dentro de la célula. En cambio, las partículas complemento opsonizadora parecen hundirse en el fagocito después de atar a los receptores de complemento. Estos dos modos de fagocitosis, formación de Copa fagocítica y se hunde, se han convertido en un bien establecido en la literatura. Sin embargo, las distinciones entre los dos modos han velado por los informes que complemento mediada por receptor fagocitosis puede inducir varias protuberancias de la membrana. Con la disponibilidad de técnicas de imagen de alta resolución, se requieren ensayos de fagocitosis que permiten visualización 3D (tres dimensiones) en tiempo real de lo específicos receptores fagocíticos mediato la captación de partículas individuales. Más utilizados enfoques para el estudio de la fagocitosis, como ensayos de punto final, pierda la oportunidad de entender lo que está sucediendo en el interfaz de partículas y de los fagocitos. Aquí describimos ensayos fagocíticos, usando microscopia confocal de disco spinning Time-lapse, que permite imágenes en 3D de eventos simples fagocíticas. Además, se describen ensayos inequívocamente de la imagen del receptor Fcγ – o complemento fagocitosis mediada por receptor.
Veinte años antes de la observación de Metchnikoff de células fagocíticas mesenchyme en larvas de estrellas de mar, en 1882 y posterior desarrollo de su teoría de la fagocitosis1, Ernest Haeckel describió, en 1862, la inmersión de las partículas de colorante insoluble de sangre células de Tetis fimbris (fimbria de Tethys), una especie de rapaz mar slug (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlín, 1862). Él describió explícitamente protuberancias de la membrana envolvente de las partículas, que posteriormente fueron tomadas en el citoplasma y acumuladas en el núcleo celular. Más de 100 años más tarde, un estudio pionero realizado por Kaplan sugirió que había al menos dos morfológicamente distintos mecanismos de fagocitosis2. Kaplan mostraron mediante microscopía electrónica de barrido peritoneal del ratón macrófagos ingestión un ovejas opsonizadora IgG eritrocitos usando extensiones de la membrana delgada que alcanzaron encima y envolvieron firmemente la partícula, inicialmente dando lugar a una forma de taza estructura. Fagocitarias Copa formación requiere polimerización de la actina ya que fue abrogada por la citocalasina toxina fúngica permeable a la célula B, conocido por bloquear la actinia dinámica3. En contraste, ovejas eritrocitos opsonizadora con complemento apareció directamente en los macrófagos sin la generación de extensiones de la membrana, aunque en algunas imágenes, volantes de membrana se pueden ver en los retrocesos inmediatos de las partículas que se hunde. A diferencia de la formación de Copa fagocítica, complemento mediada por receptor en era insenstive citocalasina B tratamiento2. En los experimentos descritos por Kaplan, complemento opsonización se realizó por incubación de inmunoglobulina M (IgM) con la etiqueta oveja glóbulos rojos con el suero de los ratones del complemento C5-deficiente, que evita la hemólisis por el terminal del complemento C5-dependiente complementan el complejo.
Los dos modos de fagocitosis, formación de Copa fagocítica y hundirse, identificados por Kaplan se han convertido en opinión establecida en el campo4,5,6,7,8,9 . Sin embargo, las imágenes de alta resolución utilizan en el estudio original de Kaplan2, así como un estudio similar por Munthe-Kaas et al. 10, sólo proporcionan copias instantáneas de eventos fagocíticas. En una revisión reciente, Rougerie et al. 11 destacó que las diferencias morfológicas entre FcγR y CR-mediada por la fagocitosis quedan por aclararse, y, además, volantes de membrana han sido observados durante el complemento mediada por receptor de partículas captación2. Imágenes de células vivas de eventos fagocíticas simples que abarcan desde la captura de la partícula a internalización, combinada con genéticamente modificados modelos de ratón, podrían mejorar grandemente nuestra comprensión de cómo los fagocitos capturan e ingieren partículas. Un método podría ser usar microscopía de fuerza rápida atómica (AFM) que permite la proyección de imagen topográfica de ultra alta resolución (10-20 nm) de las células vivas. Recientemente, se ha desarrollado un sistema rápido de AFM12 , que es conveniente para las superficies de células imágenes rápidamente con de poco ruido. Esta técnica tiene la ventaja de parámetros de alta resolución, topográficos y de mecánica de la vida las células se pueden medir a intervalos cortos (segundos), a diferencia de la microscopía electrónica de barrido, que exige la fijación y secado de punto crítico de células. Otro enfoque es la microscopia confocal 3D Time-lapse, que está ampliamente disponible, aunque fototoxicidad y blanqueo son factores limitantes durante grabaciones. Este enfoque es muy versátil y permite óptico seccionado con alta resolución espacial y permite extraordinaria flexibilidad en el etiquetado con una asombrosa gama de sondas fluorescentes, incluyendo proteínas fluorescentes genéticamente codificadas. Aquí describimos ensayos de fagocitosis usando microscopia confocal de disco de spinning Time-lapse que permiten alta resolución espaciotemporal de eventos fagocíticas mediado por el receptor.
La gran mayoría de los ensayos de fagocitosis, especialmente punto final y ensayos de alto rendimiento, no proporcionan la visualización de cómo las partículas son realmente capturadas, envuelto e ingeridas. Estudios pioneros por Munthe-Kaas et al. 10 y Kaplan2 en la década de 1970 sugirieron que sorprendentemente diferentes reorganizaciones citoesqueléticas estuvieron implicados en la fagocitosis de IgG opsonizadora versus opsonizadora complemento de partículas (células de sangre rojas de ovejas). Aquí describimos ensayos de fagocitosis usando microscopia confocal de disco giratorio que permiten proyección de imagen de alta resolución, en tiempo real de eventos simples fagocíticas. Fagocito de nuestro modelo es el los macrófagos peritoneales residentes de ratón, que puede ser aislada con mínimo manejo y utilizamos eritrocitos humanos recién aislados como partículas. Sin embargo, los ensayos de fagocitosis podrían aplicarse a otros fagocitos como los macrófagos derivados de médula ósea de ratón o neutrófilos, macrófagos derivados de monocitos humanos y líneas de celulares de macrófagos de ratón, neutrófilos de sangre periférica. En el caso de los fagocitos humanos o ratón neutrófilos, alternativa etiquetado fluorescente anticuerpos se necesitarían como fluorescencia etiquetada anti-CD14 (monocitos/macrófagos humanos) los anticuerpos16 o anticuerpos (Ly – 6 G) anti-Gr-1 (ratón neutrófilos).
Unopsonized glóbulos rojos humanos, como los glóbulos rojos de oveja utilizada tradicionalmente, son inertes en el sentido de que estas células son no (o, al menos, muy rara vez) ingeridas por los macrófagos peritoneales de ratón. De este modo, en contraste con perlas de poliestireno, actividad de bajo fondo. Glóbulos rojos humanos puede ser convenientemente opsonizadora con inmunoglobulinas de ratón IgG o IgM anticuerpos monoclonales contra CD235a (glycophorin A), un marcador específico de humanos eritrocitos (glóbulos rojos) y de precursores eritroides17, 18. en ensayos paralelos, fluorescencia etiquetada anti-IgG o IgM secundarios anticuerpos de ratón pueden ser aplicados para confirmar la opsonización. Las clases de anticuerpos IgG e IgM son hemaglutininas, sustancias (anticuerpos) que producen glóbulos rojos se aglutinan. Para evitar la aglutinación, intermitentemente mezclar la suspensión de células durante el período de incubación de 8 minutos con el anticuerpo anti-CD235a, y luego agregar la suspensión mezclada directamente a una que contiene macrófagos canal diapositiva (revestimiento de fibronectina) sin un paso de lavado . Pasos de lavado implican sedimentación de los eritrocitos por centrifugación, que promueve fuertemente la aglutinación. Antes opsonizante glóbulos rojos humanos, etiquetamos la membrana con una sonda fluorescente lipofílica de naranja y rojo. Este sondeo es brillantemente fluorescente en el inicio de grabaciones time-lapse, pero la señal poco a poco se desvanece, probablemente en gran parte debido al fotoblanqueo19. Además, los macrófagos y el revestimiento de fibronectina de la diapositiva será débil/rojo naranja fluorescente durante grabaciones. Este problema es probablemente debido al lavado de glóbulos rojos humanos después de etiquetar. En lugar de utilizar un marcador fluorescente lipofílico de la membrana de plasma, glóbulos rojos humanos podría ser etiquetados con un derivado de rodamina pH-sensible utilizando su amina reactiva succinimidyl ester15,20. Esto tiene la ventaja de permitir la visualización de la maduración del fagosoma ya que aumenta la intensidad de la fluorescencia con la disminución de pH15,20, pero este enfoque tiene la desventaja que actualmente se encuentran preparaciones reactivo éster caro e inestable después de la reconstitución en medio acuoso.
IgG-opsonizadora glóbulos rojos humanos son ingeridos a través de FcγRs, que se puede confirmar utilizando los macrófagos peritoneales aisladas de NOTAM21 o Fcer1g– / – ratones (Fcer1g knockout). Los macrófagos NOTAM opsonizadora IgG eritrocitos humanos se unen, pero carecen de ITAM (immunoreceptor motivo de activación basados en tirosina) – mediada de señalización necesaria para inducir la fagocitosis, mientras que los macrófagos de nocaut Fcer1g no expresan superficial FcγRs. IgG – u opsonizadora IgM humanas glóbulos rojos pueden ser además opsonizadora con C3b (que es hendida a iC3b) por incubar las células con el suero recién aislado de un ratón nulo complemento C5 (tipo suero provoca hemólisis). Las opsoninas IgG e IgM activan la cascada del complemento clásico, que conduce a la formación de poros (complejos de ataque de membrana) y lisis celular. En ratones que carecen de complemento C5, la cascada del complemento procede a complementar el escote de C3 y C5 convertasa carece de sustrato necesario para catalizar la vía terminal. Desarrollamos análisis simple para medir la cinética de la cascada del complemento. En Resumen, glóbulos rojos humanos puede co marcadas con un rojo fluorescente, marcador de membrana plasmática y el fluoróforo verde fluorescente, citosólico. Sobre la formación de lo complejos de ataque a membrana, formada por componentes del complemento C5-C9, el fluoróforo citosólico es rápidamente (en segundos) perdido desde el citosol. Visualización de la función end-effector (citólisis) de la cascada del complemento indica que el tiempo de incubación de 4 minutos es suficiente para opsonización C3b/iC3b de glóbulos rojos humanos. En ensayos paralelos, C3b/iC3b capa de glóbulos rojos humanos puede ser fácilmente había evaluada después de aplicar una mezcla de anti-ratón C3b y etiquetada fluorescente anticuerpos secundarios. En este caso, se requiere un paso de lavado para eliminar los anticuerpos no Unidos fluorescentes. Aunque la etapa de lavado consiste en sedimentaion de células por centrifugación, que promueve la aglutinación, opsonización exitosa puede evaluarse fácilmente mediante microscopía confocal. Fagocitosis mediada por receptor de complemento puede ser reflejada por cualquier aplicación IgG- / células de sangre roja humana opsonizadora iC3b NOTAM o Fcer1g– / – macrófagos o introduciendo IgM- / sangre roja humana opsonizadora iC3b células de macrófagos de tipo salvaje. Opsonizadora IgM de las células de sangre no son reconocidas por el FcγRs que contiene el ITAM (FcγRIII, FcγRI y FcγRIV) necesarias para la fagocitosis de partículas opsonizadora IgG22.
Para imagen fagocíticas eventos, la membrana plasmática de los macrófagos pueden ser etiquetadas con el anticuerpo conjugado de anti-F4/80 fluoróforo fluorescente verde, que también sirve como un marcador específico de los macrófagos de ratón. Glóbulos rojos humanos pueden procesar rojo fluorescente por la incubación con un marcador rojo naranja fluorescente membrana del plasma, como se señaló anteriormente. Este marcador de membrana plasmática lipofílico evita posibles efectos de confusión de etiquetas basados en anticuerpos. Rojo fluorescentes glóbulos rojos humanos, con o sin opsonización, se puede pipetearse directamente en el canal 100 μl de una diapositiva de canal y 3D Time-lapse reflejada por una 60 X 1.49 aceite de inmersión (o similar) objetivo realizado usando el 488 nm y 561 nm láser líneas , respectivamente, de un microscopio confocal (o similar) de disco de spinning. Es tentador para optimizar el sistema de proyección de imagen de alta resolución, pero la adquisición de pilas de Z repetidas sobre 16 minutos o así que puede causar fototoxicidad y photobleaching considerable. Optamos por utilizar 2 x 2 binning para promover buenos cocientes signal-to-noise y permite reducciones en la intensidad de excitación o tiempos de exposición, pero a expensas de la resolución óptica. Además, para reducir la fototoxicidad, agregamos un tesoro de especies reactivas de oxígeno al medio. En futuros estudios, los análisis podrían modificarse para la fagocitosis de células de sangre rojas humanas apoptotic de la imagen. Aplicación de un ionóforo Ca2 + , como A23187, puede utilizarse para inducir la fosfatidilserina externalización23, un “eat me” señal y sello de la temprana apoptosis24,25.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por las becas HA 3271/4-1 y HA 3271/4-2 del DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) y la concesión FF-2016-05 de EXC 1003 (racimo de la excelencia 1003), las células en movimiento (CiM), DFG.
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |