Здесь мы описываем методы, с помощью спиннинг диска confocal микроскопии изображений одного фагоцитарной события мыши-резидентов перитонеальных макрофагов. Протоколы могут распространяться на другие фагоцитирующих клеток.
Фагоцитоз играет ключевую роль в принимающей обороны, а также в ткани разработки и обслуживания и включает в себя быстрое, рецептор опосредованный перестановок Цитоскелет актина захватить, конверт и охватить крупные частицы. Хотя фагоцитарную рецепторов, течению сигнальные пути и эффекторы, например Ро GTPases, были определены, динамический цитоскелета ремоделирования рецептор опосредованный фагоцитарной событий остаются неясными. Четыре десятилетия назад, два отдельных механизмов фагоцитоза, подтверждается Fcγ рецептор (FcγR) – и Рецептор комплемента (CR) – опосредованной фагоцитоза, были определены с использованием растровая электронная микроскопия. Связывание иммуноглобулина G (IgG)-опсонизированными частицы FcγRs вызывает выступ тонкой мембраны расширений, которые первоначально образуют так называемые фагоцитарной Кубок вокруг частицы, прежде чем он становится полностью закрытых и убирается в ячейку. В отличие от этого дополнение опсонизированными частиц, по-видимому, погружаются в фагоцитов, после привязки для дополнения рецепторов. Эти два режима фагоцитоза, фагоцитарной Кубок формирования и тонуть, достаточно хорошо отработаны в литературе. Однако различия между двумя режимами становятся размытыми сообщения, что дополнение фагоцитоза рецептор опосредованный может вызвать различные мембраны выступов. При наличии высокого разрешения, методы визуализации, требуются фагоцитоза анализов, которые позволяют визуализации в реальном времени 3D (трехмерных) как специфических рецепторов фагоцитарной посредником поглощения отдельных частиц. Более часто используемые подходы для изучения фагоцитоза, например концевой анализов, упустить возможность, чтобы понять, что происходит на стыке частиц и фагоцитов. Здесь мы описываем фагоцитарной анализов, используя покадровой вращающийся диск confocal микроскопии, которые позволяют 3D визуализации одного фагоцитарной событий. Кроме того мы описываем анализов однозначно изображение Fcγ рецептор – или дополнить рецептор опосредованный фагоцитоза.
Двадцать лет до Metchnikoff в наблюдения фагоцитарной Мезенхима клеток в starfish личинки, в 1882 году и последующее развитие его теории фагоцитоза1, Эрнест Геккель описано, в 1862 году полного охвата контейнера пламенем нерастворимых красителей частиц крови клетки fimbris Фетида (Тетис бахромок), видов хищных пули море (Эрнест Геккель. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Георг фон Verlag Раймер, Берлин, 1862). Он явно описал мембраны выступы, обволакивающий частицы, которые впоследствии были рассмотрены в цитоплазму и накопленных вокруг клеточного ядра. Более чем 100 лет спустя, первопроходца исследование Каплан предположил, что существуют по крайней мере двух морфологически отдельных механизмов фагоцитоза2. Каплан показали посредством растровая электронная микроскопия мыши перитонеальных макрофагов организм IgG опсонизированными овец красных кровяных клеток с помощью тонкой мембраны расширений, которые достигли вверх и плотно обволакивает частицы, первоначально порождая Кубок как структура. Формирование фагоцитарной Кубок требуется актина полимеризации, поскольку он был отменен клетки проницаемой грибковых токсин cytochalasin B, известный блокировать актина динамика3. В отличие от овец красные кровяные клетки опсонизированными с дополнением появился погрузиться непосредственно макрофага без поколение мембранных расширений, хотя, в некоторых изображений, оборками мембраны можно увидеть в непосредственной vacinity тонуть частиц. В отличие от формирования фагоцитарной Кубок дополнением рецептор опосредованный тонуть был без учета регистра для лечения cytochalasin B2. В экспериментах, описал Каплан, дополнением опсонизацию была исполнена инкубации иммуноглобулина М (IgM) помечены овец красные кровяные клетки с сывороткой от мышей дополнением C5-дефицит, который обходит гемолиз в дополнение C5-зависимых терминал дополняют комплекс.
Два режима фагоцитоза, фагоцитарной Кубок формирования и тонуть в, определены Каплан стали установившейся мнение в поле4,5,6,7,,8,9 . Однако, ультра-высоким разрешением изображения используется в первоначальное исследование Каплан2, а также аналогичное исследование по Мунте-Каас и др. 10, только предоставить снимки фагоцитарной событий. В недавнем обзоре, Rougerie и др. 11 подчеркнул, что морфологические различия между FcγR и CR-опосредованной фагоцитоза еще предстоит уточнить, и, Кроме того, мембраны оборками наблюдались во время дополнением рецептор опосредованный частиц поглощения2. Жить клеточной изображений одного фагоцитарной мероприятий, охватывающих от захвата частиц для интернализации, в сочетании с генетически изменение модели мыши, может значительно улучшить наше понимание как фагоцитов захвата и глотать частиц. Один из подходов может быть использовать быстро атомно-силовой микроскопии (АСМ), который позволяет топографических изображений сверхвысокого разрешения (10-20 Нм) живых клеток. Недавно был разработан быстро AFM системы12 , который подходит для визуализации поверхности клетки быстро с низким уровнем шума. Этот метод имеет то преимущество, что с высоким разрешением, топографических и механических параметров живых клеток могут быть измерены в короткие промежутки времени (в секундах), в отличие от растровая электронная микроскопия, который требует фиксации и сушка критической точки клетки. Другой подход — промежуток времени 3D confocal микроскопии, который широко доступен, хотя Фототоксичность и отбеливания ограничивающих факторов во время записи. Этот подход очень универсальна и позволяет оптической секционирование с высоким пространственным разрешением и позволяет чрезвычайной гибкости в маркировки с ошеломляющие спектр флуоресцентных зондов, в том числе генетически закодированный флуоресцентных белков. Здесь мы описываем фагоцитоза анализов с использованием покадровой вращающийся диск confocal микроскопии, которые позволяют высокого разрешения пространственно-временных событий рецептор опосредованный фагоцитарной.
Подавляющее большинство анализов фагоцитоза, особенно конечной точки и высок объём анализов, не обеспечивают визуализация как частицы являются фактически захватили, охватило и проглотить. Новаторские исследования Мунте-Каас и др. 10 и2 Каплан в 1970-х предложил, что разительно отличается цитоскелета реорганизации были вовлечены в фагоцитоз опсонизированными IgG против дополнения опсонизированными частиц (овец красных кровяных телец). Здесь мы описываем фагоцитоза анализов, используя вращающийся диск confocal микроскопии, которые позволяют высокого разрешения, в реальном времени изображений одного фагоцитарной событий. Наша модель фагоцитов является мышь-резидентов перитонеальных макрофагов, которые могут быть изолированы с минимальной обработкой, и мы используем свежевыделенных клеток крови человека красный как частицы. Однако анализов фагоцитоза могут применяться к другим фагоцитов, например мыши костного мозга, полученных макрофаги или нейтрофилов, мыши макрофагов клеточных линий, человека моноцитарных макрофаги или нейтрофилов периферической крови человека. В случае человека фагоцитов или мыши нейтрофилов альтернативные дневно помечены антитела потребуются, например дневно обозначенные анти CD14 антител (человека моноцитов/макрофагов)16 или анти Gr-1 (Ly – 6 G) антител (мышь Нейтрофилы).
Unopsonized человека красных кровяных клеток, как традиционно используемые овец красных кровяных клеток, инертным в том смысле, что эти клетки являются не (или, по крайней мере, очень редко) заглатывается мыши перитонеальных макрофагов. Это гарантирует, в отличие от шарики полистироля, низкой фоновой активности. Человека красные кровяные клетки может быть удобно опсонизированными с иммуноглобулинов, с помощью мыши IgG и IgM моноклональных антител против CD235a (Гликофорины A), маркер конкретного человека эритроцитов (эритроцитов) и эритроидные прекурсоров17, 18. в параллельных анализов, дневно обозначенные анти мыши IgG и IgM вторичные антитела могут быть применены для подтверждения опсонизацию. Антитела класса IgG и IgM, hemagglutinins, вещества (антитела), которые вызывают красные кровяные клетки для склееных. Чтобы избежать агглютинации, мы периодически смешать суспензию клеток в инкубационный период 8 мин с антитела анти CD235a, а затем мы добавить смешанные подвеска непосредственно на макрофагов содержащих канал слайд (с покрытием фибронектин слайд) без мытья шаг . Мыть шаги включают оседания эритроцитов крови центрифугированием, который сильно способствует агглютинации. Перед opsonizing человека красных кровяных клеток, мы обозначаем плазматической мембраны с липофильного флуоресцентного зонда оранжевый/красный. Этот зонд ярко флуоресцентные в начале покадровой записи, но сигнал постепенно исчезает, вероятно объясняется Фотообесцвечивание19. Кроме того слабо оранжевый/красный флуоресцентные во время записи может стать макрофагов и фибронектин покрытие слайда. Эта проблема является предположительно из-за недостаточной стиральных после маркировки человека красных кровяных клеток. Вместо того, чтобы с помощью маркера липофильных флуоресцентных плазматической мембраны, человека красные кровяные клетки могут быть помечены с рН чувствительных родамин производной, используя его Амин реактивной succinimidyl эфира15,20. Это имеет то преимущество, позволяя визуализации фагосомы созревания, так как интенсивность флуоресценции увеличивается с уменьшением рН15,20, но этот подход имеет недостаток, что реактивный Эстер препараты в настоящее время дорого и нестабильной после растворения в водной среде.
IgG опсонизированными человека красные кровяные клетки попадает через FcγRs, который может быть подтверждено, что использование перитонеальных макрофагов изолированы от NOTAM21 или Fcer1g– / – (Fcer1g нокаут) мышах. NOTAM макрофаги привязать опсонизированными IgG человека красных кровяных клеток, но не хватает ИТПМ (immunoreceptor активации тирозин-на основе motif) – опосредованной сигнализации необходимо побудить фагоцитоза, тогда как Fcer1g нокаут макрофаги не выражают поверхности FcγRs. IgG – или IgM опсонизированными человека красные кровяные клетки могут дополнительно опсонизированными с C3b (который расщепляется до iC3b), инкубации клеток с свежевыделенных сыворотки от null мыши дополнение C5 (одичал тип сыворотки вызывает гемолиз). Опсонины, IgG и IgM активировать классический дополнение Каскад, которая приводит к образованию поры (мембраны атаки комплексы) и lysis клетки. В мышей, не хватает дополнением C5, Каскад дополнением приступает к дополнения C3 расщепления, но C5 конвертазы хватает субстрата, необходимые для ускорения терминала путь. Мы разработали простой анализов для измерения кинетики дополнением Каскад. Короче говоря человека красные кровяные клетки могут быть совместно помечены красной флуоресцентной, плазматической мембране маркер и Зеленый флуоресцентный, цитозольной Флюорофор. После формирования комплекса нападения мембраны, образованный компонентами комплемента C5-C9, цитозольной Флюорофор это быстро (в секундах) потеряли от цитозоль. Визуализация конце эффекторных (цитолиза) функции дополнения Каскад указал, что время инкубации 4 мин является достаточно для C3b/iC3b опсонизацию человека красных кровяных клеток. В параллельных анализов C3b/iC3b покрытие человека красных кровяных клеток можно легко оценить после применения смесь анти мыши C3b и дневно помечены вторичные антитела. В этом случае мыть шаг необходим для удаления несвязанных флуоресцентных антител. Хотя шаг мыть включает sedimentaion клетки центрифугированием, который способствует агглютинации, успешно опсонизацию можно легко оценены confocal микроскопии. Дополнением рецептор опосредованный фагоцитоза может отражаться либо применение IgG- / iC3b-опсонизированными человека красные кровяные клетки к нотам или Fcer1g– / – макрофаги или путем введения IgM- / iC3b-опсонизированными человека красные кровяные клетки к одичал тип макрофагов. ИТПМ содержащих FcγRs (FcγRI, FcγRIII и FcγRIV) для фагоцитоза IgG опсонизированными частиц22не распознаются IgM опсонизированными клетками крови.
Чтобы изображение фагоцитарной события, плазматической мембраны макрофаги могут быть помечены конъюгированных антител анти F4/80 Зеленый флуоресцентный Флюорофор, который также служит в качестве определенного маркера мыши макрофагов. Человека красные кровяные клетки могут подготавливаться красный флуоресцентные по инкубации с маркер оранжевый/красный флуоресцентные плазматической мембраны, как обсуждалось выше. Этот маркер липофильных плазматической мембраны позволяет избежать потенциальных смешанные эффекты на основе антител этикеток. Красных флуоресцентных человека красных кровяных клеток, с или без опсонизацию, можно непосредственно накапаны в 100 мкл канал канал слайда и 3D покадровой образы через 60 X / 1,49 масло погружения (или аналогичный) объектив с использованием 488 нм и 561 Нм лазерные линии , соответственно, из микроскопом конфокальный (или аналогичный) диск спиннинг. Это соблазн оптимизировать систему для изображений с высоким разрешением, но приобретение неоднократные Z-стеки свыше 16 мин или может вызвать значительные Фотообесцвечивание и Фототоксичность. Мы решили использовать 2 x 2 биннинга поощрять хорошее соотношение сигнал шум и позволить сокращения интенсивности возбуждения и/или времени экспозиции, но за счет оптическое разрешение. Кроме того чтобы уменьшить Фототоксичность, мы добавить мусорщика реактивнооксигенных видов на носитель. В будущих исследований анализов может быть изменен для изображения фагоцитоз apoptotic человека красных кровяных клеток. Приложение Ca2 + ionophore, например A23187, может использоваться для побудить Фосфатидилсерин экстернализации23, «съешь меня» сигнал и отличительной чертой ранних апоптоз24,25.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантов га 3271/4-1 и га 3271/4-2 от DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) и Грант FF-2016-05 от EXC 1003 (кластер Excellence-1003), клетки в движении (CiM), DFG.
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |