Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I
Summary
Como las variantes genéticas asociadas con enfermedades humanas empiezan a ser descubierto, se está convirtiendo en cada vez más importante para el desarrollo de sistemas con los que evaluar rápidamente la importancia biológica de las variantes identificadas. Este protocolo describe los métodos para evaluar la función del gen humano durante la meiosis femenina utilizando ovocitos de ratón.
Abstract
Aneuploidía embrionaria es la principal causa genética de la infertilidad en los seres humanos. La mayoría de estos eventos se origina durante la meiosis femenina, y aunque se correlacionó positivamente con la edad materna, edad sola no siempre es predictivo del riesgo de generar un embrión aneuploide. Por lo tanto, variantes genéticas podrían explicar la segregación incorrecta de cromosomas durante la ovogénesis. Dado que el acceso a ovocitos humanos es limitado para fines de investigación, se desarrollaron una serie de ensayos para estudiar la función del gen humano durante meiosis utilizando ovocitos de ratón. En primer lugar, el ARN mensajero (ARNm) del gen y la variante del gen de interés son microinyectados en ovocitos de ratón arresté a profase. Después de permitir tiempo para la expresión, ovocitos son liberados sincrónicamente en maduración meiótica para completar la meiosis I. Por marcado el ARNm con una secuencia de un reportero fluorescente, como la proteína verde fluorescente (Gfp), la localización de la proteína humana puede ser evaluada además de las alteraciones fenotípicas. Por ejemplo, ganancia o pérdida de función puede investigarse mediante el establecimiento de las condiciones experimentales que el producto génico para corregir errores meiotic. Aunque este sistema es ventajoso en la investigación de la función de la proteína humana durante la Oogénesis, adecuada interpretación de los resultados debe realizarse teniendo en cuenta que no es expresión de la proteína en los niveles endógenos y, a menos que controla (es decir, golpeado hacia fuera o hacia abajo), murinos homólogos también están presentes en el sistema.
Introduction
La infertilidad es una condición que afecta a 10-15% de la población humana de la edad reproductiva 1, de los cuales casi la mitad busca tratamiento médico 2. Aunque la etiología de la infertilidad es diversa y en muchos casos multifactoriales, la anormalidad genética más común en los seres humanos es aneuploidía embrionaria 3. Aneuploidía se define como la desviación (ganancia o pérdida) del número correcto de cromosomas en una célula. El fenómeno de la aneuploidía de los embriones humanos es común y aumenta con la edad maternal avanzada 4,5. Cuatro ensayos controlados aleatorios han destacado el beneficio de seleccionar embriones sólo cromosómicamente normales (euploides) para la transferencia uterina porque esta estrategia dio lugar a la creciente implantación de tarifas, tasas de aborto espontáneo y un tiempo más corto para lograr embarazo 6,7,8,9. Por lo tanto, entender la etiología de la aneuploidía humana puede tener implicaciones importantes en la reproducción asistida.
Aunque las pruebas genéticas preimplantacional de aneuploidías están beneficiosa en tratamientos de la infertilidad, todavía carece de una comprensión profunda de cómo originan aneuploidías. Es ampliamente aceptado que existe una correlación positiva de aneuploidías meióticas (originados durante la producción de gametos) y la edad materna, sin embargo, algunas tasas de aneuploidía embrionaria presente las mujeres que se desvían de la tasa media para su edad determinada 4. Estos casos sugieren que la edad sola no siempre es predictivo del riesgo de generar un embrión aneuploide. Otros factores pueden jugar un papel en el aumento del riesgo de aneuploidía embrionaria, como variantes genéticas.
Un aspecto clave de investigar la posible contribución de una variante del gen a aneuploidía durante la meiosis del ovocito es diseñar un sistema para evaluar rápidamente la función del gen meiótica. Debido a las limitaciones éticas y acceso limitado, no es práctico para llevar a cabo estos experimentos con óvulos humanos. Estas cuestiones pueden eludirse mediante el uso de ovocitos de ratón, y aquí una serie de ensayos para evaluar la función humana del gene durante la meiosis se describen. Por microinjecting el ARN mensajero (ARNm) que codifica para la variante del gen de interés, la localización de la proteína humana en el óvulo de ratón puede ser visualizada y utilizada para determinar si los resultados de la expresión ectópica de la proteína humana de tipo salvaje y mutada en cualquier alteraciones fenotípicas que podrían conducir a aneuploide. Estos fenotipos incluyen el aumento de microtúbulos que se adhieren a la incorrecta a hermana cinetocoro y la incapacidad para apoyar la alineación del cromosoma en metafase de la meiosis I. importante, este protocolo puede utilizarse para investigar tanto ganancia como pérdida de la función variantes genéticas mediante el establecimiento de condiciones experimentales específicas a eventos clave en la meiosis del ovocito como eje de alineación de edificio y el cromosoma 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a la rápida y creciente identificación de variantes genéticas humanas asociadas con la enfermedad, es esencial que se establezcan sistemas para evaluar su significado biológico. Comprender la función de la proteína en meiosis humana plantea desafíos particulares porque son preciosos ovocitos humanos y espermatozoides humanos y raros no son susceptibles de manipulación genética. Ovocitos de ratón son un sistema mamífero modelo valioso para la evaluación de genes humanos meiótica función <sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una beca de investigación de la sociedad americana de medicina reproductiva y de la Charles y Johanna Busch Memorial Fund en Rutgers, Universidad Estatal de NJ a K.S. A.L.N. fue apoyado por una subvención de la I.N.S. (F31 HD0989597).
Materials
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. . Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
