Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I
Summary
Come le varianti genetiche associate con la malattia umana cominciano a diventare scoperto, sta diventando sempre più importante sviluppare sistemi con cui valutare rapidamente il significato biologico di quelle varianti identificate. Questo protocollo descrive i metodi per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi femminile che usando i oocytes del mouse.
Abstract
L’aneuploidia embrionale è la principale causa genetica di infertilità nell’uomo. La maggior parte di questi eventi hanno origine durante la meiosi femminile, e seppur correlata positivamente con l’età materna, età da solo non è sempre predittivi del rischio di generare un embrione aneuploide. Pertanto, le varianti del gene potrebbero rappresentare segregazione del cromosoma non corretto durante l’oogenesi. Dato che l’accesso di ovociti umani è limitato per scopi di ricerca, una serie di saggi sono stati sviluppati per studio di funzione del gene umano durante la meiosi I usando i oocytes del mouse. In primo luogo, RNA messaggero (mRNA) del gene e la variante del gene di interesse vengono microiniettati nei oocytes del mouse mi-arrestato profase. Dopo dando il tempo di espressione, gli ovociti vengono rilasciati in modo sincrono nella maturazione meiotica per completare la meiosi I. Contrassegnando il mRNA con una sequenza di un reporter fluorescente, come ad esempio la proteina fluorescente verde (Gfp), la localizzazione della proteina umana può essere valutata oltre le alterazioni fenotipiche. Ad esempio, guadagno o perdita di funzione può essere indagata attraverso la definizione di condizioni sperimentali che sfidano il prodotto del gene per correggere errori meiotic. Anche se questo sistema è vantaggioso nelle indagini di funzione della proteina umana durante l’oogenesi, un’adeguata interpretazione dei risultati dovrebbe essere intrapreso dato che l’espressione della proteina non è ai livelli endogeni e, se non controllato per (cioè bussato fuori o verso il basso), omologhi murini sono anche presenti nel sistema.
Introduction
La sterilità è una condizione che colpisce il 10-15% della popolazione umana dell’età riproduttiva 1, da cui quasi metà Cerca cure mediche 2. Anche se l’eziologia dell’infertilità è vario e in molti casi multifattoriali, l’anomalia genetica più comune in esseri umani è aneuploide embrionali 3. Aneuploide è definita come la deviazione (guadagno o perdita) del numero corretto di cromosomi in una cella. Il fenomeno di aneuploide in embrioni umani è comune e aumenta con l’età materna avanzata 4,5. Quattro studi controllati randomizzati hanno evidenziato i benefici della selezione solo cromosomicamente normali (euploide) degli embrioni per il trasferimento uterino perché questa strategia ha provocato l’impianto aumento tariffe, tassi più bassi di aborto spontaneo e tempi più brevi per raggiungimento di gravidanza 6,7,8,9. Di conseguenza, capire l’eziologia di aneuploide umana possono avere importanti implicazioni nella riproduzione assistita.
Anche se la prova genetica preimpianto per aneuploidie è vantaggiosa in trattamenti di sterilità, manca ancora una conoscenza approfondita di come origine degli aneuploidi. È ampiamente accettato che esiste una correlazione positiva di aneuploidie meiotiche (originati durante la produzione di gameti) e l’età materna, tuttavia, alcuni tassi di aneuploide embrionali presenti donne che si discostano dal tasso medio per loro era dato 4. Questi casi suggeriscono che la sola età non è sempre predittivi del rischio di generare un embrione aneuploide. Altri fattori possono svolgere un ruolo nell’aumento del rischio di aneuploidia embrionale, come varianti del gene.
Un aspetto fondamentale di studiare il potenziale contributo di una variante del gene di aneuploide durante la meiosi ovocitaria è quello di progettare un sistema per valutare rapidamente la funzione del gene meiotica. A causa di limitazioni di carattere etici e accesso limitato, è poco pratico per eseguire questi esperimenti utilizzando ovuli umani. Questi problemi possono essere aggirati utilizzando oocytes del mouse, e qui una serie di saggi per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi io sono descritti. Da microinjecting del RNA messaggero (mRNA) che codifica per la variante del gene di interesse, la localizzazione della proteina umana nell’uovo del mouse può essere visualizzata e utilizzata per determinare se l’espressione ectopica della proteina wild-type e mutanti umana risultati in qualsiasi alterazioni fenotipiche che potrebbero portare a aneuploide. Questi fenotipi comprendono un aumento in microtubuli che si attaccano all’improprio alla sorella cinetocore e l’incapacità di sostenere allineamento cromosomi in metafase della meiosi I. d’importanza, questo protocollo può essere usato per studiare il guadagno e la perdita della funzione varianti genetiche attraverso la definizione di specifiche condizioni sperimentali per sfidare gli eventi chiave nella meiosi ovocitaria come mandrino allineamento edificio e del cromosoma 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa l’identificazione rapida e crescente di varianti genetiche umane associati alla malattia, è essenziale che i sistemi sono stabiliti per valutare il loro significato biologico. Capire la funzione della proteina in meiosi umana pone sfide particolari perché ovociti umani sono preziosi e raro e umano dello sperma non è suscettibile di manipolazione genetica. Oocytes del mouse sono un sistema di modello mammifero prezioso per la valutazione umana del gene meiotica funzione 10,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da un Grant di ricerca della American Society for Reproductive Medicine e da Charles e Johanna Busch Memorial Fund presso la Rutgers, The State University di NJ per K.S. A.L.N. era sostenuta da una sovvenzione del N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
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