À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I
Summary
Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.
Abstract
Aneuploïdie embryonnaire est la principale cause génétique de la stérilité chez l’homme. La plupart de ces événements sont créés au cours de la méiose femelle, et quoique corrélés avec l’âge maternel, âge seul n’est pas toujours prédictive du risque de générer un embryon aneuploïde. Donc, les variantes génétiques pourraient expliquer pour la ségrégation des chromosomes incorrect au cours de l’ovogenèse. Étant donné que l’accès à des ovocytes humains est limitée à des fins de recherche, une série de tests ont été développés pour étudier la fonction du gène humain au cours de la méiose I à l’aide des ovocytes de souris. Tout d’abord, l’ARN messager (ARNm) du gène et variant du gène d’intérêt sont microinjected dans des ovocytes de souris que j’ai arrêté la prophase. Après avoir laissé le temps à l’expression, ovocytes sortent de façon synchrone en maturation méiotique pour compléter la méiose I. Par le marquage de l’ARNm avec une séquence d’un reporter fluorescent, tels que de la protéine fluorescente verte (Gfp), la localisation de la protéine humaine peut être évaluée en plus les altérations phénotypiques. Par exemple, gain ou perte de fonction peut être étudiée par l’établissement de conditions expérimentales qui remettent en question le produit du gène pour corriger les erreurs méiotiques. Bien que ce système est avantageux dans les enquêtes sur la fonction de protéine humaine durant l’ovogenèse, l’interprétation adéquate des résultats devrait être entreprise, étant donné que l’expression de la protéine n’est pas aux niveaux endogènes et, à moins que contrôlé (c’est-à-dire frappé out ou vers le bas), murins homologues sont également présents dans le système.
Introduction
L’infertilité est une maladie qui touche 10 à 15 % de la population humaine d’âge procréateur 1, d’où presque moitié cherche un traitement médical 2. Bien que l’étiologie de l’infertilité est diversifiée et une anomalie génétique la plus courante chez l’homme est souvent multifactorielle, aneuploïdie embryonnaire 3. Aneuploïdie est définie comme l’écart (gain ou perte) du bon nombre de chromosomes dans une cellule. Le phénomène de l’aneuploïdie sur les embryons humains est fréquent et augmente avec l’âge maternel avancé 4,5. Quatre essais comparatifs randomisés ont mis en évidence l’avantage de la sélection des embryons (euploïdes) seulement chromosomique normales pour le transfert de l’utérus parce que cette stratégie a donné lieu à des taux accrus d’implantation, taux d’avortement spontané et un temps plus court pour atteindre la grossesse 6,7,8,9. Par conséquent, comprendre l’étiologie de l’aneuploïdie humaine peut avoir des implications importantes en procréation assistée.
Bien que le dépistage génétique pré-implantatoire pour aneuploïdies est bénéfique dans les traitements contre l’infertilité, une compréhension approfondie de la façon dont sont originaires les aneuploïdies fait encore défaut. Il est largement admis qu’il existe une corrélation positive des aneuploïdies méiotiques (son originaires au cours de la production des gamètes) et âge de la mère, cependant, certains taux d’aneuploïdie embryonnaires présents des femmes qui s’écartent de la moyenne pour leur âge donné 4. Ces cas donnent à penser que l’âge seul n’est pas toujours prédictive du risque de générer un embryon aneuploïde. Autres facteurs peuvent jouer un rôle dans l’augmentation du risque d’aneuploïdie embryonnaire, comme les variantes génétiques.
Un aspect clé de l’enquête sur la contribution potentielle d’un variant du gène de l’aneuploïdie au cours de la méiose de l’ovocyte est de concevoir un système pour évaluer rapidement la fonction du gène méiotique. En raison des contraintes éthiques et un accès limité, il est impossible de réaliser ces expériences à l’aide d’ovules humains. Ces problèmes peuvent être contournés en utilisant des ovocytes de souris, et ici une série de tests pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I sont décrites. Par microinjecting l’ARN messager (ARNm) codant pour la variante du gène d’intérêt, la localisation de la protéine humaine dans le œuf de souris peut être visualisée et utilisée pour déterminer si l’expression ectopique de la protéine humaine sauvage et mutante dans un altérations phénotypiques qui pourraient conduire à une aneuploïdie. Ces phénotypes comprennent une augmentation dans les microtubules qui s’attachent à la mauvaise sœur kinétochore et l’incapacité de soutenir l’alignement des chromosomes en métaphase de la méiose I. ce qui est important, ce protocole peut être utilisé pour étudier le gain et perte de fonction variants génétiques en établissant des conditions expérimentales spécifiques à contester les événements clés de la méiose de l’ovocyte tels que broche d’alignement bâtiment et le chromosome 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison de l’identification rapide et croissante des humains variantes génétiques associées à la maladie, il est essentiel que les systèmes sont établies afin d’évaluer leur importance biologique. Comprendre la fonction des protéines dans la méiose humain pose des défis particuliers car les ovocytes humains sont précieux et sperme rare et humaine ne se prêtent pas aux manipulations génétiques. Les ovocytes de souris sont un système modèle mammifère précieux pour l’évaluation humaine gène méio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche de l’American Society for Reproductive Medicine et du Charles et Johanna Busch Memorial Fund à l’Université Rutgers, The State University de NJ à K.S. est a été financée par une subvention de la N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
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