Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I
Summary
Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.
Abstract
Aneuploidia embrionária é a genética das principais causas de infertilidade em seres humanos. A maioria destes eventos se originam durante a meiose feminina, e embora positivamente correlacionada com a idade materna, idade sozinha nem sempre é preditiva do risco de gerar um embrião aneuploid. Portanto, variantes do gene podem contabilizar segregação do cromossomo incorreta durante a ovogênese. Dado que o acesso aos oócitos humanos é limitado para fins de pesquisa, uma série de ensaios foram desenvolvidos para estudar a função do gene humano durante a meiose I usando oócitos de rato. Primeiro, o RNA mensageiro (mRNA) do gene e variante do gene de interesse são injetadas em oócitos de rato prendi prófase. Após permitir tempo para expressão, oócitos sincronicamente são liberados na maturação meiose para completar a meiose eu. Marcando o mRNA com uma sequência de um repórter fluorescente, tais como a proteína verde fluorescente (Gfp), a localização da proteína humana pode ser avaliada para além das alterações fenotípicas. Por exemplo, ganho ou perda de função pode ser investigada através do estabelecimento de condições experimentais que desafiam o produto do gene para corrigir erros meióticos. Embora este sistema é vantajoso em investigar a função da proteína humana durante a ovogênese, adequada interpretação dos resultados deve ser realizada, dado que a expressão da proteína não está em níveis endógenos e, se não for controlada por (ou seja batido para fora ou para baixo), homologs murino também estão presentes no sistema.
Introduction
Infertilidade é uma condição que afeta 10-15% da população humana da idade reprodutiva 1, dos quais quase metade procura tratamento médico 2. Embora a etiologia da infertilidade é diversa e em muitos casos multifatoriais, a anomalia genética mais comum em seres humanos é embrionário aneuploidia 3. Aneuploidia é definida como o desvio (ganho ou perda) do número correto de cromossomos em uma célula. O fenômeno de aneuploidia em embriões humanos é comum e aumenta com a idade materna avançada, 4,5. Quatro ensaios controlados randomizados evidenciaram o benefício da seleção de embriões (euploid) apenas cromossomicamente normais para transferência uterina porque esta estratégia resultou na implantação de aumento de taxas, menores taxas de aborto e um menor tempo para alcançar a gravidez 6,7,8,9. Portanto, compreender a etiologia da aneuploidia humana pode ter implicações importantes na reprodução assistida.
Embora o teste genético pré-implantação para aneuploidies é benéfica em tratamentos de infertilidade, continua a faltar uma compreensão completa de como originou aneuploidies. É amplamente aceito que existe uma correlação positiva de aneuploidies meióticas (originou-se durante a produção de gametas) e a idade materna, no entanto, algumas taxas de aneuploidia embrionário presente mulheres que desviam a taxa média para sua idade determinada 4. Estes casos sugerem que idade sozinha nem sempre é preditiva do risco de gerar um embrião aneuploid. Outros fatores podem desempenhar um papel no aumento do risco de aneuploidia embrionária, tais como variantes do gene.
Um aspecto fundamental de investigar o potencial de contribuição de uma variante do gene de aneuploidia durante a meiose oócito é projetar um sistema para avaliar rapidamente a função do gene meiótica. Devido a restrições éticas e acesso limitado, é impraticável para realizar esses experimentos usando ovos humanos. Estas questões podem ser contornadas usando oócitos de rato, e aqui uma série de ensaios para avaliar a função do gene humano durante a meiose são descritos. Por microinjecting a codificação do RNA mensageiro (mRNA) para a variante do gene de interesse, a localização da proteína humana no ovo do mouse pode ser visualizada e usada para determinar se a expressão ectópica da proteína humana tipo selvagem e mutante resulta em qualquer alterações fenotípicas que poderiam levar à aneuploidia. Estes fenótipos incluem um aumento no microtúbulos que anexar para o inadequado à irmã cinetócoro e a incapacidade de apoiar o alinhamento de cromossomos em metáfase da meiose I. importante, este protocolo pode ser usado para investigar tanto ganho e perda de função variantes genéticas através do estabelecimento de condições experimentais específicas para desafiar os principais eventos na meiose oócito tais como eixo de alinhamento edifício e cromossomo 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido a rápida e crescente identificação do humanas variantes genéticas associadas com a doença, é essencial que os sistemas são estabelecidos para avaliar seu significado biológico. Compreensão da função das proteínas na meiose humana coloca desafios específicos porque oócitos humanos são preciosos e raras e humana de esperma não é passíveis de manipulação genética. Oócitos mouse são um sistema de modelo mamíferos valioso para avaliar o gene humano meiótica função 10<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da sociedade americana de medicina reprodutiva e do Charles e Johanna Busch Memorial Fund na Rutgers, Universidade do estado de NJ para Konzen A.L.N. foi apoiada por uma concessão do N.I.H (F31 HD0989597).
Materials
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
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