استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا
Summary
المتغيرات الجينية المرتبطة بأمراض الإنسان تبدأ لتصبح كشف، تزداد أهمية وضع نظم لتقييم سرعة الأهمية البيولوجية لتلك المتغيرات التي تم تحديدها. ويصف هذا البروتوكول الأساليب لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي الإناث الأول باستخدام بويضات الماوس.
Abstract
هو انيوبلويدي الجنينية الوراثية السبب الرئيسي للعقم لدى البشر. تنشأ معظم هذه الأحداث أثناء الانقسام الاختزالي الإناث، وأن كان ارتباطاً إيجابيا بسن الأمهات، العمر وحدها ليست دائماً التنبؤية لخطر توليد جنين أنيوبلويد. ولذلك، قد حساب المتغيرات الجينات للعزل الصبغي غير صحيحة أثناء تكون البويضات. نظراً لأن الحصول على بويضات بشرية محدودة لأغراض البحوث، وضعت سلسلة من الاختبارات لدراسة الجينات البشرية الدالة أثناء الانقسام الاختزالي الأول باستخدام الماوس بويضات. أولاً، يتم ميكروينجيكتيد رسول الحمض النووي الريبي (مرناً) الجينات والجينات البديل من الفائدة في الطور الأول-اعتقلت الماوس بويضات. بعد السماح بوقت للتعبير، تطلق بويضات شكل متزامن في نضوج هو استكمال الانقسام الاختزالي أنا. يمكن تقييم تعريب البروتين البشري بعلامات مرناً مع تسلسل مراسل الفلورية، مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، بالإضافة إلى التعديلات المظهرية. على سبيل المثال، اكتساب أو فقدان وظيفة يمكن أن يحقق بتهيئة الظروف التجريبية التي تشكل تحديا للمنتج الجيني لإصلاح الأخطاء هو. على الرغم من أن هذا النظام مفيد في التحقيق وظيفة البروتين البشري أثناء تكون البويضات، ينبغي الاضطلاع بالتفسير الملائم للنتائج نظراً لأن تعبير البروتين ليس على المستويات المحلية، وإذا لم تسيطر على (أي طرقت بها أو لأسفل)، homologs موريني موجودة أيضا في النظام.
Introduction
العقم هو حالة تؤثر على 10-15% السكان في سن الإنجاب 1، منها قرابة نصف التماس العلاج الطبي 2. على الرغم من أن مسببات العقم متنوعة وفي كثير من الحالات المتعددة العوامل، التشوهات الوراثية الأكثر شيوعاً في البشر هو انيوبلويدي الجنينية 3. انيوبلويدي يعرف بأنه الانحراف (الربح أو الخسارة) للعدد الصحيح من الكروموسومات في خلية. ظاهرة انيوبلويدي في الأجنة البشرية أمر شائع، ويزداد مع تقدم السن الأمهات 4،5. وقد أبرزت أربع تجارب معشاة الاستفادة من اختيار الأجنة (يوبلويد) فقط تشروموسومالي العادية لنقل الرحم لأن هذه الاستراتيجية أدت إلى غرس زيادة معدلات ومعدلات الإجهاض أقل ووقت أقصر تحقيق الحمل 6،7،،من89. ولذلك، فهم مسببات انيوبلويدي البشرية يمكن لها آثار هامة في المساعدة على الإنجاب.
وبالرغم من أن زرع قبل الاختبارات الجينية أنيوبلويديس مفيد في علاج العقم، تزال مفتقدة فهم دقيق للطريقة التي تنشأ بها أنيوبلويديس. من المقبول على نطاق واسع أن هناك علاقة متبادلة إيجابية هو أنيوبلويديس (نشأت أثناء إنتاج مشيج) وسن الأمهات، غير أن بعض النساء معدلات انيوبلويدي الجنينية الحالية التي تحيد عن معدل متوسط ل سن معين على 4. هذه الحالات تشير إلى أن السن وحدها ليست دائماً التنبؤية لخطر توليد جنين أنيوبلويد. عوامل أخرى قد تلعب دوراً في زيادة خطر انيوبلويدي الجنينية، مثل المتغيرات الجينات.
أحد جوانب رئيسية للتحقيق في إمكانية مساهمة متغير الجيني إلى انيوبلويدي أثناء الانقسام الاختزالي البويضيه تصميم نظام لتقييم سرعة وظيفة الجينات هو. بسبب القيود الأخلاقية ووصول محدود، ومن غير العملي لإجراء هذه التجارب باستخدام البويضات البشرية. هذه المسائل يمكن التحايل عليها باستخدام الماوس بويضات، وهنا سلسلة من الاختبارات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي الأول وصف. قبل ميكروينجيكتينج الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) الترميز للبديل الجينات للفائدة، يمكن تصور تعريب البروتين البشري في البيض الماوس وتستخدم لتحديد إذا كان التعبير حمل خارج الرحم من البروتين البشري البرية من نوع وتحور ينتج أي التعديلات المظهرية التي يمكن أن تؤدي إلى انيوبلويدي. تعمل هذه تشمل زيادة في microtubules التي تعلقها على غير لائق للأخت كينيتوتشوري وعدم القدرة على دعم المحاذاة كروموسوم في الطورية للانقسام الاختزالي أولاً الأهم من ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في اكتساب وفقدان وظيفة المتغيرات الجينية بتهيئة ظروف تجريبية محددة لتحدي الأحداث الرئيسية في الانقسام الاختزالي البويضيه مثل مغزل محاذاة المبنى وكروموسوم 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
بسبب تحديد المتغيرات الجينية البشرية المرتبطة بالمرض السريع والمتزايد، من الضروري أن يتم إنشاء نظم لتقييم أهميتها البيولوجية. فهم وظيفة البروتين في الانقسام الاختزالي البشرية يطرح تحديات خاصة نظراً لأن بويضات بشرية ثمينة والحيوانات المنوية نادرة والبشرية ليست قابلة للتلاعب بالجينات. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل “منحة بحثية” من “الجمعية الأمريكية” “الطب الإنجابي” وتشارلز وجوانا بوسكه الصندوق التذكاري في روتجرز، “جامعة الدولة في نيوجيرسي” “يماثل كانساس” تدعمها منحة من N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. . Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
