באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני
Summary
גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.
Abstract
אנאפלואידיה עובריים הוא הגורם הגנטי פוריות אצל בני אדם. רוב האירועים האלה מקורם במהלך המיוזה הנשי, אמנם בקורלציה חיובית עם גיל, גיל לבד לא תמיד חזוי של הסיכון של יצירת העובר aneuploid. לכן, ג’ין גרסאות אולי חשבון סגרגציה כרומוזום שגוי במהלך oogenesis. בהתחשב בכך גישה oocytes האנושי מוגבל למטרות מחקר, סדרה של מבחני פותחו כדי לחקור פונקציה גנים אנושיים במהלך המיוזה אני משתמש בעכבר oocytes. ראשית, RNA שליח (mRNA) של ג’ין, ג’ין וריאנט של עניין הם microinjected לתוך prophase העכבר עצרתי oocytes. לאחר המאפשר זמן הביטוי, oocytes משתחררים באופן סינכרוני אל ההבשלה meiotic להשלמת מיוזה אני. על-ידי תיוג של mRNA עם רצף של עיתונאי פלורסנט, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (Gfp), הלוקליזציה של החלבון האנושי יכול להיות מוערך בנוסף התיקונים פנוטיפי. לדוגמה, רווח או הפסד של הפונקציה יכול ייחקרו על-ידי יצירת תנאים ניסיוני זה אתגר המוצר ג’ין כדי לתקן שגיאות meiotic. המערכת הזו אמנם יתרון בחקירת פונקציה חלבון אנושי במהלך oogenesis, פרשנות נאותה של תוצאות צריך להתבצע בהתחשב בכך ביטוי חלבון אינה ברמות אנדוגני, ו, אלא אם כן מבוקר על (קרי הפיל . או למטה), מאתר homologs נמצאים גם במערכת.
Introduction
פוריות היא מחלה המשפיעה על 10-15% מן האוכלוסייה האנושית של גיל הרבייה 1, שממנה כמעט למחצית מחפשים טיפול רפואי 2. למרות האטיולוגיה של בעיות פוריות היא מגוונת, ובמקרים רבים multifactorial, סטייה גנטית הנפוץ ביותר אצל בני אדם הוא אנאפלואידיה עובריים 3. אנאפלואידיה מוגדר הסטייה (רווח או הפסד) של המספר הנכון של הכרומוזומים בתא. התופעה של aneuploidy של עוברי אדם נפוצים, עולה עם גיל מתקדם 4,5. ארבעה מחקרים אקראיים מבוקרים הדגישו את היתרון של בחירת הנורמלי היחיד chromosomally (euploid) עוברי להעברה הרחם כי אסטרטגיה זו, גרמו המחירים השרשה מוגברת, נמוכים הפלה, זמן קצר יותר להשגת הריון 6,7,8,9. לכן, הבנת האטיולוגיה של aneuploidy האנושי יכול להיות השלכות חשובות ברבייה בסיוע.
למרות בדיקה גנטית טרום השרשה, עבור aneuploidies הוא מועיל בטיפולי פוריות, הבנה מעמיקה של מה aneuploidies מקורם עדיין לוקה בחסר. מקובל כי קיים מתאם חיובי של aneuploidies meiotic (מקורו בתהליך הייצור תא רבייה), גיל, עם זאת, כמה נשים אנאפלואידיה עובריים התעריפים הנוכחיים שסטו מהתעריף הממוצע שלהם נתון בגיל 4. במקרים אלה מראים כי גיל לבד אינה תמיד חזוי של הסיכון של יצירת העובר aneuploid. גורמים אחרים עשויים לשחק תפקיד בהגדלת הסיכון של aneuploidy עובריים, כגון גן משתנים.
היבט מרכזי של חוקרים פוטנציאל התרומה של variant ג’ין כדי אנאפלואידיה במהלך המיוזה oocyte היא לתכנן מערכת להעריך במהירות ג’ין meiotic הפונקציה. בשל אילוצים אתית גישה מוגבלת, זה לא מעשי לבצע ניסויים אלה באמצעות ביצים אנושי. נושאים אלה יכולים שיפרו באמצעות העכבר oocytes, ויש כאן סדרה של מבחני להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני המתואר. על ידי microinjecting קידוד RNA שליח (mRNA) את הווריאציה גנים של הריבית, הלוקליזציה של החלבון האנושי של הביצה העכבר יכול להיות דמיינו ועל משמש כדי לקבוע אם ביטוי חוץ רחמי של החלבון אדם פראי-סוג של מוטציה תוצאות בכל שינויים פנוטיפי העלולה להוביל אנאפלואידיה. פנוטיפים אלה כוללים עלייה ב- microtubules כי לצרף אחותי לא במקום קינטוכור וחוסר יכולת לתמוך יישור כרומוזום-מפה של מיוזה אני חשוב, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור גם להפסד ורווח של פונקציה וריאציות גנטיות על-ידי יצירת תנאים מסוימים ניסיוני לאתגר את אירועי מפתח oocyte מיוזה כגון ציר יישור ובניית כרומוזום 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
בגלל הזיהוי הגובר וברכבות של האדם משתנים גנטיים הקשורים במחלה, זה חיוני כי מערכות נקבעו כדי להעריך את משמעותם ביולוגי. הבנת וחלבון לתפקד מיוזה האנושי מציבה אתגרים מסוים כי oocytes האדם יקרים ואינם זרע נדיר, האדם לבצע מניפולציות גנטיות. עכבר oocytes הם מערכת מודל בתרבית של ערך להערכת ג’ין meiotic האנו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של האגודה האמריקנית לרפואת פוריות ו מן צ’ארלס בוש לקרן יוהנה לומד, המדינה באוניברסיטה של ג’אי כדי K.S. A.L.N. נתמך על ידי מענק של N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. . Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
