Préparation, Purification et l’utilisation de Liposomes contenant de l’acide gras

1. préparation de la vésicule Préparation des couches minces Seringues serré de gaz permet de transférer certaine quantité de lipides comme décrit dans le tableau 1.1 au chloroforme dans un flacon en verre. Faire évaporer la solution obtenue sous un courant d’azote ou argon sous la hotte. Sous réserve de la couche mince qui en résulte au vide de la maison pendant au moins 2 h éliminer tout résidu de chloroforme. Les lipides peuvent être laissés sous vide du jour au lendemain à ce stade. Réhydratation des vésicules Préparer 10 mL de tampon de 5 mM calcéine 250 mM tris-HCl pH 8,0 hydratation en dissolvant 31 mg de poudre de calcéine dans 2,5 mL de tampon de 1 M tris-HCl pH 8,0 et en ajoutant un autre 7,5 mL d’eau désionisée de (DI). Distribuer 250 µL d’au-dessus de tampon d’hydratation dans un tube à vide et ajouter 1.875 µL de 10 M de NaOH pour un final base 75 mM (½ équivalent des acides gras totaux). Transvaser la solution dans la couche mince de lipide sec aux vésicules de forme avec une concentration de lipides totaux de 0,15 M. Utilisation haute vitesse (> 3000 tr/min) vortexer à vortex le mélange obtenu pour 4-5 s. Laissez le mélange lipidique-tampon sur un agitateur rotatif basse vitesse (ca. 30 tr/min) pour se réhydrater, au moins pendant la nuit. Dimensionnement des vésicules (facultatifs) À l’aide de pinces à épiler, appliquer un support de filtre à chaque surface intérieure des ports seringue de l’extrudeuse. Mouillez chaque support de filtre avec 250 mM tris-HCl, pH 8. À l’aide de pinces à épiler, appliquer une piste gravée 100 nm en polycarbonate des membranes à l’une de l’extrudeuse toriques et filtre prend en charge. En prenant soin de ne pas déchirer ou perforer la membrane, poussez délicatement la membrane dans le joint torique afin d’établir un bon contact entre les deux surfaces. Assembler l’extrudeuse, prenant soin de ne pas pour déplacer la membrane et le filtre prend en charge. Remplissez une seringue extrudeuse avec env. 0,5 mL de 250 mM tris-HCl, pH 8. Insérez cette seringue dans un côté de l’extrudeuse. Insérer une seringue vide dans l’autre côté de l’extrudeuse. À la main, pousser le piston de la seringue contenant un tampon lentement (≤ 50 µL/s) et vérifier que la résistance est ressentie, indiquant que la membrane gravé piste est en place et intact. Il est utile de pratiquer cette étape sans une membrane en place afin d’évaluer le niveau attendu de la résistance. Enlever et vider les deux seringues. Il n’est pas nécessaire de nettoyer les deux seringues à ce stade puisqu’ils contiennent tampon de composition identique à la préparation de liposomes. Charger la préparation liposome dans une des deux seringues. Remonter l’extrudeuse avec seringue contenant l’échantillon de vésicules sur le côté gauche et la seringue vide sur le côté droit. À la main, pousser le piston de la seringue contenant l’échantillon de vésicules très lentement (10 à 25 µL/s). Observer attentivement la seringue sur le côté droit de l’extrudeuse ; Clear tampon entrera au départ le côté droit de l’extrudeuse (env. 50 µL, cela est dû au volume mort intérieur de l’extrudeuse), suivie d’un petit panache de liposomes extrudés. Immédiatement cesser de pousser à ce stade, retirer la seringue sur le côté droit de l’extrudeuse et jeter cette solution. Remplacer la seringue sur le côté droit de l’extrudeuse et extruder jusqu’à ce que la seringue de gauche est vide. Inverser l’orientation de l’extrudeuse et répétez l’étape 13. Continuer pour le nombre de cycles (généralement de 7, 9 ou 11) ; un nombre impair est toujours utilisé pour liposomes non extrudés ne sont pas obtenus de la seringue contenant initialement la préparation de liposomes de réduction des effectifs avant. Doucement, répartissez le contenu de la seringue droite dans un tube Eppendorf et placer le tube sur un agitateur rotatif basse vitesse (ca. 30 tr/min) pendant environ 0,5 h. Procéder à la purification de la vésicule, comme décrit dans la Section 2. Vésicules extrudés doivent être utilisés dans les 24h ou re-extrudés avant la prochaine utilisation. 2. purification de vésicule Préparation de la phase mobile de purification vésicule Préparer 5 mL de tampon d’hydratation 8 250 mM tris-HCl pH en ajoutant 1,25 mL de tampon tris-HCl pH 8 1 M, à 3,75 mL de l’eau distillée à un tube de Falcon de 15 mL. Puis ajoutez 37,5 µL de 10 M NaOH (½ équivalent de base par rapport à l’acide gras estérifié) dans le tampon de l’hydratation. Pipetter 235 µL d’acide oléique pur directement dans le tube Falcon résultant d’une solution de la vésicule avec 0,15 M lipides totaux. Utilisation haute vitesse (> 3000 tr/min) vortexer à vortex le mélange pendant 4-5 s, puis culbuter sur une faible vitesse de rotation agitateur pendant au moins 2 h. La préparation de lipides peut être laissée toute la nuit sur l’agitateur rotatif à ce stade. Filtrer la phase mobile à travers l’unité de filtre de 0,22 μm seringue avant utilisation pour enlever n’importe quel agrégat potentiels. Purification des vésicules sur Sepharose Enlever ca. 5 mL d’éthanol boue de Sépharose 4 b de la bouteille à l’aide d’une pipette. Appliquer à une colonne de chromatographie jetable 10 mL. Laisser la boue pour s’installer et accréditives éthanol jusqu’à ce que l’éthanol s’approche haut du lit de résine. Appliquer 5 mL d’eau désionisée jusqu’au sommet de la résine et laisser accréditives pour évacuer les résidus de l’éthanol. Appliquer 250 mM tris-HCl, pH 8 portions de 1 à 2 mL au sommet de la résine, en appliquant une nouvelle partie chaque fois que le niveau du liquide s’approche le haut du lit de résine. Répéter pour les 3 – 5 fois. Fixer la colonne sur le statif, puis connectez le bout de la colonne avec robinet d’arrêt et une tubulure sur le collecteur de fraction. Ajouter une autre partie de la mémoire tampon pour rincer le tube, fermer le robinet quand le niveau du liquide dans la colonne s’approche de la partie supérieure de la résine. Appliquer les vésicules extrudés de Section 1 vers le haut de la résine à l’aide d’une pipette de 200 µL, en prenant soin d’appliquer la préparation de la vésicule aussi régulièrement que possible à la résine sans toucher le mur de lit ou d’une colonne de résine. Ouvrir le robinet pour commencer l’écoulement et commencer à accumuler des fractions dans une plaque de 96 puits. Appliquer la phase mobile de purification vésicule vers le haut du lit de résine dans 0,5 à 1 mL portions que le tampon est épuisée, en prenant soin de ne pas pour laisser le lit de résine se dessécher. S’accumuler dans les fractions 5-déposer, recueillant au moins 36 puits (trois rangées d’une plaque de 96 puits). Caractérisation de la fluorescence des fractions de purification Prendre la plaque à 96 puits de la section précédente et de lire sur un lecteur de plaque (λex= 485 nm, λem= 515 nm). Tracer les données résultantes de la fluorescence sous fluorescence par rapport au nombre de fraction. Vésicules éluer tout d’abord, suivie de la fraction « désencapsulées » (Figure 1). Repurification des vésicules pour surveiller les fuites de la vésicule Répétez les étapes de purification et caractérisation dans les Sections 2.2 et 2.3. Les vésicules qui ont conservé leur contenu n’exposera aucun Pic de soluté capsulée (ou un très petit d’environ 5 à 10 % de l’intensité du pic vésicule). 3. utilisation des vésicules en présence de magnésium Utilisation de magnésium aboutissent Préparer et purifier des vésicules comme décrit dans les sections 1, 2.1 et 2.2. Préparer 1 mL de 50 mM MgCl2 solution dans un tampon 250 mM tris-HCl pH 8.0 en ajoutant 250 µL de tampon de 1 M tris-HCl pH 8,0 et 50 µL de 1 M du MgCl2 à 700 µL de DI de l’eau. Vortex pour bien mélanger. Pour obtenir la concentration de magnésium souhaitée de 5 mM, mélanger 0,9 mL de vésicules purifiées et 100 µL de solution de magnésium et remuer rapidement pour minimiser les perturbations de la vésicule par exposition transitoire des vésicules à forte concentration locale de magnésium.NOTE : Mélange rapide de solution de magnésium est essentiel à la stabilité de la vésicule. Si le magnésium et les vésicules ne sont pas mélangés rapidement au vortex immédiat, quelques vésicules seront exposés à des concentrations plus élevées de magnésium, ce qui entraîne des résultats incohérents d’un échantillon à l’autre. Laisser l’échantillon de vésicules sur un gobelet pendant au moins 30 min avant repurification comme décrit au point 2.4 pour vérifier les fuites de matières. Ajouter la même concentration de magnésium comme dans l’exemple de la vésicule à la phase mobile repurification. Utilisation de magnésium lié Préparer et purifier des vésicules comme décrit dans les sections 1, 2.1 et 2.2.Remarque : Utilisez ½ KOH équivalent au lieu de NaOH pour déprotoner des acides gras ; Il a été constaté que cela produit plus stables liposomes chélatés MgCl2 systèmes. Préparer la solution de citrate de potassium 2M et ajuster le pH à 8,0 avec KOH. Prémélanger MgCl2 et potassium citrate au ratio spécifié (ca. 1:4 pour les vésicules de l’acide oléique stable) dans un tampon 250 mM tris-HCl pH 8.0. Ajouter solution de citrate de magnésium prémélangée à l’échantillon de vésicule, brièvement vortex.NOTE : Mélangez toujours solution magnésium et ligand. N’exposez jamais de vésicules à la solution de magnésium unchelated seule. Laisser l’échantillon de vésicules sur un gobelet pendant au moins 30 min avant repurification comme décrit au point 2.4. Ajouter la même concentration de magnésium et le citrate comme dans l’exemple de la vésicule à la phase mobile repurification. 4. non enzymatiques ARN copie dans les vésicules Préparation de monodispersés RNA encapsulé vésicules Préparer un film sec d’acide oléique comme décrit au point 1.1. Préparer la vésicule réhydratation tampon avec 50 µM amorce d’ARN marqué fluorescent descripteur d’ARN µM 150 et 250 mM tris-HCl pH 8.0 contenant ½ KOH équivalente par rapport à l’acide oléique. Ajouter 250 µL de tampon de réhydratation du film lipidique et ramenez le pied 1.2.2 et 1.2.3 pour faire des vésicules avec la concentration totale de lipides 0,15 M. Afin de rendre unilamellaires petites vésicules monodispersé, suivre la section 1.3 pour l’extrusion de la vésicule. Purification de l’addition et de la vésicule-citrate de magnésium Mélangez stocks de magnésium et le citrate, puis mélanger ensuite avec l’échantillon de vésicules à une concentration finale de lipides de 0,1 M. Purifier les vésicules sur colonne de Sépharose 4 b taille exclusion, avec 250 mM tris-HCl pH 8,0, lipides 0,1 M et compte tenu de magnésium et le citrate comme phase mobile. Accumuler des fractions de la vésicule en suivante section 2.3. Réaction d’extension d’amorce Préparer 200 mM 2-MeImpG (guanosine 5′-monophosphate 2-methylimidazolide) solution avec 250 mM tris-HCl pH 8.0. (NOTE : suivi précédent publié le protocole n°10 de synthèse 2-MeImpG.) Pour initier la réaction extension amorce, transfert 150 µL de la solution mère de 2-MeImpG à 450 µL d’échantillon vésicule pour atteindre une concentration finale de lipides de 75 mM et 50 mM activé monomère. Démarrer la minuterie et conserver la réaction échantillon dégringolant tout le temps. (Facultatif) Destinés à l’alimentation continue monomère frais, transfert 300 µL de solution de réaction à une chambre d’un laboratoire construit petit volume liposome dialyseur11 et mettre 300 µL solution dans l’autre chambre d’alimentation. La solution d’alimentation devrait contenir tous les ingrédients à la même concentration que dans la solution de réaction, à l’exception de remplacement ARN contenant des vésicules avec des vésicules vides. Chaque tour de dialyse prend 1 à 24 heures, selon l’analyte et la membrane utilisée. Des études cinétiques, prendre une 100 µL aliquote à chaque instant et repurify l’aliquote à travers une colonne d’exclusion de taille Sépharose 4 b avec 250 mM tris-HCl pH 8.0 comme phase mobile. Recueillir les fractions de vésicule dans un tube eppendorf de 1,5 mL. Pipetter Triton pour les fractions de la vésicule vers une finale environ 0,1 % v/v. Ajouter 0,5 mL d’éthanol froid dans le tube et laisser incuber à-20 ° C pendant au moins 2 h. Centrifuger tous ces échantillons à 16,1 × 1000 fibres de céramique réfractaire (16,1 × g) pour 10 min et doucement pipette les liquides. Lavage des pastilles de l’ARN avec 70 % éthanol froid et centrifuger à nouveau pendant 5 min. jeter le liquide et mettre le tuyau avec des boulettes de RNA sur un bloc de chaleur de 80 ° C pendant 2 min évaporer l’éthanol résiduel. Dissoudre les granules dans 50 µL de 8 M urée avec tampon de charge 1xTBE. Analyse de la PAGE Préparer 20 % gel de PAGE en mélangeant 200 mL d’UreaGel système concentré, 25 mL de diluant, de système de UreaGel 25 mL de tampon de 10xTBE, 80 µL de TEMED et 250 mg de persulfate d’ammonium. Verser le mélange de gel entre les plaques de gel fixées (35 × 45 cm) et d’insérer le peigne rapidement. Attendez au moins 30 min jusqu’à polymérisation complète. Assembler la plaque de gel sur le stand de gel et de remplir les cases de gel 1xTBE gel tampon. Décoller le peigne et vider les puits avec une seringue. Les exécutez le gel avec 60 W pendant 30 min. Faites chauffer les échantillons sur bloc chauffant 80 ° C pendant 2 min et charger 5 µL de l’échantillon par puits. Allumez gel boîte de puissance et réglez gel en cours d’exécution avec la constante w à 60 W pendant 2,5 heures. Démonter la plaque de gel dans le peuplement de gel, essuyez la vitre et mettre une plaque entière en gel scanner pour commencer la numérisation de gel. Quantifier le gel avec analyse 1D ImageQuant TL. Tracer le logarithme naturel du rapport entre la quantité d’apprêt restant à un moment donné du montant initial d’apprêt / temps, correspondent à une ligne et calculer la vitesse de réaction pseudo-premier ordre (Figure 2). 5. hammerhead Self de l’ARN clivage dans les vésicules Préparation et purification de ribozyme encapsulé dans des vésicules Préparer un mince film lipidique (OA : OGM = 9:1) qu’à l’article 1.1 avec composants comme dans tableau 1.2. Remarque : les OGM chaud au moins 60 ° C pour la fusion complète avant d’utiliser. Préparer le tampon de réhydratation de vésicules avec 5 µM de chaque brin ribozyme hammerhead et 250 mM tris-HCl pH 8.0. Ajouter 250 µL de tampon de réhydratation du film lipidique et suivre la concentration lipidique étapes 1.2.2 et 1.2.3 pour faire des vésicules avec 0,15 M total. Afin de rendre unilamellaires petites vésicules monodispersé, suivre la section 1.3 pour l’extrusion de la vésicule. Purifier les vésicules sur une colonne d’exclusion de Sépharose 4 b taille, avec 250 mM tris-HCl pH 8,0, 0,15 M mixé lipides comme phase mobile. Réaction de self-clivage de ribozyme Hammerhead Préparer une solution de magnésium et mélanger avec vésicules purifiées comme décrit à la section 3.1 pour initier la réaction de self-clivage. Pour les études cinétiques, prenez 100 µL du mélange à chaque instant et repurify directement cette partie aliquote à travers une colonne d’exclusion de taille Sépharose 4 b avec 250 mM tris-HCl pH 8.0 comme phase mobile. Recueillir la fraction de la vésicule. Analyse de la PAGE Suivez les étapes 4.3.6 à 4.3.8 pour préparer l’ARN chargement d’échantillon. Placez commercialement casted gel TBE-urée de 15 % dans la zone de gel et remplir la boîte de gel 1xTBE gel tampon. Faites chauffer les échantillons sur bloc chauffant 80 ° C pendant 1 min et charger 5 µL de l’échantillon par puits. Exécutez le gel avec la constante 200 V pendant environ 1 h. Scannez le gel. Quantifier le gel avec un logiciel d’analyse, comme TL ImageQuant 1D, pour mesurer l’ampleur du clivage en comparant l’intensité du restant bande de RNA de substrat et l’ARN clivée fragment band (Figure 3). 6. géant acides gras vésicules pour la microscopie Préparation des vésicules géant d’acide gras Suivez la section 1.1 et 1.3 de Table pour préparer un film mince de l’acide oléique avec 0,2 mol % de lipides fluorescent étiquetés pour une meilleure observation de membrane. Réhydrater les film lipidique avec 500 µL 250 mM tris-HCl pH 8.0 pour rendre les lipides de la vésicule échantillon 10 mM au total. Le tampon peut contenir des colorants fluorescents ou des molécules d’ARN, si vous le souhaitez. Laissez la vésicule échantillon culbutage du jour au lendemain. Préparer 150 mL de tampon de dialyse acide gras pur avec 10 mM de lipides totaux en mélangeant 470 µL d’acide oléique et 150 mL de 250 mM tris-HCl pH 8.0 contenant ½ équivalent NaOH. Extrudez l’échantillon vésiculaire à travers une membrane de polycarbonate 10 µm pour éliminer les gros agrégats. Transférer l’échantillon de vésicules dans la cassette de dialyse de grands pores de 1 µm, comme décrit précédemment. 12 Placez la cassette de dialyse dans un bécher de 100 mL contenant 30 mL de tampon de dialyse. Agiter le bécher doucement sur un agitateur de table-top à 80-100 t/mn. Changer le tampon de dialyse chaque 30 min 5 fois enlever les colorants gratuits ou des ARN et des petites vésicules. Retirer délicatement la vésicule d’échantillon de la cassette de dialyse avec une seringue et le transfert dans un tube Eppendorf. Observation de microscopie Déposer 10µl de vésicules sur une lame de microscope ordinaire propre et placez une lamelle de verre sur l’échantillon. Joint de couvercle en verre avec vernis à ongles transparent. Observer les vésicules avec un 60 X huile-dispersion ou un objectif similaire par microscopie confocale à l’aide de la source laser approprié pour la membrane fluorescent marqué, l’ARN ou l’encapsulé colorant (Figure 4).