إعداد وتنقية، واستخدام الدهنية المحتوية على الأحماض الدهنية
Summary
الدهنية التي تحتوي على سلسلة واحدة أمفيفيليس، لا سيما الأحماض الدهنية، يحمل خصائص متميزة مقارنة بتلك التي تحتوي على دياسيلفوسفوليبيدس بسبب الخصائص الكيميائية الفريدة من أمفيفيليس واحد في سلسلة. هنا يمكننا وصف تقنيات لإعداد وتنقية، واستخدام الدهنية تتألف جزئيا أو كلياً من هذه أمفيفيليس.
Abstract
الدهنية التي تحتوي على سلسلة واحدة أمفيفيليس، لا سيما الأحماض الدهنية، يحمل خصائص متميزة مقارنة بتلك التي تحتوي على دياسيلفوسفوليبيدس بسبب الخواص الكيميائية الفريدة لهذه أمفيفيليس. على وجه الخصوص، تعزيز الدهنية الأحماض الدهنية الطابع الدينامي، نظراً لأن القابلية للذوبان عالية نسبيا من سلسلة واحدة أمفيفيليس. وبالمثل، الدهنية التي تحتوي على الأحماض الدهنية الحرة أكثر حساسية للاتصالات الملح وديفالينت، بسبب التفاعلات القوية بين مجموعات حمض الكربوكسيلية الرأس والايونات المعدنية. نحن هنا لتوضيح تقنيات لتنقية، إعداد واستخدام الدهنية تتألف جزئيا أو كلياً من أمفيفيليس سلسلة واحدة (مثلاً، الأحماض الأولييك).
Introduction
الدهنية، أو حويصلات – المقصورات المحاط بالأغشية بيلايير تتألف من الدهون أمفيفيليك-وجدت الاستخدام في العديد من التطبيقات الطبية الحيوية كوسائل إيصال للمستحضرات الصيدلية، ونماذج أغشية الخلية، ولتطوير الاصطناعية الخلايا. كما استخدمت نحن وآخرون الدهنية كنماذج لأغشية الخلايا البدائية في وقت مبكر من الحياة. 1 , 2 , 3 , 4 عادة، في مثل هذه الأنظمة، نحن نوظف أمفيفيليس سلسلة واحدة تحتوي على ذيل الهيدروكربونية الدهنية واحد فقط (مثلحمض الأولييك)، هذه الجزيئات أبسط لتوليف دون الاستفادة من البروتين المبرمج الإنزيمات تستخدم الخلايا الحديثة.
الدهنية التي تتكون من الدهون سلسلة واحدة مماثلة لتلك التي تكونت من دياسيلفوسفوليبيدس (مثلاً، 1-بالميتويل-2-أوليويل-sn-جليسيرو-3-phosphocholine، أو بوبك) في ذلك الحدود وتتألف من أغشية بلير. الدهنية التي تكونت من أي فئة من الدهون يمكن الاحتفاظ بحمولة المذاب، ويمكن تقليص حجمها وتنقيته باستخدام تقنيات مختلفة. العديد من الاختلافات الهامة نتيجة للخصائص الكيميائية الفريدة للدهون سلسلة واحدة. الحويصلات التي شكلتها فوسفوليبيدات مستقرة على نطاق واسع درجة حموضة، بينما حويصلات الأحماض الدهنية فقط مستقرة في الأس الهيدروجيني المحايدة إلى الأساسية أقل ما يقال (ca. 7-9)، الأمر الذي يتطلب بعض الحموضة العازلة لإعداد حويصلة. معظم الوقت، وهذا المخزن المؤقت قد تحتوي أيضا على جزيئات قابلة للذوبان محددة لتغليف حويصلة، التي يمكن أن تكون أما المواد الفنية (مثلالحمض النووي الريبي) للتفاعلات الكيميائية الحيوية مجزأة أو صبغات الفلورسنت بسيطة (مثلاً، كالسين ) لوصف حويصلة.
وجود سلسلة الهيدروكربون واحدة فقط تنتج من غشاء الذي على حد سواء أكثر نفاذية الذوائب، فضلا عن أكثر دينامية. بالإضافة إلى ذلك، حمض الكربوكسيلية رئيس الفريق في نتائج الأحماض الدهنية في الحويصلات التي أكثر حساسية لوجود الملح و divalent الكاتيونات (مثلاً، Mg2 +). المغنيسيوم أحد الكاتيونات divalent الأكثر أهمية لتحفيز التفاعلات الكيميائية الحيوية في بروتوسيلس للدراسات أصل الحياة. في الحياة المبكرة، قبل تطور إنزيمات البروتين متطورة، قد رنا البوليمر المهيمنة، نظراً لقدرتها المزدوجة لتكرار الذاتي والقيام بالحفز. مثال واحد من الحمض النووي الريبي التي تتطلب المغنسيوم المتعلقة برد الفعل هو الحمض النووي الريبي غير الانزيمية النسخ، أثبتت أولاً في الستينات. 5 عند تنشيط كيميائيا النيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي (أي 2-ميثيليميدازوليدي النيوكليوتيدات) ربط مجمع التمهيدي-قالب موجود مسبقاً، 3 ‘-هيدروكسيل مجموعة من التمهيدي الهجمات 5’-الفوسفات من مونومر المنشط المتاخمة لتحل محل ترك المجموعة (أي 2-ميثيليميدازولي)، وأشكال السندات فوسفوديستير جديدة. ويتطلب هذا الكيمياء نسخ الحمض النووي الريبي تركيزات عالية من Mg2 +، الذي يحتاج إلى أن يكون له علاقة بالكلاب ولكي تكون متوافقة مع بروتوسيلس الأحماض الدهنية. 6 “مغ آخر”2 +-يتوقف رد الفعل أن تحفزها رايبوزيم المطرقة، وهو ربما تتسم أفضل حافز الجيش الملكي النيبالي. هذا رايبوزيم، التي يمكن أن يعاد تشكيلها من النوكليوتيد قصيرة اثنين، يقوم برد فعل ملائم لرصد تحول جل الانقسام الذاتي. على هذا النحو، وكثيراً ما يستخدم رايبوزيم نموذج في دراسات أصل الحياة. 7 بسبب شرط بهذا رايبوزيم المغنسيوم أونليجانديد، الدهنية عادة تصنع من خليط من الأحماض الدهنية والأحماض الدهنية استرات والغليسيرول، التي أكثر استقرارا المغنيسيوم. 8 , 9 في هذا البروتوكول، نقدم التقنيات ونحن قد وضعت لإعداد، والتلاعب، وتوصيف هذه الحويصلات وتثبت تطبيق هذه الحويصلات بروتوسيلس لنسخ والمطرقة رايبوزيم الجيش الملكي النيبالي المضيف غير الانزيمية الحفز.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد اقترحت الدهنية التي تكونت من الأحماض الدهنية الكثيرون كنماذج محتملة للخلايا البدائية سبب نفاذية عالية وخصائص ديناميكية. كاربوكسيليك رئيس مجموعة الأحماض الدهنية سلسلة واحدة فقط يسمح التجميع الذاتي في الأغشية في مجموعة الرقم الهيدروجيني مقيدة، والأغشية الناتجة حساسة جداً لوجود الأملاح. نتيجة لذلك تتطلب حويصلات الأحماض الدهنية إعداد مختلفة والتعامل مع أساليب مقارنة مع الحويصلات فسفوليبيد.
في هذا البروتوكول، على الرغم من أننا استخدام حمض الأولييك كمثال لتكوين الحويصلية، وأخرى طويلة سلسلة الأحماض الدهنية غير المشبعة (C14) ومشتقاتها (ca. حمض ميريستوليك، وحمض palmitoleic، والكحول المقابلة والجلسرين استرات) أيضا شكل حويصلات اتباع أسلوب الإماهة رقيقة طالما تركيز الدهن المجموع أعلاه اللجنة العسكرية المركزية ودرجة الحموضة العازلة ترطيب بالقرب من pKa للأحماض الدهنية داخل الغشاء. أخرى غير HCl تريس المخزن المؤقت المستخدمة في هذا البروتوكول، نظم أخرى المخزن المؤقت (ca. بيسين، الفوسفات، بورات) أفيد بدعم تكوين حويصلة الأحماض الدهنية، على الرغم من أن عادة ما تكون حويصلات شكلت في المخزن المؤقت للفوسفات أو بورات راشح تماما13. حويصلات الأحماض الدهنية الناتجة بعد الإماهة بوليديسبيرسي ومولتيلاميلار، ولكن يتم تحويله بسهولة إلى الحويصلات أونيلاميلار مونوديسبيرسي الصغيرة بقذف كما هو موضح. مقارنة مع سونيكيشن كأسلوب بديل لتوليد حويصلات صغيرة، البثق يوفر المزيد من الخيارات للتحكم في حجم حويصلة بتطبيق أغشية حجم المسام مختلفة. عادة ما تكون أكبر قليلاً من حجم المسام غشاء الحويصلات بعد البثق، ولكن عن طريق زيادة عدد دورات البثق، يمكن الحصول على حويصلات مع توزيع حجم أضيق وحجم متوسط قريبة من حجم مسام الغشاء.
من أجل توليف بروتوسيلس الوظيفية، حويصلات الأحماض الدهنية بحاجة إلى المضيف محددة التفاعلات الكيميائية الحيوية الناتجة عن التغليف للحمض النووي الريبي أو كتل الإنشاء. الأسلوب الإماهة رقيقة يوفر طريقة سهلة لشكل الحويصلات المحتوية على المواد المغلفة المرجوة. ومع ذلك، كفاءة تغليف منخفضة نسبيا وجزء كبير من المواد الثمينة مثل الحمض النووي الريبي تضيع عادة أثناء عملية تنقية. وفي بعض الحالات يمكن تحسين كفاءة تغليف متواضعة بدورات تجميد أذاب المتكررة قبل قذف. تسمح أساليب موائع جزيئية لإعداد فسفوليبيد الدهنية عالية الغلة لكفاءة التغليف 100% تقريبا، ولكن حتى الآن لم توضع أساليب مماثلة حويصلات الأحماض الدهنية.
عند التعامل مع بروتوسيلس مع الكلاب أو الحرة Mg2 +تنقية بعد إضافة الحل المغنيسيوم وريبوريفيكيشن قبل كل نقطة الوقت يضمن الإزالة تسربت تغليف المواد التي قد تؤثر على دقة معدل التفاعل القياسات داخل الحويصلات. حيث يأخذ كل تنقية مالا يقل عن 10 دقيقة لتحقيق فصل جيدة وجمع الكسور حويصلة، تحليل ردود فعل سريعة من الصعب، وأن رد الفعل يجب أن تتوقف قبل ريبوريفيكيشن العمود.
البروتوكول ونحن الحاضرين هنا أيضا مناسبة لتشييد الدهنية الأحماض الدهنية التي تستضيف ردود فعل محاكاة تلك التي قد تحدث في الخلايا البدائية. لدينا البروتوكولات أيضا تمكين التطبيقات المحتملة في تطوير منظومات إيصال الطب الحيوي والمفاعلات الحيوية للتفاعلات الكيميائية الحيوية الأخرى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.W.S. هو محقق من معهد هوارد هيوز الطبي. بتأييد هذا العمل جزئيا بمنحه (290363) من “مؤسسة سيمونز” إلى J.W.S. A.E.E. و K.P.A. على حد سواء الاعتراف بدعم من جامعة مينيسوتا أموال بدء التشغيل.
Materials
| sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
| calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
| tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
| citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
| sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
| potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
| oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
| glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
| Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
| magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
| sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
| 15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
| urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
| titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
| RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
| RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
| hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
| hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
| vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
| fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
| 96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
| plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
| confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
| gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |
References
- Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
- Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco, ., Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).
- Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).
- Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).
- Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).
- Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).
- Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
- Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
- Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4 (4), e5009 (2009).
- Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, (2013).
