Preparazione, purificazione e l'uso dei liposomi contenenti acidi grassi

1. preparazione vescicola Preparazione di film sottili Utilizzare siringhe tight gas per trasferire determinate quantità di lipidi, come descritto nella tabella 1.1 al cloroformio in un flaconcino di vetro. Far evaporare la soluzione risultante in un flusso di azoto o argon nella cappa fumi. Sottoporre la pellicola sottile risultante a vuoto di casa per almeno 2 h rimuovere eventuali residui di cloroformio. I lipidi possono essere lasciati sotto vuoto durante la notte a questo punto. Reidratazione delle vescicole Preparare 10 mL di tampone di 5mm calceina 250 mM tris-HCl pH 8.0 idratazione 31 mg di polvere di calceina in 2,5 mL di 1 M di tampone tris-HCl pH 8.0 di dissoluzione e aggiungendo un altro 7,5 mL di acqua deionizzata (DI). Pipettare 250 µ l di sopra buffer di idratazione in una provetta vuota e aggiungere 1,875 µ l di NaOH 10 M per un finale 75 mM base (½ equivalente degli acidi grassi totali). Trasferire la soluzione per il film sottile di lipido asciutto alle vescicole di forma con una concentrazione di lipidi totali di 0,15 M. Uso ad alta velocità (> 3000 giri/min) vortex vortice la miscela risultante per 4-5 s. Lasciare la miscela di lipidi-buffer su un agitatore rotante a bassa velocità (ca. 30 giri/min) per reidratare, almeno durante la notte. Dimensionamento delle vescicole (opzionale) Con pinzette, applicare un filtro supporto ogni superficie interna delle porte siringa dell’estrusore. Bagnare ogni supporto filtro con 250 mM tris-HCl, pH 8. Con una pinzetta, applicare una traccia-acidato 100 nm in policarbonato delle membrane a uno dell’estrusore O-ring e filtro supporta. Avendo cura di non strappare o forare la membrana, spingere delicatamente la membrana verso l’o-ring in modo da rendere il buon contatto tra le due superfici. Montare l’estrusore, facendo attenzione a non per spostare la membrana e filtro supporta. Riempire una siringa estrusore con ca. 0,5 mL di 250 mM tris-HCl, pH 8. Inserire la siringa in un lato dell’estrusore. Inserire una siringa vuota nel lato opposto dell’estrusore. A mano, spingere lo stantuffo della siringa contenente tampone lentamente (≤ 50 µ l/s) e verificare che si avverte resistenza, che indica che la membrana pista-inciso è a posto e intatto. È utile praticare questo passo senza una membrana in atto al fine di valutare il grado di resistenza. Rimuovere e svuotare le due siringhe. Non è necessario pulire le due siringhe in questa fase poiché contengono buffer di composizione identica per la preparazione dei liposomi. Caricare la preparazione dei liposomi in una delle due siringhe. Rimontare l’estrusore con siringa contenente il campione di vescicola sul lato sinistro e siringa vuota sul lato destro. A mano, spingere lo stantuffo della siringa contenente vescicola campione molto lentamente (10-25 µ l/s). Osservare attentamente la siringa sul lato destro dell’estrusore; Cancella buffer inizialmente entrerà il lato destro dell’estrusore (ca. 50 µ l, questo è dovuto al volume morto interno dell’estrusore), seguita da un piccolo pennacchio di liposomi estrusi. Immediatamente smettere di premere a questo punto, rimuovere la siringa sul lato destro dell’estrusore e scartare questa soluzione. Sostituire la siringa sul lato destro dell’estrusore ed estrudere fino a svuotare la siringa di sinistra. Invertire l’orientamento dell’estrusore e ripetere il passaggio 13. Proseguire per il numero desiderato di cicli (in genere 7, 9 o 11); un numero dispari viene sempre utilizzato per garantire ONU-estrusi liposomi non sono raccolti presso la siringa contenente inizialmente la preparazione dei liposomi pre-downsizing. Delicatamente versare il contenuto della siringa giusta in una provetta Eppendorf e posizionare il tubo su un agitatore rotante a bassa velocità (ca. 30 giri/min) per circa 0,5 h. Procedere con purificazione della vescicola, come descritto nella sezione 2. Vescicole estruse devono essere utilizzate entro 24 ore o ri-estrusi prima del successivo utilizzo. 2. purificazione vescicola Preparazione della fase mobile di purificazione della vescicola Preparare 5 mL di tampone a 250 mM tris-HCl pH 8 idratazione aggiungendo 1,25 mL di tampone a 1 M tris-HCl pH 8, 3,75 mL di acqua deionizzata per un tubo Falcon da 15 mL. Quindi 37,5 µ l di NaOH 10 M (½ equivalente di base relativo acido grasso non esterificato) nel buffer di idratazione. Pipettare 235 µ l di acido oleico puro direttamente nella provetta Falcon derivando una soluzione di vescicola con lipidi totali 0,15 M. Uso ad alta velocità (> 3000 giri/min) vortex vortice la miscela per 4-5 s, quindi asciugare in asciugatrice a bassa velocità di rotazione dell’agitatore per almeno 2 h. La preparazione del lipido può essere lasciata durante la notte sull’agitatore rotante a questo punto. Filtrare la fase mobile attraverso 0.22 μm unità di filtro siringa prima dell’uso per rimuovere qualsiasi aggregazione potenziale. Purificazione delle vescicole su Sepharose Rimuovere ca. 5 mL di etanolica Sepharose 4B liquami dal flacone usando una pipetta. Applicare questo a una colonna di cromatografia monouso da 10 mL. Consentire il liquame a stabilirsi ed etanolo scorrere-attraverso fino a etanolo si avvicini superiore del letto della resina. Applicare 5 mL di acqua deionizzata in cima della resina e lascia scorrere-attraverso per lavare via i residui di etanolo. Applicare 250 mM tris-HCl, pH 8 in porzioni di 1-2 mL alla parte superiore della resina, l’applicazione di una nuova porzione ogni volta che il livello del liquido si avvicina la parte superiore del letto di resina. Ripetere per 3 – 5 volte. Fissare la colonna allo stand della storta, quindi collegare la punta della colonna con rubinetto connettore e tubi al collettore frazione. Aggiungere un’altra porzione di buffer per svuotare i tubi, chiudere il rubinetto quando il livello del liquido nella colonna si avvicina la parte superiore della resina. Applicare le vescicole estruse dalla sezione 1 alla parte superiore della resina utilizzando una pipetta 200 µ l, facendo attenzione a stendere uniformemente come possibile la preparazione delle vescicole alla resina senza toccare la parete letto o colonna di resina. Aprire il rubinetto per iniziare il flusso e iniziare a raccogliere le frazioni in una piastra a 96 pozzetti. Applicare la vescicola purificazione fase mobile nella parte superiore del letto di resina in 0,5-1 mL porzioni come buffer esaurisce, avendo cura di non per consentire il letto di resina ad asciugare. Raccogliere in caduta di cinque frazioni, raccogliendo almeno 36 pozzi (tre righe di una piastra a 96 pozzetti). Caratterizzazione di fluorescenza delle frazioni di purificazione Prendere la piastra a 96 pozzetti dalla sezione precedente e leggerlo su un lettore di piastra (λex= 485 nm, λem= 515 nm). Tracciare i dati di fluorescenza risultante come fluorescenza vs numero di frazione. Vescicole eluire in primo luogo, seguito dalla frazione non incapsulata (Figura 1). Quantità delle vescicole per monitorare la perdita della vescicola Ripetere i passaggi di purificazione e caratterizzazione di sezioni 2.2 e 2.3. Vescicole che hanno conservato il loro contenuto non saranno presente alcun picco di unencapsulated soluto (o uno molto piccolo di circa 5-10% dell’intensità del picco della vescicola). 3. uso delle vescicole in presenza di magnesio Uso di magnesio unliganded Preparare e purificare le vescicole come descritto nelle sezioni 1, 2.1 e 2.2. Preparare 1 mL di 50 mM MgCl2 soluzione nel buffer di 250 mM tris-HCl pH 8.0 aggiungendo 250 µ l di tampone di 1 M tris-HCl pH 8.0 e 50 µ l di 1 M MgCl2 a 700 µ l di acqua. Vortice per mescolare bene. Per dare la concentrazione di magnesio desiderata di 5mm, mescolare 0,9 mL di vescicole purificate e 100 µ l di soluzione di magnesio e mescolare velocemente per minimizzare le interruzioni della vescicola di esposizione transitoria delle vescicole ad alta concentrazione locale di magnesio.Nota: Miscelazione rapida della soluzione di magnesio è critico per la stabilità della vescicola. Se il magnesio e le vescicole non sono mescolate in modo immediato nel Vortex, alcune vescicole saranno esposti a concentrazioni più elevate di magnesio, con conseguente risultati incoerenti da campione a campione. Lasciare il campione delle vescicole su un tumbler per almeno 30 min prima di quantità come descritto al punto 2.4 per controllare eventuali perdite di contenuto. Aggiungere la stessa concentrazione di magnesio come esempio di vescicola alla fase mobile quantità. Uso di magnesio liganded Preparare e purificare le vescicole come descritto nelle sezioni 1, 2.1 e 2.2.Nota: Utilizzare ½ KOH equivalente invece di NaOH per deprotonate acidi grassi; è stato trovato che questo produce più stabili liposomi in chelati MgCl2 sistemi. Preparare la soluzione di citrato di potassio 2M e regolare il pH a 8.0 con KOH. Premix MgCl2 e potassio citrato al rapporto specificato (ca. 1:4 per stabile acido oleico vescicole) nel tampone di 250 mM tris-HCl pH 8.0. Aggiungere soluzione di citrato di magnesio premiscelata al campione della vescicola, brevemente vortice.Nota: Premix sempre soluzione di magnesio e ligando. Non esporre mai le vescicole alla soluzione di magnesio unchelated solo. Lasciare il campione delle vescicole su un tumbler per almeno 30 min prima di quantità come descritto al punto 2.4. Aggiungere la stessa concentrazione di magnesio e citrato come nell’esempio della vescicola per la fase mobile di quantità. 4. non-enzimatica RNA copia in vescicole Preparazione dei monodispersi RNA incapsulato vescicole Preparare una pellicola di acido oleico secco come descritto nella sezione 1.1. Preparare il tampone di reidratazione della vescicola con primer di RNA con etichetta fluorescente 50 µM, modello di RNA 150 µM e 250 mM tris-HCl a pH 8,0 contenente ½ KOH equivalente relativo acido oleico. Aggiungere 250 µ l di tampone di reidratazione per il film lipidico e seguire il passo 1.2.2 e 1.2.3 per rendere vescicole con concentrazione di lipidi totale 0,15 M. Al fine di rendere unilamellari piccole vescicole monodispersi, seguire la sezione 1.3 per l’estrusione della vescicola. Purificazione di aggiunta e della vescicola di citrato di magnesio Premix scorte di magnesio e citrato e poi mescolare con il campione di vescicola a una concentrazione finale del lipido di 0,1 M. Purificare le vescicole su Sepharose 4B colonna dimensione esclusione, con 250 millimetri tris-HCl pH 8.0, lipidi 0,1 M e dato magnesio e citrato come fase mobile. Raccogliere le frazioni della vescicola di seguente sezione 2.3. Reazione di estensione di primer Preparare soluzione stock di 200 mM 2-MeImpG (5′-monofosfato di guanosina 2-methylimidazolide) con 250 millimetri tris-HCl pH 8.0. (Nota: seguire precedente pubblicato il protocollo10 per la sintesi di 2-MeImpG.) Per avviare la reazione di estensione di primer, trasferimento 150 µ l di soluzione di riserva 2-MeImpG in 450 µ l di campione di vescicola per raggiungere una concentrazione finale di 50 mM e 75 mM lipido attivato monomero. Avvia il timer e mantenere la reazione del campione cadendo tutto il tempo. (Opzionale) Per l’alimentazione continua monomero fresco, trasferire 300 µ l di soluzione di reazione a uno alloggiamento di un laboratorio costruito piccolo-volume liposoma dializzatore11 e mettere 300 µ l soluzione in altra camera di alimentazione. La soluzione di alimentazione deve contenere tutti gli ingredienti alla stessa concentrazione come la soluzione di reazione, fatta eccezione per la sostituzione di RNA contenenti vescicole con vescicole vuote. Ogni turno di dialisi prende 1-24 h, a seconda dell’analita e la membrana utilizzata. Per studi cinetici, prendere un 100 µ l aliquota in ogni momento e repurify l’aliquota attraverso una colonna di esclusione Sepharose 4B dimensioni con 250 millimetri tris-HCl pH 8.0 come fase mobile. Raccogliere le frazioni di vescicola in una provetta eppendorf da 1,5 mL. Pipettare Triton per le frazioni di vescicola ad un finale di circa 0,1% v/v. Aggiungere 0,5 mL di etanolo freddo al tubo e incubare a-20 ° C per almeno 2 h. Centrifugare tutti i campioni a 16,1 × 1000 rcf (16,1 × g) per 10 min e delicatamente pipetta fuori i liquidi. Lavare il RNA pellet con etanolo al 70% freddo e centrifugare nuovamente per 5 min, eliminare il liquido e mettere il tubo con pellet di RNA su un blocco di calore 80 ° C per 2 min per far evaporare etanolo residuo. Sciogliere il pellet in 50 µ l di 8 M Urea con tampone di caricamento 1xTBE. Analisi della pagina Preparare 20% gel PAGE mescolando 200 mL di UreaGel sistema concentrato, 25 mL di diluente, del sistema di UreaGel 25 mL di buffer di 10xTBE, 80 µ l di TEMED e 250 mg di persolfato di ammonio. Versare il composto di gel tra lastre di gel di bloccaggio (35 centimetri x 45 centimetri) e inserire il pettine rapidamente. Aspettare almeno 30 minuti fino a completa polimerizzazione. Montare la piastra di gel sul supporto in gel e riempire le caselle di gel con il gel 1xTBE tampone di corsa. Togliere il pettine e lavare i pozzetti con la siringa. Pre-corsa il gel con 60 W per 30 min. Riscaldare i campioni sul blocco di calore di 80 ° C per 2 min e 5 µ l di ogni campione per pozzetto di carico. Attivare la casella di potere di gel e impostata gel in esecuzione con Watt costante a 60 W per 2,5 h. Smontare la lastra di gel presso lo stand di gel, pulire il vetro e mettere tutta la piastra in gel scanner per avviare la scansione di gel. Quantificare il gel con analisi 1D ImageQuant TL. Tracciare il logaritmo naturale del rapporto tra la quantità di primer restanti in un punto dato tempo all’importo iniziale di primer vs tempo, adatta a una linea e calcolare il tasso di reazione pseudo-primo ordine (Figura 2). 5. hammerhead RNA Self clivaggio in vescicole Preparazione e purificazione di ribozima incapsulato in vescicole Preparare una pellicola sottile del lipido (OA: OGM = 9:1) nella sezione 1.1 con componenti come in tabella 1.2. Nota: caldo OGM ad almeno 60 ° C per la fusione completa prima dell’uso. Preparare il tampone di reidratazione della vescicola con 5 µM di ogni filo ribozima hammerhead e 250 millimetri tris-HCl pH 8.0. Aggiungere 250 µ l di tampone di reidratazione per il film lipidico e seguire i passaggi 1.2.2 e 1.2.3 per rendere vescicole con 0,15 M totale del lipido concentrazione. Al fine di rendere unilamellari piccole vescicole monodispersi, seguire la sezione 1.3 per l’estrusione della vescicola. Purificare le vescicole su una colonna esclusione Sepharose 4B dimensioni, con 250 millimetri tris-HCl pH 8.0, 0,15 M miscelati lipidi come fase mobile. Reazione di auto-fenditura del ribozima Hammerhead Preparare la soluzione di magnesio e mescolare con le vescicole purificate come descritto nella sezione 3.1 per avviare la reazione di auto-fenditura. Per studi cinetici, prendere 100 µ l della miscela in ogni momento e direttamente repurify questa aliquota attraverso una colonna di esclusione Sepharose 4B dimensioni con 250 millimetri tris-HCl pH 8.0 come fase mobile. Raccogliere la frazione di vescicola. Analisi della pagina Procedura 4.3.6 a 4.3.8 per preparare il caricamento del campione di RNA. Porre in commercio castato gel di TBE-Urea 15% nella scatola di gel e riempire la vaschetta del gel con il gel 1xTBE tampone di corsa. Riscaldare i campioni sul blocco di calore di 80 ° C per 1 min e 5 µ l di ogni campione per pozzetto di carico. Esegua il gel con costante 200 V per circa 1 h. Scansione il gel. Quantificare il gel con un software di analisi, come TL ImageQuant 1D, per misurare l’entità della fenditura confrontando l’intensità delle restanti band di RNA substrato e RNA fenduto frammento banda (Figura 3). 6. gigante dell’acido grasso vescicole per microscopia Preparazione delle vescicole giganti dell’acido grasso Seguire la sezione 1.1 e 1.3 tabella per preparare un film sottile di acido oleico 0,2 mol % di lipidi fluorescente contrassegnati per una migliore osservazione della membrana. Reidratare il film lipidico con 500 µ l 250 mM tris-HCl pH 8.0 per rendere i lipidi di vescicola campione 10 mM in totale. Il buffer può contenere coloranti fluorescenti o molecole di RNA, se lo si desidera. Lasciare la vescicola campione cadendo durante la notte. Preparare i lipidi totali 150 mL di tampone di dialisi di acido grasso puro con 10 mM con 470 µ l di acido oleico e 150 mL 250 mM tris-HCl a pH 8,0 contenente ½ NaOH equivalente. Estrudere il campione di vescicola attraverso una membrana di policarbonato 10 µm per rimuovere grandi aggregati. Trasferire il campione di vescicola nel cassetto di grande poro dialisi 1 µm, come descritto in precedenza. 12 Inserire la cassetta di dialisi in un becher da 100 mL contenente 30 mL di tampone di dialisi. Agitare il recipiente delicatamente su un agitatore di tavolo a 80-100 rpm. Modificare il buffer di dialisi ogni 30 min per 5 volte rimuovere tinture libere o RNA e piccole vescicole. Rimuovere delicatamente il campione della vescicola dal cassetto dialisi con una siringa e un trasferimento in una provetta Eppendorf. Osservazione di microscopia Pipettare 10 µ l di vescicole su un vetrino pulito standard e mettere un vetro vetrini coprioggetto sopra il campione. Guarnizione vetro di copertura con smalto trasparente. Osservare le vescicole con un 60 X olio-dispersione o simile obiettivo mediante microscopia confocale utilizzando la sorgente laser appropriato per la membrana fluorescente etichettati, RNA o tintura incapsulata (Figura 4).