Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

1. vezikül hazırlık İnce filmleri hazırlanması Gaz sıkı şırınga lipidler belirli miktarda bir cam şişede kloroform için Tablo 1.1 açıklandığı gibi aktarmak için kullanın. Azot veya duman başlıklı argon akışı altında elde edilen çözüm buharlaşır. Elde edilen ince film ev vakum en az 2 h herhangi bir kloroform artıklarını çıkarın için tabi. Lipid vakum altında bir gecede bu noktada bırakılabilir. Rehidrasyon veziküller 5 mM calcein 250 mM tris-HCl pH 8.0 hidrasyon arabellek 10 mL calcein tozu 1 M tris-HCl pH 8.0 arabellek 2.5 ml 31 mg eriterek ve başka bir 7.5 mL deiyonize (DI) su ekleyerek hazırlayın. Hidrasyon arabellek üstüne, 250 µL boş bir tüp içine pipet ve 1,875 µL son 75 mM taban için 10 M NaOH (Toplam yağ asitleri ½ eşdeğeri) ekleyin. Çözüm için formu veziküller kuru lipid ince film 0.15 M toplam lipid konsantrasyon ile aktarın. Kullanım yüksek hızlı (> 3000 d/d) vortexer girdap 4-5 s için elde edilen karışımı için. Lipid-tampon karışımı suyla temasa, en az bir gecede üzerinde bir düşük hızlı (ca. 30 rpm) dönen bir shaker bırakın. Boyutlandırma veziküller (isteğe bağlı) Cımbız kullanarak, bir filtre destek Ekstruder şırınga noktalarından iç her yüzey için geçerlidir. Her filtre desteği 250 mM tris ile ıslak-HCl, pH 8. Cımbız kullanarak, bir parça kazınmış 100 nm polikarbonat membran Ekstruder o-Ring birine uygulamak ve filtre destekler. Değil gözyaşı veya membran ponksiyon, yavaşça içine iki yüzey arasında iyi temas yapmak için O-ring membran itmek için dikkat çekici. Membran yerinden değil için dikkat çekici Ekstruder, montaj ve filtre destekler. Bir Ekstruder şırınga ile ca. 0,5 mL 250 mM tris doldurun-HCl, pH 8. Bu şırınga ekstruder bir tarafı yerleştirin. Boş bir şırınga Ekstruder öbür yerleştirin. Elle, arabellek içeren yavaş yavaş şırınga (≤ 50 µL/s) pistonu itmek ve direnç, yer ve sağlam parça kazınmış membran olduğunu belirten hissedilir doğrulayın. Direnç beklenen düzeyini ölçmek için bu adım olmadan bir membran yerde uygulaması yararlıdır. Kaldırmak ve iki şırınga boş. Aynı kompozisyon lipozom hazırlık için arabellek içerdiğinden, bu aşamada iki şırınga temizlemek gerekli değildir. Lipozom hazırlık iki şırınga birinin içine yerleştirin. Extruder Makinası vezikül örnek sol ve sağ tarafta boş şırınga içeren şırınga ile yeniden monte. El, vezikül örnek çok yavaş içeren şırınga (10-25 µL/s) pistonu itin. Ekstruder sağ tarafında şırınga dikkatle gözlemlemek; Açık arabellek başlangıçta Ekstruder sağ tarafında girin (ca. 50 µL, bu Ekstruder ölü iç hacmi nedeniyle), haddelenmiş lipozomlar küçük bir tüy tarafından takip. Hemen bu noktada itmeyi bırak, şırınga Ekstruder sağ tarafında kaldırmak ve bu çözüm atın. Şırınga Ekstruder sağ tarafında değiştirin ve sol şırınga boşalıncaya kadar bükün. Ekstruder yönünü tersine çevirmek ve 13 arasındaki adımları yineleyin. Devir (genellikle 7, 9 veya 11); istenilen sayıda için devam bir tek sayı her zaman un haddelenmiş lipozomlar başlangıçta öncesi küçülme lipozom hazırlık içeren şırıngadan toplanan değil emin olmak için kullanılır. Yavaşça bir Eppendorf tüp içine doğru şırınga içeriğini dağıtmak ve yaklaşık 0,5 h için bir düşük hızlı (ca. 30 rpm) dönen shaker tüpü yerleştirin. Vezikül arıtma ile Bölüm 2’de açıklandığı gibi devam edin. Haddelenmiş veziküller içinde 24 h kullanılan veya sonraki saat kullanmadan önce yeniden kalıptan çekilmiş. 2. vezikül arıtma Vezikül arıtma mobil faz hazırlanması 5 mL 250 mM tris-HCl pH 8 hidrasyon arabellek de 1,25 mL 1 M tris-HCl pH 8 arabelleği, 3.75 mL DI su 15 ml Falcon tüp ekleyerek hazırlayın. Sonra 10 M NaOH 37,5 µL ekleyin (Bankası unesterified yağ asidi göre ½ eşdeğeri) hidrasyon arabellek. Doğrudan bir vezikül çözüm 0.15 M toplam lipidler ile sonuçlanan Falcon tüp içine saf oleik asitin 235 µL pipet. Kullanım yüksek hızlı (> 3000 devir/dakika) girdap karışımı 4-5 s için için vortexer sonra takla shaker en az 2 h için döner bir düşük hızlı üzerinde. Lipid hazırlık gecede üzerinde dönen shaker bu noktada bırakılabilir. Herhangi bir potansiyel toplamları kaldırmak için kullanmadan önce 0.22 mikron şırınga filtre ünitesi ile mobil faz filtre. Veziküller Sepharose üzerinde arıtma CA. 5 mL ethanolic Sepharose 4B Bulamaç de bir pipet kullanarak şişeden çıkarın. Bu bir tek kullanımlık 10 mL Kromatografi sütun için geçerli. Etanol reçine yatağın üst yaklaşımlar dek yerleşmeye Bulamaç ve etanol akışı aracılığıyla izin veremeyiz. 5 mL uygulayın reçine ve izin akış-etanol kalıntı silsin için aracılığıyla üst deiyonize su. 250 mM tris uygulamak-HCl, pH 8 ‘ 1-2 mL bölümleri yeni bir bölümü sıvı düzeyi reçine yatağın üstündeki yaklaşımlar her zaman uygulamak reçine, dön. Yineleme için 3 – 5 kez. Sütun imbik kürsüye kelepçe, ardından stopcock bağlayıcı ve boru kesir toplayıcı için sütun ucunu bağlayın. Tampon tüp floş, Sıvı düzey sütun reçine üst yaklaştığında stopcock kapatmak için başka bir bölümüne ekleyin. Haddelenmiş veziküller 200 µL pipettor kullanarak, vezikül hazırlık mümkün olduğunca eşit uygulamak için reçine reçine yatak veya sütun duvar dokunmadan için dikkat çekici reçine üst bölüm 1 uygulamak. Akışını başlamak ve kesirler bir 96-şey plaka toplamaya başlamak için stopcock açın. 0.5-1 reçine yatakta üstündeki vezikül arıtma mobil faz uygulamak mL porsiyon arabellek depletes, reçine yatak kurumasına izin vermemek için dikkat çekici gibi. En az 36 wells (96-şey plaka üç sıra) toplama beş bırak kesirler içinde toplamak. Arıtma kesirler Floresans karakterizasyonu 96-şey plaka önceki bölümden almak ve bir plaka okuyucu okumak (λex485 = nm, λem515 = nm). Floresans kesir sayısı vs olarak elde edilen floresan verileri çizmek. Veziküller elute önce unencapsulated kısmı (şekil 1) tarafından takip. Veziküller vezikül sızıntı izlemek için repurification Bölüm 2,2 ve 2.3 arıtma ve karakterizasyonu adımlarını yineleyin. İçeriklerini berraklığını veziküller unencapsulated çözünen (ya da çok küçük bir vezikül en yüksek yoğunluk yaklaşık 5-) hiçbir zirvesine sergileyecek. 3. veziküller magnezyum huzurunda kullanımı Unliganded magnezyum kullanımı Hazırlamak ve veziküller 1, 2,1 ve 2,2 bölümlerinde açıklandığı gibi arındırmak. 50 mm MgCl2 çözüm içinde 250 mM tris-HCl pH 8.0 tampon 1 mL 1 M tris-HCl pH 8.0 arabelleği 250 µL ve 1 M MgCl2 50 µL DI 700 µL için ekleyerek su hazırlamak. Girdap iyice karıştırın. 5 mM istenen magnezyum konsantrasyon vermek, 0.9 mL saf veziküller ve 100 µL magnezyum çözüm mix ve hızla geçici veziküller maruz magnezyum yüksek yerel konsantrasyon vezikül kesintileri en aza indirmek için heyecan.Not: Magnezyum çözümü hızlı karıştırma vezikül istikrar için önemlidir. Magnezyum ve veziküller hızlı bir şekilde hemen vortexing tarafından karışık değil, bazı veziküller içinde tutarsız sonuçlar örnek örnek sonucu magnezyum, daha yüksek konsantrasyonları maruz kalacağı. 2.4 içeriği sızıntı için kontrol etmek için açıklandığı gibi bir bardak için en az 30 dk önce repurification vezikül örnek çıkarma. Magnezyum vezikül örnekteki gibi aynı yoğunlukta repurification mobil faz ekleyin. Liganded magnezyum kullanımı Hazırlamak ve veziküller 1, 2,1 ve 2,2 bölümlerinde açıklandığı gibi arındırmak.Not: ½ eşdeğer KOH NaOH yerine deprotonate yağ asitleri için kullanın; Bu Şelatatlı MgCl2 sistemlerinde daha istikrarlı lipozomlar üretir bulundu. 2 M potasyum sitrat çözüm hazırlamak ve pH 8,0 KOH ile ayarlayın. MgCl2 ve potasyum sitrat belirtilen oranında (ca. 1:4 için kararlı oleik asit veziküller) 250 mM tris-HCl pH 8.0 arabelleği premix. Premix Magnezyum sitrat çözüm vezikül örnek, kısaca girdap ekleyin.Not: Her zaman magnezyum ve ligand çözüm premix. Unchelated magnezyum çözüm yalnız veziküller pilleri. 2.4 açıklandığı gibi bir bardak için en az 30 dk önce repurification vezikül örnek çıkarma. Magnezyum ve sitrat vezikül örnekteki gibi aynı konsantrasyon repurification mobil faz ekleyin. 4. non-enzimatik RNA veziküller içinde kopyalama Monodisperse RNA hazırlanması veziküller kapsüllenmiş Bir kuru oleik asit film 1.1 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın. Vezikül rehidrasyon arabellek 50 µM floresan etiketli RNA astar ile 150 µM RNA şablonu ve 250 mM tris-HCl pH ½ eşdeğer KOH göre oleik asit içeren 8.0 hazırlayın. Rehidrasyon arabelleği 250 µL lipid video eklemek ve takip adım 1.2.2 ve veziküller toplam 0.15 M lipid konsantrasyon ile yapmak 1.2.3. Küçük unilamellar monodisperse veziküller yapmak için bölümü 1.3 vezikül ekstrüzyon için izleyin. Magnezyum sitrat toplama ve vezikül arıtma Magnezyum ve sitrat stokları premix ve bu son lipid konsantrasyonu 0.1 m vezikül örnek ile karıştırın. Veziküller Sepharose 4B boyutu dışlama sütun, 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0.1 M lipidler ve Magnezyum sitrat mobil faz olarak verilen arındırmak. Vezikül kesirler ile aşağıdaki bölüm 2.3 toplamak. Astar uzantısı tepki 200 mM 250 mM tris-HCl pH 8.0 ile 2-MeImpG (guanozin 5’-monofosfattır 2-methylimidazolide) hisse senedi çözüm hazırlamak. (Not: takip önceki 2-MeImpG sentezi için protokol10 yayınlandı.) Astar uzantısı reaksiyonu başlatmak için 450 µL vezikül örnek için 75 mM lipid ve 50 mM aktif monomer son bir konsantrasyon ulaşmak için 2-MeImpG hisse senedi çözüm 150 µL aktarın. Örnek sayacı ve tutmak tepki her zaman yuvarlanan Başlat. (İsteğe bağlı) Sürekli taze monomer beslenmesi için 300 µL tepki çözüm bir odasına bir laboratuar inşa küçük hacimli lipozom dialyzer11 ve çözüm diğer odasında besleme yerine 300 µL aktarın. Besleme çözüm veziküller boş veziküller ile içeren RNA değiştirme dışında tepki çözüm olduğu gibi aynı konsantrasyonu, tüm malzemeyi içermelidir. Diyaliz her turun analit ve membran kullanılan bağlı olarak 1 / 24 h alır. Kinetik çalışmalar, 100 µL her zaman noktası aliquot al ve aliquot üzerinden Sepharose 4B boyutu dışlama sütun mobil faz olarak 250 mM tris-HCl pH 8.0 ile repurify. Bir 1,5 mL eppendorf tüp vezikül kesirleri toplamak. Triton vezikül kesirler bir final yaklaşık %0,1 için pipet v/v. Soğuk etanol 0.5 mL tüp ekleyin ve en az 2 h için-20 ° C’de kuluçkaya. 16,1 × 1000, tüm örnekler santrifüj kapasitesi rcf (16,1 × g) 10 dk ve yavaşça pipet sıvı dışarı için. RNA % 70 soğuk etanol ve santrifüj ile granül yıkama tekrar 5 dakika süreyle sıvı atmak ve RNA parçaları ile tüp kalan etanol buharlaşır için 2 dakika için bir 80 ° C ısı blok koymak. 8 M üre 1xTBE yükleme arabelleği ile 50 µL granül geçiyoruz. SAYFA analizi % 20 hazırlamak sayfa jel 200 mL UreaGel sisteminin konsantre ol, seyreltici, UreaGel sisteminin 25 mL karıştırma 10xTBE arabelleği 25 mL, TEMED, 80 µL ve amonyum persülfat 250 mg tarafından. Hızlı bir şekilde klempe jel plaka (35 cm × 45 cm) arasındaki jel karışımı dökün ve tarak ekleyin. En az 30 dk eksiksiz polimerizasyon kadar bekleyin. Jel plaka jel stand üzerine monte ve tampon çalıştıran 1xTBE jel ile jel kutuları doldurun. Tarak almak ve kuyular şırınga ile yıkayın. 60 W 30 dk. için jel önceden çalıştırın. Örnekleri için 2 dk 80 ° C ısı blokta ısı ve iyi ücret her örneğinin 5 µL yük. Jel güç kutusunu açın ve jel 60 W 2,5 h için sürekli Watt ile çalışan ayarlayın. Jel plaka jel stand sökmeye, camı temizle ve jel taramayı başlatmak için jel tarayıcıda bütün plaka koymak. Jel ImageQuant TL 1 D analizi ile ölçmek. Astar astar zaman vs başlangıç miktarı için bir zaman noktasında kalan miktarı oranında doğal logaritması arsa, bir satır için uygun ve sözde ilk sipariş reaksiyon oranı (Resim 2) hesaplamak. 5. hammerhead RNA kendini bölünme veziküller içinde Hazırlık ve veziküller içinde kapsüllü ribozyme arıtma Lipid ince bir film hazırlamak (OA: GDO 9:1 =) bölümünde 1.1 bileşenleri ile olarak olduğu gibi Tablo 1.2. Not: en az 60 ° tam kullanmadan önce erime için c sıcak GDO. Vezikül rehidrasyon arabellek her çekiç ribozyme strand ve 250 mM tris-HCl pH 8.0 5 mikron ile hazırlayın. Rehidrasyon arabelleği 250 µL lipid video eklemek ve adım 1.2.2 ve veziküller ile 0.15 M toplam yapmak 1.2.3 lipid konsantrasyon izleyin. Küçük unilamellar monodisperse veziküller yapmak için bölümü 1.3 vezikül ekstrüzyon için izleyin. Lipidler mobil faz karışık veziküller bir Sepharose 4B boyutu sütun dışlama, 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0.15 M ile arındırmak. Çekiç kafa ribozyme öz-bölünme tepki Magnezyum çözüm hazırlamak ve öz-bölünme reaksiyonu başlatmak için bölümde 3.1 açıklandığı gibi saf veziküller ile karıştırın. Kinetik çalışmalar, her zaman noktası 100 µL karışımı alın ve doğrudan bu aliquot üzerinden Sepharose 4B boyutu dışlama sütun mobil faz olarak 250 mM tris-HCl pH 8.0 ile repurify. Vezikül kesir toplamak. SAYFA analizi Örnek yükleme RNA hazırlamak için 4.3.6 4.3.8 adımları uygulayın. Ticari olarak döküm % 15 TBE-üre jel jel kutusu koyun ve jel kutusu arabellek çalışan 1xTBE jel ile doldurun. Örnekleri için 1 dk 80 ° C ısı blokta ısı ve iyi ücret her örneğinin 5 µL yük. Jel yaklaşık 1 h için sürekli 200 V ile çalıştırın. Jel inceden inceye gözden geçirmek. Jel ImageQuant TL 1 D gibi bir analiz yazılımı ile ölçmek, kalan şiddeti karşılaştırarak bölünme kapsamını ölçmek için bant (şekil 3) substrat RNA band ve i ciddi RNA parçası. 6. dev yağ asidi veziküller mikroskopi için Dev yağ asidi veziküller hazırlanması Bölüm 1.1 ve oleik asit ince film fluorescently etiketli lipid mol % 0.2 ile daha iyi membran gözlem için hazırlamak için Tablo 1.3 izleyin. 500 µL 250 mM tris-HCl pH toplamda vezikül örnek 10 mM lipidler yapmak 8.0 ile lipid film rehydrate. Arabellek floresan boyalar veya RNA molekülleri istenirse içeriyor olabilir. Vezikül örnek gecede yuvarlanan bırakın. 150 mL saf yağ asidi diyaliz arabelleği 10 mM ile toplam lipidler 470 µL oleik asit ve 150 mL 250 mM tris-HCl pH ½ eşdeğer NaOH içeren 8.0 karıştırarak hazırlayın. Büyük toplamları kaldırmak için bir 10 µm polikarbonat membran aracılığıyla vezikül örnek A’ya. Vezikül örnek daha önce açıklandığı gibi 1 µm büyük gözenek diyaliz kaset aktarın. 12 Diyaliz kaset 30 mL diyaliz arabellek içeren bir 100 mL kabı yerleştirin. Kabı hafifçe üfleyin, 80-100 rpm de bir masa üstü shaker kışkırtmak. Diyaliz arabellek her 30 dk ücretsiz boya veya RNA ve küçük veziküller kaldırmak 5 kere için değiştirin. Dikkatli bir şekilde vezikül örnek diyaliz kaset bir şırınga ve transferi ile bir Eppendorf tüp çıkarın. Mikroskopi gözlem Veziküller temiz çift mikroskop slayt üzerine 10 µL pipet ve cam kapak notu örnek yerleştirin. Cam şeffaf oje ile kapatın. Confocal mikroskobu fluorescently etiketli membran, RNA veya Kapsüllenen boya (şekil 4) için uygun lazer kaynak kullanarak tarafından bir 60 X yağ dağılım veya benzer amacı ile veziküller gözlemlemek.