Preparação, purificação e utilização de lipossomas contendo ácido graxo

1. preparação de vesículas Preparação de filmes finos Use seringas apertado de gás para transferir certa quantidade de lipídios, conforme descrito na tabela 1.1 de clorofórmio em um frasco de vidro. Evapore a solução resultante sob um fluxo de nitrogênio ou argônio na coifa. Submeta a película fina resultante a vácuo de casa pelo menos 2 h remover qualquer resíduo de clorofórmio. Os lipídios podem ser deixados sob vácuo durante a noite neste ponto. Reidratação das vesículas Prepare-se 10 mL de 5mm calceína 250 mM tris-HCl pH 8.0 hidratação buffer dissolvendo 31 mg de pó de calceína em 2,5 mL de tampão de pH 8.0 de tris-HCl 1m e adicionando outra 7,5 mL de água desionizada (DI). Pipetar 250 µ l de buffer de hidratação acima de um tubo vazio e adicionar 1.875 µ l de 10 M NaOH para um final base de 75 mM (equivalente a ½ do total de ácidos graxos). Transferi a solução para a película fina de lipídio seco para vesículas de formulário com uma concentração de lipídios totais de 0,15 M. Uso de alta velocidade (> 3000 rpm) reaccional de vórtice a mistura resultante para 4-5 s. Deixe a mistura lipídica-tampão num agitador rotativo de baixa velocidade (ca. 30 rpm) para Re-hidratar, pelo menos durante a noite. Dimensionamento das vesículas (opcionais) Usando uma pinça, aplica um filtro de suporte para cada superfície interna das portas seringa da extrusora. Molhe cada suporte de filtro com 250 mM tris-HCl, pH 8. Usando uma pinça, aplicar uma faixa gravada 100 nm policarbonato membrana a um da extrusora anéis e suportes de filtro. Tendo o cuidado de não rasgar ou furar a membrana, empurre suavemente a membrana para o-Ring, a fim de fazer bom contato entre duas superfícies. Montar a extrusora, tomando cuidado para não deslocar a membrana e o filtro suporta. Encher uma seringa de extrusora com ca. 0,5 mL de 250 mM tris-HCl, pH 8. Inserir esta seringa em um lado da extrusora. Introduza uma seringa vazia do outro lado da extrusora. Pela mão, empurrar o êmbolo da seringa contendo tampão lentamente (≤ 50 µ l/s) e verificar que a resistência é sentida, indicando a membrana faixa-gravadas no lugar e intacto. É útil praticar esta etapa sem uma membrana no local a fim de avaliar o nível esperado de resistência. Retire e esvazie as duas seringas. Não é necessário limpar as duas seringas nesta fase, pois eles contêm reserva de composição idêntica à preparação de lipossomas. Carrega a preparação de lipossomas em dentre as duas seringas. Remonte a extrusora com seringa contendo a amostra de vesículas na seringa vazia no lado direito e lado esquerdo. Pela mão, empurre o êmbolo da seringa que contém a amostra de vesículas muito lentamente (10-25 µ l/s). Observar cuidadosamente a seringa no lado direito da extrusora; clara reserva inicialmente entrará no lado direito da extrusora (ca. 50 µ l, isto é devido ao volume morto interno da extrusora), seguida de uma pequena nuvem de lipossomas extrudados. Imediatamente parar de empurrar neste ponto, retire a seringa do lado direito da extrusora e descartar esta solução. Substituir a seringa no lado direito da extrusora e extrusão até a seringa esquerda está vazia. Inverter a orientação da extrusora e repita a etapa 13. Continuar para o número desejado de ciclos (tipicamente 7, 9 ou 11); um número ímpar é sempre usado para garantir un-extrudados lipossomas não são coletados da seringa contendo inicialmente a preparação de lipossomas pre-redução de pessoal. Delicadamente, dispense o conteúdo da seringa certo em um tubo de Eppendorf e coloque o tubo num agitador rotativo de baixa velocidade (ca. 30 rpm) para cerca de 0,5 h. Prosseguir com a purificação de vesículas, conforme descrito na secção 2. Extrusão de vesículas devem ser usadas dentro de 24h ou re-extrudadas antes da próxima utilização. 2. purificação de vesículas Preparação de fase móvel de purificação de vesículas Prepare-se 5 mL de tampão de 8 hidratação 250 mM tris-HCl pH pela adição de 1,25 mL de tampão de pH 8 de tris-HCl 1 M, 3,75 mL de água Desionizada para um tubo Falcon de 15ml. Em seguida, adicione 37,5 µ l de 10 M de NaOH (equivalente a ½ da base em relação unesterified de ácidos gordos) para o buffer de hidratação. Pipete 235 µ l de ácido oleico puro diretamente para o tubo Falcon, resultando uma solução de vesículas com lipídios totais de 0,15 M. Uso de alta velocidade (> 3000 rpm) reaccional de vórtice a mistura para 4-5 s, depois da queda em baixa velocidade girando o agitador pelo menos 2 h. A preparação de lipídios pode ser deixada durante a noite no agitador rotativo neste ponto. Filtre a fase móvel através de 0,22 μm unidade de filtro de seringa antes do uso para remover qualquer potenciais agregados. Purificação de vesículas em Sepharose Remova ca. 5 mL de etanol Sepharose 4B chorume da garrafa usando uma pipeta. Aplica isso a uma coluna de cromatografia de 10ml descartável. Permitir que o chorume para resolver e etanol de passagem até o topo da cama resina se aproxima de etanol. Aplicar 5 mL de água desionizada ao topo da resina e deixe de passagem para lavar o resíduo de etanol. Aplicar 250 mM tris-HCl, pH 8 em porções de 1-2 mL para o topo da resina, aplicando uma nova parte de cada vez que o nível do líquido se aproxima do topo da cama da resina. Repita para 3 – 5 vezes. Fixe a coluna no stand da retorta e, em seguida, conecte a ponta de coluna com conector de torneira e tubulação para o coletor de fração. Adicione a outra porção de buffer para liberar o tubo, fechar a torneira quando o nível do líquido na coluna se aproxima do topo da resina. Aplicam-se as vesículas extrudadas da secção 1 para o topo da resina usando uma pipeta de 200 µ l, tendo o cuidado de aplicar a preparação de vesículas mais uniformemente possível à resina sem tocar a parede de cama ou coluna de resina. Abra a torneira para começar o fluxo e iniciar a coleta de frações em uma placa de 96 poços. Aplicar a fase móvel de purificação de vesículas para o topo da cama da resina em 0,5-1 mL porções como o buffer esgota, tomando cuidado para não permitir que a cama de resina secar. Colete em soltar cinco fracções, recolha de pelo menos 36 poços (três linhas de uma placa de 96 poços). Caracterização de fluorescência de frações de purificação Pegue a placa de 96 poços da seção anterior e lê-lo em um leitor de placas (λex= 485 nm, λem= 515 nm). Plotar os dados resultantes de fluorescência como fluorescência vs. número de fração. Vesículas eluir primeiro, seguido pela fração desencapsulada (Figura 1). Repurification de vesículas para monitorar o vazamento de vesículas Repita as etapas de purificação e caracterização em seções 2.2 e 2.3. Vesículas que retiveram seu conteúdo não irão expor nenhum pico de soluto desencapsulado (ou muito pequeno de ca. 5-10% da intensidade do pico do vesicle). 3. utilização das vesículas na presença de magnésio Uso do magnésio unliganded Preparar e purificar vesículas conforme descrito nas seções 1, 2.1 e 2.2. Prepare-se 1 mL de 50 mM MgCl2 solução tampão de pH 8.0 250 mM tris-HCl adicionando 250 µ l de tampão de pH 8.0 de tris-HCl 1 M e 50 µ l de 1m MgCl2 a 700 µ l de DI água. Vórtice para misturar bem. Para dar a concentração desejada de magnésio de 5mm, misture 0,9 mL de vesículas purificadas e 100 µ l de solução de magnésio e mexa rapidamente para minimizar a interrupção de vesículas pela exposição transitória das vesículas de alta concentração local de magnésio.Nota: Mistura rápida de solução de magnésio é essencial para a estabilidade de vesículas. Se o magnésio e vesículas não estão misturadas rapidamente pela utilização imediata do vortex, algumas vesículas serão expostas a altas concentrações de magnésio, resultando em resultados inconsistentes de amostra para amostra. Embora a amostra de vesículas sobre um tumbler pelo menos 30 min antes de repurification conforme descrito em 2.4 para verificar se há vazamento de conteúdo. Adicione a mesma concentração de magnésio, como no exemplo de vesículas para a fase móvel repurification. Uso do magnésio liganded Preparar e purificar vesículas conforme descrito nas seções 1, 2.1 e 2.2.Nota: Use ½ equivalentes KOH em vez de NaOH para deprotonar os ácidos graxos; Verificou-se que isso produz mais estáveis lipossomas em quelatos MgCl2 sistemas. Preparar a solução de citrato de potássio 2M e ajustar o pH para 8,0 com KOH. Premix MgCl2 e potássio Citrato na proporção especificada (ca. 1:4 para vesículas estáveis de ácido oleico) em tampão de pH 8.0 250 mM tris-HCl. Adicione solução de citrato de magnésio pré-misturados à amostra de vesículas, brevemente o vórtice.Nota: Sempre premix solução magnésio e ligante. Nunca exponha as vesículas para solução de magnésio unchelated sozinha. Deixe a amostra de vesículas em um tumbler pelo menos 30 min antes de repurification conforme descrito no ponto 2.4. Adicione a mesma concentração de magnésio e citrato, como no exemplo a vesícula para a fase móvel repurification. 4. não enzimáticos RNA cópia em vesículas Preparação de monodisperso RNA encapsulado vesículas Prepare um filme ácido oleico seco conforme descrito na seção 1.1. Prepare o tampão de reidratação vesículas com 50 µM fluorescente etiquetados RNA primer, modelo de RNA 150 µM e pH de 250 mM tris-HCl 8.0 contendo ½ KOH equivalente em relação ao ácido oleico. Adicionar 250 µ l de tampão de hidratação do filme lipídico e siga o passo 1.2.2 e 1.2.3 tornar vesículas com concentração total de lipídios de 0,15 M. A fim de fazer unilamellar pequena vesículas monodisperso, siga seção 1.3 para extrusão de vesículas. Purificação de adição e vesículas de citrato de magnésio Premix estoques de magnésio e citrato e misture isto com a amostra de vesículas com uma concentração final de lipídios de 0,1 M. Purifica a vesículas na coluna do Sepharose 4B tamanho exclusão, com pH de 250 mM tris-HCl 8.0, lipídios 0,1 M e dada magnésio e citrato como fase móvel. Colete frações de vesículas pela seguinte secção 2.3. Reação de extensão do primer Prepare solução estoque de 200 mM 2-MeImpG (5′-monofosfato de guanosina 2-methylimidazolide) com pH de 250 mM tris-HCl 8.0. (Nota: Siga anterior publicado protocolo10 para a síntese de 2-MeImpG.) Para iniciar a reação de extensão da primeira demão, a transferência de 150 µ l de solução-mãe de 2-MeImpG para 450 µ l da amostra vesículas para atingir uma concentração final de lipídios de 75 mM e 50 mM ativado monômero. Iniciar o cronômetro e manter a reação da amostra caindo o tempo todo. (Opcional) Para a alimentação de monômero fresco contínuo, transferência 300 µ l da solução de reação de uma câmara de um laboratório construído em lipossomas de pequeno volume dialyzer11 e colocar 300 µ l solução na outra câmara de alimentação. A solução de alimentação deve conter todos os ingredientes na mesma concentração como a solução de reação, excepto para substituir o RNA que contém vesículas com vesículas vazias. Cada rodada de diálise leva 1-24 h, dependendo do analito e membrana usado. Para estudos cinéticos, levar um 100 µ l alíquota em cada ponto de tempo e repurify a alíquota através de uma coluna de exclusão Sepharose 4B tamanho com pH de 250 mM tris-HCl 8.0 como fase móvel. Recolha as frações de vesículas em um tubo de eppendorf 1,5 mL. Pipetar Triton para as frações de vesículas para um final de cerca de 0,1% v/v. Adicionar 0,5 mL de álcool etílico frio ao tubo e incubar a-20 ° C durante pelo menos 2 h. Centrifugue todos as amostras em 16,1 × 1000 rcf (16,1 × g) por 10 min e, gentilmente, pipeta para fora dos líquidos. Lavar o RNA pelotas com 70% de etanol frio e centrifugar novamente por 5 min. descarte o líquido e coloque o tubo com pelotas de RNA em um bloco de calor de 80 ° C por 2 min evaporar o etanol residual. Dissolva as bolinhas em 50 µ l de 8 M ureia com amortecedor do carregamento do 1xTBE. Análise de página Prepare-se 20% gel PAGE pela mistura de 200 mL de UreaGel sistema concentrado, 25 mL de diluente, sistema de UreaGel 25 mL de tampão de 10xTBE, 80 µ l de TEMED e 250 mg de persulfato de amónio. Rapidamente, despeje a mistura de gel entre placas de gel preso (35 cm x 45 cm) e inserir o pente. Aguarde pelo menos 30 min até a completa polimerização. Montar a placa de gel sobre o carrinho de gel e preencher as caixas de gel com gel 1xTBE executando o tampão. Tire o pente e lavar os poços com seringa. Pre-funcione o gel com 60 W por 30 min. Aqueça as amostras no bloco de calor de 80 ° C por 2 min e carregar 5 µ l de cada amostra por bem. Ative a caixa de força de gel e defina gel executando com constantes watts a 60 W para 2,5 h. Desmontar a placa de gel do gel de carrinho, limpe o vidro e coloque a placa inteira em gel de scanner para iniciar a varredura de gel. Quantificar o gel com análise de 1D ImageQuant TL. Plotar o logaritmo natural da proporção da quantidade de primer, permanecendo em um ponto determinado momento ao montante inicial de primer vs tempo, apto para uma linha e calcular a taxa de reação pseudo-primeira ordem (Figura 2). 5. hammerhead RNA auto decote em vesículas Preparação e purificação de ribozima encapsulada em vesículas Preparar uma película fina de lipídios (OA: OGM = 9:1) como na secção 1.1 com componentes como no tabela 1.2. Nota: quente OGM pelo menos 60 ° C para derreter completo antes de usar. Prepare o buffer de reidratação vesículas com 5 µM de cada vertente de ribozima martelo e a 250 mM tris-HCl pH 8.0. Adicionar 250 µ l de tampão de hidratação do filme lipídico e siga a concentração de lipídios passos 1.2.2 e 1.2.3 tornar vesículas com 0,15 M total. A fim de fazer unilamellar pequena vesículas monodisperso, siga seção 1.3 para extrusão de vesículas. Purifica a vesículas em uma coluna de exclusão Sepharose 4B tamanho, com pH de 250 mM tris-HCl 8.0, 0,15 M misturado lipídios como fase móvel. Reação de autoclivagem do martelo ribozima Preparar a solução de magnésio e misturar com vesículas purificadas, conforme descrito na seção 3.1 para iniciar a reação autoclivagem. Para estudos cinéticos, levar 100 µ l da mistura em cada ponto de tempo e repurify diretamente essa alíquota através de uma coluna de exclusão Sepharose 4B tamanho com pH de 250 mM tris-HCl 8.0 como fase móvel. Colete a fração de vesículas. Análise de página Siga os passos 4.3.6 para 4.3.8 para preparar RNA carregando amostra. Coloque o gel de TBE-ureia comercialmente fundido 15% em gel de caixa e preencher a caixa de gel com gel 1xTBE executando o tampão. Aqueça as amostras no bloco de calor de 80 ° C por 1 min e carregar 5 µ l de cada amostra por bem. Funcione o gel com constante 200 V para cerca de 1 h. Digitalize o gel. Quantificar o gel com um software de análise, como TL ImageQuant 1D, para medir a extensão do decote, comparando a intensidade da restante banda de substrato RNA e RNA clivada fragmentam banda (Figura 3). 6. gigante ácido graxo vesículas para microscopia Preparação das vesículas gigante de ácido graxo Siga seção 1.1 e 1.3 tabela para preparar uma película fina de ácido oleico com 0,2 mol % de lipídio fluorescente etiquetado para melhor observação de membrana. Re-hidratar o filme lipídico com pH de tris-HCl de 250 mM de µ l 500 8.0 tornar os lipídios de 10 mM de amostra de vesículas no total. O buffer pode conter corantes fluorescentes ou moléculas de RNA se desejado. Deixe-se de vesículas amostra caindo durante a noite. Prepare 150 mL de tampão de diálise puro ácido graxo com 10mm lipídios totais misturando 470 µ l de ácido oleico e 150 mL de pH de 250 mM tris-HCl 8.0 contendo NaOH equivalente ½. EXTRUDE a amostra de vesículas através de uma membrana de policarbonato 10 µm para remover grandes agregados. Transferi a amostra de vesículas dentro de grandes poros diálise 1 µm, conforme descrito anteriormente. 12 Coloque a fita de diálise em um copo de 100 mL contendo 30 mL de tampão de diálise. Agite o copo suavemente em um agitador de mesa 80-100 RPM. Altere o buffer de diálise cada 30 min por 5 vezes remover corantes livre ou RNA e pequenas vesículas. Retire cuidadosamente a vesícula amostra o cassete de diálise com uma seringa e transfira para um tubo Eppendorf. Observação de microscopia Pipete 10 µ l de vesículas numa lâmina de microscópio limpa padrão e coloque uma lamela de vidro sobre a amostra. Sele a tampa de vidro com verniz transparente. Observe as vesículas com um 60 X dispersão de óleo ou objectivo semelhante pela microscopia confocal, usando a fonte de laser apropriado para a membrana fluorescente-etiquetadas, RNA ou corante encapsulado (Figura 4).