Vorbereitung, Reinigung und Anwendung von Fettsäure-haltigen Liposomen

(1) Vesikel Vorbereitung Herstellung von Dünnschichten Verwenden Sie Gas enge Spritzen, gewisse Lipide übertragen, wie in Tabelle 1.1 , in eine Glasflasche chloroform beschrieben. Die resultierende Lösung unter dem Strahl des Stickstoff oder Argon in der Dunstabzugshaube zu verdampfen. Vorbehaltlich der daraus resultierenden Dünnschicht Haus Vakuum für mindestens 2 h, Chloroform Rückstände zu entfernen. Die Lipid kann unter Vakuum über Nacht an dieser Stelle belassen werden. Rehydrierung von Vesikeln Bereiten Sie 10 mL 5 mM Calcein 250 mM Tris-HCl pH 8.0 Hydratation Puffer durch Auflösung 31 mg Calcein Pulver in 2,5 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0 Puffer und Hinzufügen von einem anderen 7,5 mL entionisiertem Wasser (DI vor). Pipette 250 µL über Hydratation Puffer in einem Leerrohr und 1,875 µL 10 M NaOH für eine endgültige 75 mM Basis (½ entspricht der gesamten Fettsäuren) hinzufügen. Übertragen Sie die Lösung auf die Dünnschicht des trockenen Lipid, Form Vesikel mit einer gesamten Lipidkonzentration von 0,15 M. High-Speed-Einsatz (> 3000 u/min) Vortexer Vortex die resultierende Mischung für 4-5 s. Lassen Sie die Lipid-Puffer-Mischung auf eine niedrige Drehzahl (ca. 30 u/min) rotierenden Shaker rehydrieren, mindestens über Nacht. Dimensionierung von Vesikeln (optional) Mit einer Pinzette, ein Filter Unterstützung gelten Sie für jede innere Oberfläche der Spritze Häfen des Extruders. Nass jeder Filter Unterstützung mit 250 mM Tris-HCl, pH 8. Mit einer Pinzette, anwenden einer Track-etched 100 nm Polycarbonat Membran eines Extruders O-Ringe und filter unterstützt. Kümmert sich um nicht reißen oder Punktion der Membran, schieben vorsichtig die Membran in der o-Ring um guten Kontakt zwischen den beiden Flächen zu machen. Montieren Sie den Extruder, kümmert sich nicht um die Membran zu verdrängen und Filter unterstützt. Füllen Sie eine Extruder-Spritze mit ca. 0,5 mL 250 mM Tris-HCl, pH 8. Legen Sie diese Spritze in eine Seite des Extruders. Legen Sie eine leere Spritze in die andere Seite des Extruders. Drücken Sie von Hand den Kolben der Spritze mit Puffer langsam (≤ 50 µL/s) und überprüfen Sie, ob Widerstand spürbar ist, darauf hinweist, dass die Track-etched Membran vorhanden und intakt ist. Es empfiehlt sich, diesen Schritt ohne eine Membran im Ort zu üben, um das erwartete Maß an Widerstand zu messen. Entfernen Sie und leeren Sie die zwei Spritzen. Es ist nicht notwendig, die beiden Spritzen in diesem Stadium zu reinigen, da sie Puffer mit identischer Zusammensetzung der Liposomen-Vorbereitung enthalten. Laden Sie die Liposomen-Vorbereitung in eines der zwei Spritzen. Montieren Sie den Extruder mit Spritze mit Vesikel Probe auf der linken Seite und die leere Spritze auf der rechten Seite. Drücken Sie von Hand den Kolben der Spritze mit Vesikel Probe sehr langsam (10-25 µL/s). Beobachten Sie aufmerksam die Spritze auf der rechten Seite des Extruders; klar Puffer gelangen Sie zunächst in der rechten Seite des Extruders (ca. 50 µL, Dies liegt an der inneren Totvolumen des Extruders), gefolgt von einer kleinen Wolke aus extrudierten Liposomen. Sofort stoppen Sie, an dieser Stelle drücken, ziehen Sie die Spritze auf der rechten Seite des Extruders und entsorgen Sie diese Lösung. Ersetzen Sie die Spritze auf der rechten Seite des Extruders und extrudieren Sie bis die linke Spritze leer ist. Kehren Sie die Ausrichtung des Extruders und wiederholen Sie Schritt 13. Fahren Sie für die gewünschte Anzahl von Zyklen (in der Regel 7, 9 oder 11); eine ungerade Zahl wird immer verwendet, um sicherzustellen, dass UN-extrudierte Liposomen nicht von der Spritze zunächst mit der Pre-Downsizing Liposomen Vorbereitung gesammelt werden. Vorsichtig verzichten Sie den Inhalt der rechten Spritze in ein Eppendorf-Röhrchen zu und legen Sie das Rohr auf eine niedrige Drehzahl (ca. 30 u/min) rotierenden Shaker für ca. 0,5 h. Mit Vesikel Reinigung, wie in Abschnitt 2 beschrieben vorgehen. Extrudierte Vesikel sollte innerhalb von 24 h oder wieder vor dem nächsten Mal Gebrauch extrudiert. (2) Vesikel Reinigung Vorbereitung der Vesikel Reinigung mobile phase Bereiten Sie 5 mL 250 mM Tris-HCl pH 8 Hydratation Puffer durch Zugabe von 1,25 mL 1 M Tris-HCl pH 8 Puffer, 3,75 mL VE-Wasser eine 15 ml Falcon-Röhrchen. Fügen Sie dann 37,5 µL 10 M NaOH (½ entspricht der Basis relativ unesterified Fettsäure) in den Puffer Hydratation. Pipette 235 µL reine Ölsäure direkt in der Falcon-Röhrchen, wodurch eine Vesikel-Lösung mit 0,15 M total Lipiden. High-Speed-Einsatz (> 3000 u/min) Vortexer Vortex die Mischung für 4-5 s, dann bei niedriger Geschwindigkeit rotierende Shaker für mindestens 2 h im Trockner. Die Lipid-Vorbereitung kann an dieser Stelle über Nacht auf den rotierenden Shaker gelassen werden. Filtern Sie die mobile Phase durch 0,22-μm-Spritze-Filter-Einheit vor Gebrauch, jede mögliche Aggregate zu entfernen. Reinigung von Vesikeln auf Sepharose Ca. 5 mL ethanolische Sepharose 4 b Gülle aus der Flasche mit einer Pipette entfernen. Anzuwenden Sie bei einer Chromatographiesäule Einweg-10 mL. Lassen Sie die Gülle zu begleichen und Ethanol durchströmten bis Ethanol oben auf das Harzbett nähert. Gelten 5 mL entionisiertem Wasser an die Spitze des Harzes und lassen Sie durchströmten Ethanol Rückstände abzuwaschen. Anwenden von 250 mM Tris-HCl, pH 8 in 1-2 mL Portionen an die Spitze des Harzes, Anwendung einen neuen Teil jedes Mal, wenn der Flüssigkeitsstand nähert sich der Spitze das Harzbett. Wiederholung für 3 – 5 Mal. Klemmen Sie die Spalte auf dem Stativ, dann verbinden Sie die Spitze der Säule mit Absperrhahn Stecker und Schläuche für die Fraktionssammler. Fügen Sie einen anderen Teil des Puffers zu spülen Sie den Schlauch, der Absperrhahn schließen, wenn der Flüssigkeitsstand in Spalte nähert sich der Spitze des Harzes. Auftragen Sie die extrudierten Vesikel aus Abschnitt 1 an die Spitze des Harzes mit einem 200 µL Pipette, kümmert sich um die Vesikel Vorbereitung so gleichmäßig wie möglich auf das Harz anwenden, ohne Berührung der Harz Bett oder Spalte Wand Öffnen Sie den Absperrhahn zu beginnen, den Fluss und sammeln Sie Brüche in einer 96-Well-Platte. Gelten Pustelbildungsphase Reinigung mobile an die Spitze des Harzbettes in 0,5-1 mL Portionen, da der Puffer kümmert sich nicht um das Harzbett verbraucht austrocknen lassen,. Sammeln Sie in fünf Tropfen Brüche, sammeln von mindestens 36 Brunnen (drei Reihen von einer 96-Well-Platte). Fluoreszenz-Charakterisierung der Reinigung Brüche Die 96-Well-Platte aus dem vorherigen Abschnitt zu nehmen und auf einem Teller-Reader zu lesen (λex= 485 nm, λEm= 515 nm). Darstellen Sie die Ergebnisdaten Fluoreszenz als Fluoreszenz vs. Bruchteil Zahl. Vesikel eluieren zuerst, gefolgt von den unvergossene Bruch (Abbildung 1). Repurification von Vesikeln, Vesikel Leckage zu überwachen Wiederholen Sie die Aufreinigung und Charakterisierung in Abschnitte 2.2 und 2.3. Vesikel, die ihren Inhalt bewahrt haben zeigen keine Spitze unvergossene gelösten (oder einer sehr kleinen von ca. 5-10 % der Intensität des Vesikels Peak). 3. Nutzung der Vesikel in Anwesenheit von Magnesium Verwendung von Unliganded magnesium Bereiten Sie und reinigen Sie Vesikeln zu, wie in den Abschnitten 1, 2.1 und 2.2 beschrieben. Bereiten Sie 1 mL 50 mM MgCl2 Lösung in 250 mM Tris-HCl pH 8.0 Puffer indem 250 µL 1 M Tris-HCl pH 8.0 Puffer und 50 µL 1 M MgCl2 an 700 µL DI Wasser. Wirbel um gut zu mischen. Um die gewünschte Magnesiumkonzentration von 5 mM zu geben, 0,9 mL gereinigtes Vesikel und 100 µL der Magnesium-Lösung verrühren Sie und schnell um die Vesikel Störungen durch vorübergehende Aussetzung von Vesikeln zu hohe lokale Konzentration von Magnesium zu minimieren.Hinweis: Schnelle Vermischung von Magnesium Lösung ist entscheidend für die Stabilität der Vesikel. Wenn Magnesium und Vesikel nicht schnell durch sofortige vortexen gemischt, werden höhere Konzentrationen von Magnesium, was zu inkonsistenten Ergebnissen von Probe zu Probe einige Vesikel ausgesetzt werden. Lassen Sie die Vesikel Probe auf ein Becher für mindestens 30 min vor Repurification wie unter 2.4 Inhalt Dichtheit zu überprüfen. Die Repurification mobile Phase die gleiche Konzentration an Magnesium wie Vesikel Beispiel hinzufügen. Verwendung von liganded magnesium Bereiten Sie und reinigen Sie Vesikeln zu, wie in den Abschnitten 1, 2.1 und 2.2 beschrieben.Hinweis: Verwenden Sie ½ gleichwertige KOH statt NaOH zu Deprotonate Fettsäuren; Es wurde festgestellt, dass diese stabilere Liposomen in Chelat MgCl2 Systeme produziert. Vorbereitung 2M Kalium-Citrat-Lösung und Anpassung pH bis 8.0 mit KOH. Premix MgCl2 und Kalium Citrat im angegebenen Verhältnis (ca. 1:4 für stabile Ölsäure Vesikel) in 250 mM Tris-HCl pH 8.0 Puffer. Die Vesikel Probe, kurz Wirbel vorgemischten Magnesium-Citrat-Lösung hinzufügen.Hinweis: Immer premix Magnesium und Liganden Lösung. Setzen Sie niemals Vesikel, unchelated Magnesium Lösung allein. Lassen Sie die Vesikel Probe auf ein Becher für mindestens 30 Minuten vor Repurification, wie in 2.4 beschrieben. Die Repurification mobile Phase die gleiche Konzentration an Magnesium und Citrat wie die Vesikel-Beispiel hinzufügen. (4) nicht-enzymatische RNA in Vesikeln kopieren Vorbereitung der Monodisperse RNA gekapselt Vesikel Bereiten Sie einen trockenen Ölsäure-Film, wie in Abschnitt 1.1 beschrieben. Bereiten Sie Vesikel Rehydratation Puffer mit 50 µM Leuchtstoff beschrifteten RNA-Primer, 150 µM RNA-Vorlage und 250 mM Tris-HCl pH 8.0 mit ½ gleichwertige KOH relativ Ölsäure. Lipid-Film 250 µL Rehydratation Puffer hinzu, und folgen Sie den Schritten 1.2.2 und 1.2.3 Vesikel mit insgesamt 0,15 M Lipidkonzentration zu machen. Um kleine Unilamellar Monodisperse Bläschen bilden, folgen Sie Abschnitt 1.3 für die Vesikel Extrusion. Magnesium-Citrat Zusatz und telson Reinigung Premix Magnesium und Citrat Bestände und mischen Sie dies mit der Vesikel Probe zu einer endgültigen Lipidkonzentration von 0,1 M. Bläschen auf Sepharose 4 b Spalte “Größe Ausgrenzung”, mit 250 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,1 M Lipide und Magnesium und Citrat als mobile Phase zu reinigen. Sammeln Sie Vesikel Brüche durch folgenden Abschnitt 2.3. Primer-Extension-Reaktion 200 mM 2-MeImpG (Guanosin 5′-Monophosphate 2-Methylimidazolide)-Stammlösung mit 250 mM Tris-HCl pH 8.0 vorbereiten. (Anmerkung: folgen früheren veröffentlichten Protokoll10 für die Synthese von 2-MeImpG.) Primer-Extension-Reaktion zu initiieren, übertragen Sie 150 µL der Stammlösung 2-MeImpG auf 450 µL Vesikel Probe, eine Endkonzentration von Lipid 75 mM und 50 mM aktiviert Monomer zu erreichen. Start des Timers und halten die Reaktion probieren Sie taumeln aller Zeiten. (Optional) Übertragen Sie für kontinuierliche frische Monomer Fütterung 300 µL der Reaktionslösung zu einer Kammer von einem Labor konstruiert kleinvolumigen Liposomen Dialysator11 und Put 300 µL Fütterung Lösung in die andere Kammer. Die Fütterung Lösung sollte alle Zutaten in der gleichen Konzentration wie in der Reaktionslösung, mit Ausnahme der RNA mit Vesikeln mit leeren Vesikeln zu ersetzen. Jeder Runde der Dialyse dauert 1-24 h, je nach Analyt und Membran verwendet. Für kinetische Untersuchungen nehmen 100 µL aliquoten zu jedem Zeitpunkt, und repurify den Aliquoten durch eine Sepharose 4 b Größe Ausgrenzung Spalte mit 250 mM Tris-HCl pH 8.0 als mobile Phase. Sammeln Sie die Vesikel Fraktionen in einem 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen. Pipette Triton Vesikel Fraktionen auf eine endgültige rund 0,1 % V/V. Das Rohr 0,5 mL kaltem Ethanol hinzu und Inkubation bei-20 ° C für mindestens 2 h. Zentrifugieren Sie die Proben bei 16,1 × 1000 Rcf (16,1 × g) für 10 min und sanft Pipette, die Flüssigkeiten. Waschen die RNA mit kaltem Ethanol 70 % und Zentrifuge pellets wieder für 5 min. verwerfen Sie die Flüssigkeit und habe das Rohr mit RNA-Pellets auf eine 80 ° C Hitze Block für 2 min residual Äthanol verdunsten. Lösen Sie die Pellets in 50 µL von 8 M Harnstoff mit 1xTBE laden Puffer. Seitenanalyse Bereiten Sie 20 % Seite Gel durch das Mischen von 200 mL des UreaGel Systems-Konzentrat, 25 mL des UreaGel Systems Verdünnungsmittel, 25 mL 10xTBE Puffer, 80 µL TEMED und 250 mg Ammonium bleichen. Schnell die Gel Mischung zwischen eingespannten Gel Platten (35 cm × 45 cm) und legen Sie den Kamm. Warten Sie mindestens 30 min bis vollständige Polymerisation. Montieren Sie die Gelplatte auf dem Gel-Ständer und füllen Sie die Gel-Boxen mit 1xTBE Gel Puffer ausgeführt. Nehmen Sie den Kamm und spülen Sie die Brunnen mit Spritze. Pre laufen Sie Gel mit 60 W für 30 min. Die Proben auf 80 ° C Hitze Block für 2 min erwärmen und 5 µL jeder Probe pro Bohrloch zu laden. Gel-Power-Box schalten Sie und stellen Sie laufen mit konstanter Watt bei 60 W für 2,5 h Gel. Zerlegen der Gelplatte vom Gel Stand, wischen Sie das Glas und legen Sie die ganze Platte in Gel-Scanner das Gel Scannen beginnen. Das Gel mit ImageQuant TL 1D Analyse zu quantifizieren. Plot der natürlichen Logarithmus des Verhältnisses der Höhe der Grundierung zu einem bestimmten Zeitpunkt auf den ursprünglichen Betrag des Primers vs. Zeit übrig, in eine Zeile passen und berechnen die Pseudo-erste Ordnung Reaktionsgeschwindigkeit (Abbildung 2). 5. Hammerhead RNA selbst Spaltung in Vesikeln Vorbereitung und Reinigung von Ribozym gekapselt in Vesikeln Bereiten Sie eine Lipid-Dünnschicht (OA: GVO = 9:1) wie in Abschnitt 1.1 mit Komponenten wie in Tabelle 1.2. Hinweis: warme GVO auf mindestens 60 ° C zum vollständigen schmelzen vor der Verwendung. Vesikel Rehydratation Puffer mit 5 µM jedes Hammerhead-Ribozym-Strang und 250 mM Tris-HCl pH 8.0 vorbereiten. Die Lipid-Film 250 µL Rehydratation Puffer hinzu, und befolgen Sie Schritte 1.2.2 und 1.2.3 zu Vesikeln mit 0,15 M total Lipidkonzentration. Um kleine Unilamellar Monodisperse Bläschen bilden, folgen Sie Abschnitt 1.3 für die Vesikel Extrusion. Bläschen auf einer Sepharose 4 b Größe Ausgrenzung Spalte mit 250 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,15 M gemischt Lipide als mobile Phase zu reinigen. Hammerhai Ribozyme selbst-Spaltung Reaktion Magnesium-Lösung zubereiten und mischen mit gereinigtem Vesikel, wie beschrieben in Abschnitt 3.1, die selbst-Spaltung-Reaktion zu initiieren. Für kinetische Untersuchungen 100 µL des Gemisches zu jedem Zeitpunkt zu nehmen und direkt repurify dieser aliquoten durch eine Sepharose 4 b Größe Ausgrenzung Spalte mit 250 mM Tris-HCl pH 8.0 als mobile Phase. Die Vesikel Bruchteil zu sammeln. Seitenanalyse Führen Sie die Schritte 4.3.6 zu 4.3.8 um RNA laden Probe vorzubereiten. Kommerziell gegossen 15 % FSME-Urea Gel in Gel-Box und füllen Sie die Gel-Box mit 1xTBE Gel laufen Puffer zu. Die Proben auf 80 ° C Hitze Block für 1 min erwärmen und 5 µL jeder Probe pro Bohrloch zu laden. Führen Sie das Gel mit konstant 200 V für ca. 1 h. Scannen Sie das Gel. Das Gel mit einer Analysesoftware, wie ImageQuant TL 1D zu quantifizieren, um das Ausmaß der Spaltung zu messen, durch den Vergleich der Intensität der verbleibende Substrat RNA Band und gespalten RNA fragment Band (Abbildung 3). (6) riesige Fettsäure Vesikel für die Mikroskopie Vorbereitung von riesigen Fettsäure Vesikeln Folgen Sie Abschnitt 1.1 und Tabelle 1.3 vorzubereiten einem Ölsäure Dünnschicht mit 0,2 Mol% Eindringmittel beschrifteten Lipid für bessere Membran Beobachtung. Lipid-Film mit 500 µL 250 mM Tris-HCl pH 8.0 die Vesikel Probe 10 mM Lipide in insgesamt zu rehydrieren. Der Puffer kann Fluoreszenzfarbstoffen oder RNA-Moleküle enthalten, falls gewünscht. Verlassen Sie Vesikel Probe taumeln über Nacht. Bereiten Sie 150 mL reinen Fettsäure-Dialyse-Puffer mit 10 mM insgesamt Lipide durch Mischen von 470 µL Ölsäure und 150 mL 250 mM Tris-HCl pH 8.0 mit ½ gleichwertige NaOH. Extrudieren Sie die Vesikel Probe durch eine 10 µm Polycarbonat Membran, große Aggregaten zu entfernen. Übertragen Sie die Vesikel Probe in 1 µm große Pore Dialyse Kassette, wie zuvor beschrieben. 12 Legen Sie die Dialyse-Kassette in einen 100-mL-Becherglas mit 30 mL-Dialyse-Puffer. Schütteln Sie den Becher sanft auf eine Tischplatte Shaker bei 80-100 u/min. Ändern des Dialyse-Puffers alle 30 min. 5 Mal kostenlos Farbstoffe oder RNA und kleine Bläschen zu entfernen. Entfernen Sie vorsichtig die Vesikel-Probe aus der Dialyse-Kassette mit einer Spritze und Transfer in ein Eppendorf-Röhrchen. Mikroskopie-Beobachtung Pipette 10 µL von Vesikeln auf einen sauberen standard Objektträger und Deckglas ein Glas über die Probe legen. Versiegeln Sie Deckglas mit transparenten Nagellack. Beobachten Sie die Vesikel mit einem 60 X Öl-Dispersion oder ähnlicher Zielsetzung durch konfokale Mikroskopie mit der geeignete Laserquelle für Gewebekulturen beschriftet Membran, RNA oder gekapselte Farbstoff (Abbildung 4).