Preparación, purificación y uso de liposomas que contienen ácidos grasos

1. preparación vesícula Preparación de películas delgadas Usar jeringas tight gas para transferir cierta cantidad de lípidos como se describe en la tabla 1.1 a cloroformo en un frasco de vidrio. Evaporar la solución resultante con un chorro de nitrógeno o argón en la campana. Exponga la película fina resultante a vacío de la casa por al menos 2 h para eliminar cualquier residuo de cloroformo. Los lípidos pueden dejarse bajo vacío durante la noche en este punto. Rehidratación de las vesículas Preparar 10 mL de tampón de hidratación 5 mM calceína 250 mM tris-HCl pH 8.0 disolver 31 mg de polvo de calceína en 2,5 mL de tampón de 1 M tris-HCl pH 8.0 y añadiendo otro 7,5 mL de agua desionizada (DI). Pipetear 250 μl de sobre el buffer de la hidratación en un tubo vacío y agregar 1.875 μl de 10 M NaOH para un final base de 75 mM (equivalente ½ del total de ácidos grasos). Transferir la solución a la película delgada de lípidos seco a vesículas de forma con una concentración total de lípidos de 0,15 M. Uso de alta velocidad (> 3000 rpm) Vortex a vórtice la mezcla resultante para 4-5 s. Dejar la mezcla de lípidos-buffer en un agitador rotatorio de baja velocidad (aprox. 30 rpm) a rehidratar, por lo menos durante la noche. Tamaño de las vesículas (opcionales) Con unas pinzas, aplicar un soporte de filtro en toda la superficie interior de los puertos de la jeringa de la extrusora. Moje cada soporte del filtro con 250 mM tris-HCl, pH 8. Con unas pinzas, una pista grabada 100 nm policarbonato membrana se aplica a uno de la extrusora O-rings y soportes del filtro. Teniendo cuidado de no rasgar o perforar la membrana, empuje suavemente la membrana en la junta tórica para hacer buen contacto entre las dos superficies. Montar el estirador, teniendo cuidado de no para desplazar los soportes de membrana y filtro. Llene una jeringa de extrusora con aprox. 0.5 mL de 250 mM tris-HCl, pH 8. Inserte esta jeringa en un lado de la extrusora. Inserte una jeringuilla vacía en el otro lado de la extrusora. A mano, empuje el émbolo de la jeringa que contiene tampón lentamente (≤ 50 μl/s) y comprobar que se siente resistencia, indicando que la membrana pista-graba al agua fuerte está intacta y el lugar. Es útil para la práctica de este paso sin una membrana en el lugar con el fin de medir el nivel esperado de la resistencia. Retire y vacíe las dos jeringas. No es necesario limpiar las dos jeringas en esta etapa ya que contienen buffer de idéntica composición a la preparación de liposomas. Cargar la preparación de liposomas en una de las dos jeringas. Vuelva a la extrusora con la jeringa que contiene la muestra de la vesícula en el lado izquierdo y la jeringa vacía a la derecha. A mano, empuje el émbolo de la jeringa que contiene la muestra vesícula muy lentamente (10-25 μl/s). Observar cuidadosamente la jeringa en el lado derecho de la extrusora; claro búfer inicialmente entrará en el lado derecho de la extrusora (aprox. 50 μL, esto es debido al volumen muerto de la extrusora), seguido por un pequeño penacho de liposomas extruidos. Inmediatamente deja de empujar en este punto, retire la jeringa del lado derecho de la extrusora y descartar esta solución. Vuelva a colocar la jeringa en el lado derecho de la extrusora y saca hasta que la jeringa izquierda está vacía. Cambiar la orientación de la extrusora y repita el paso 13. Continuar por el número de ciclos (normalmente 7, 9 u 11); se utiliza siempre un número impar para liposomas sin extrusión no se recogen de la jeringa al principio que contiene la preparación de liposomas de reducción previa. Dispensar el contenido de la jeringa derecha en un tubo Eppendorf y coloque el tubo en un agitador giratorio de velocidad baja (ca. 30 rpm) de alrededor de 0,5 h suavemente. Proceder a la depuración de la vesícula, como se describe en la sección 2. Vesículas extruidas deben utilizar dentro de 24 h o volver a sacado antes de usarlo de vez. 2. purificación de vesícula Preparación de fase móvil de purificación de vesícula Preparar 5 mL de tampón de 250 mM tris-HCl pH 8 hidratación añadir 1,25 mL de tampón de 1 M tris-HCl pH 8, 3,75 mL de agua desionizada a un tubo Falcon de 15 mL. Luego añadir 37.5 μl de NaOH M 10 (equivalente a ½ de base en relación con ácidos grasos unesterified) en el búfer de hidratación. Pipetee 235 μl de ácido oleico puro directamente en el tubo del halcón dando por resultado una solución de vesícula con 0,15 M de lípidos totales. Uso de alta velocidad (> 3000 rpm) Vortex a vórtice la mezcla para 4-5 s, luego seque una coctelera durante al menos 2 h de rotación a baja velocidad. La preparación lipídica puede dejarse toda la noche en el agitador rotativo en este punto. Filtrar la fase móvil a través de la unidad de filtro μm 0.22 de la jeringa antes de su uso para eliminar cualquier potencial agregados. Purificación de vesículas en sefarosa Eliminar aprox. 5 mL de etanol Sepharose 4B mezcla de la botella con una pipeta. Aplicar esto a una columna de cromatografía desechables 10 mL. Permiten la mezcla a colocar y paso etanol hasta parte superior de la capa de resina acerca a etanol. Aplicar 5 mL de agua desionizada a la parte superior de la resina y dejar fluir-por lavar residuos de etanol. Aplicar 250 mM tris-HCl, pH 8 en porciones de 1-2 mL para la parte superior de la resina, aplicar una porción nuevo cada vez que el nivel del líquido acerca a la parte superior de la capa de resina. Repita para el 3 – 5 veces. La columna de la abrazadera en el soporte de la retorta, luego conecte la punta de la columna con conector de llave de paso y tubo con el colector de la fracción. Agregar otra porción de buffer flush el tubo, cierre la llave de paso cuando el nivel del líquido en la columna acerca a la parte superior de la resina. Aplicar las vesículas extrusionadas de sección 1 a la parte superior de la resina utilizando una pipeta de 200 μL, teniendo cuidado de aplicar la preparación de la vesícula tan uniformemente como sea posible a la resina sin tocar la pared de la cama o columna de resina. Abra la llave de paso para iniciar el flujo y comenzar a recoger fracciones en una placa de 96 pocillos. Fase móvil de purificación de vesícula se aplican a la parte superior de la capa de resina en 0.5-1 mL porciones como el búfer de agota, teniendo cuidado de no permitir que la capa de la resina se seque. Recoger en la caída de cinco fracciones, que recoge al menos 36 pozos (tres filas de una placa de 96 pocillos). Caracterización de la fluorescencia de las fracciones de purificación Tomar la placa de 96 pocillos de la sección anterior y leerlo en un lector de placas (λex= 485 nm, λem= 515 nm). Parcela los datos resultantes de la fluorescencia como fluorescencia vs número de fracción. Las vesículas elución primero, seguido por la fracción unencapsulated (figura 1). Repurification de vesículas para monitorear la salida de la vesícula Repita los pasos de purificación y caracterización en las secciones 2.2 y 2.3. Las vesículas que han conservado su contenido no presenta ningún pico de unencapsulated soluto (o uno muy pequeño de aprox. 5-10% de la intensidad del pico de vesícula). 3. uso de vesículas en presencia de magnesio Uso de magnesio unliganded Preparar y purificar las vesículas como se describe en los puntos 1, 2.1 y 2.2. Preparar 1 mL de 50 mM MgCl2 solución de tampón de 250 mM tris-HCl pH 8.0 mediante la adición de 250 μl de tampón de 1 M tris-HCl pH 8.0 y 50 μl de MgCl de 1 M2 a 700 μl de DI agua. Vortex para mezclar bien. Para dar la concentración deseada de magnesio de 5 mM, 0.9 mL de vesículas purificadas y 100 μl de solución de magnesio de la mezcla y revuelva rápidamente para minimizar las interrupciones de la vesícula por la exposición transitoria de las vesículas a alta concentración local de magnesio.Nota: Mezcla rápida de solución de magnesio es fundamental para la estabilidad de la vesícula. Si magnesio y vesículas no se mezclan rápidamente con un vórtex inmediato, algunas vesículas estarán expuestos a altas concentraciones de magnesio, dando lugar a resultados inconsistentes de muestra a muestra. Dejar la muestra de la vesícula en un vaso por lo menos 30 minutos antes de repurification como se describe en el 2.4 para comprobar fugas del contenido. Añadir la misma concentración de magnesio en la muestra de la vesícula a la fase móvil repurification. Uso de magnesio liganded Preparar y purificar las vesículas como se describe en los puntos 1, 2.1 y 2.2.Nota: Utilice ½ equivalentes KOH en lugar de NaOH a deprotonate los ácidos grasos; se ha encontrado que esto produce más estables liposomas en quelato MgCl2 sistemas. Preparar solución de citrato de potasio de 2 M y ajuste el pH a 8.0 con KOH. Mezcla preparada de antemano MgCl2 y potasio citrato en la proporción especificada (aprox. 1:4 para ácido oleico estable vesículas) en tampón de 250 mM tris-HCl pH 8.0. Añadir solución de citrato de magnesio premezclado a la muestra de la vesícula, brevemente vortex.Nota: Siempre mezcle la solución de magnesio y ligando. No exponga nunca las vesículas a la solución de unchelated de magnesio solo. Dejar la muestra de la vesícula en un vaso por lo menos 30 minutos antes de repurification como se describe en 2.4. Añadir la misma concentración de magnesio y citrato como en el ejemplo de vesícula a la fase móvil repurification. 4. no-enzimático ARN copia en vesículas Preparación de monodispersa RNA encapsulado vesículas Preparar una película seca ácido oleico como se describe en el punto 1.1. Preparar el tampón de rehidratación de vesícula con cebador de RNA etiquetado fluorescente 50 μm, plantilla de RNA de 150 μm y 250 mM tris-HCl pH 8,0 conteniendo KOH ½ equivalente en relación con el ácido oleico. Añadir 250 μl de tampón de rehidratación a la película lipídica y siga el paso 1.2.2 y 1.2.3 hacer vesículas con concentración total de lípidos de 0,15 M. Para hacer unilaminar pequeña vesículas monodispersa, sigue sección 1.3 para la protuberancia de la vesícula. Purificación de adición y de la vesícula de citrato de magnesio Mezcla preparada de antemano las acciones de magnesio y citrato y luego mezcle con la muestra de la vesícula a una concentración final del lípido de 0.1 M. Purificar las vesículas en sefarosa 4B tamaño exclusión columna con 250 mM tris-HCl pH 8.0, lípidos de 0,1 M y magnesio y citrato como fase móvil. Recoger fracciones de vesícula por la siguiente sección 2.3. Reacción de extensión de la cartilla Prepare 200 mM 2-MeImpG (2-methylimidazolide de la 5′-monofosfato de guanosina) solución con 250 mM tris-HCl pH 8.0. (Nota: siga anterior publicado protocolo10 para síntesis de 2-MeImpG.) Para iniciar la reacción de extensión de la cartilla, transferencia 150 μL de solución stock 2-MeImpG a 450 μl de muestra de vesículas para alcanzar una concentración final de lípidos 75 mM y 50 mM activado monómero. Inicio el temporizador y la reacción de la muestra cayendo todo el tiempo. (Opcional) Para la alimentación continua monómero fresco, transferir 300 μL de solución de reacción a una cámara de un laboratorio construido liposomas de pequeño volumen dialyzer11 y poner 300 μL solución en la otra cámara de alimentación. La solución de alimentación debe contener todos los ingredientes en la misma concentración como en la solución de reacción, salvo sustitución de RNA que contienen vesículas con vesículas vacías. Cada ronda de diálisis toma 1-24 h, dependiendo del analito y de membrana utilizado. Para estudios cinéticos, tomar 100 μl alícuota en cada momento y repurify la alícuota a través de una columna de exclusión de tamaño de Sepharose 4B con 250 mM tris-HCl pH 8.0 como fase móvil. Recoger las fracciones de la vesícula en un tubo eppendorf de 1,5 mL. Pipetee Triton a las fracciones de vesícula a un final alrededor del 0.1% v/v. Añadir 0,5 mL de etanol frío al tubo e incubar a-20 ° C durante al menos 2 h. Centrifugar todas las muestras en 16.1 × 1000 rcf (16,1 x g) por 10 minutos y suavemente la pipeta hacia fuera los líquidos. Lavado del RNA de las pelotillas con etanol al 70% frío y centrifugar nuevamente por 5 min elimine el líquido y poner el tubo con el pellet de RNA en un bloque de calor de 80 ° C por 2 min evaporar el etanol residual. Disolver los pellets en 50 μl de 8 M Urea con tampón de carga 1xTBE. Análisis de la página Preparar 20% gel página al mezclar 200 mL de UreaGel concentrado de 25 mL de diluyente, del sistema de UreaGel, 25 mL de tampón 10xTBE, 80 μl de TEMED y 250 mg de persulfato de amonio. Rápidamente verter la mezcla de gel entre las placas con gel (35 cm x 45 cm) e inserte el peine. Espere al menos 30 minutos hasta la polimerización completa. Montar la placa de gel en el soporte del gel y llenan las cajas de gel 1xTBE gel buffer de corriente. Retire el peine y lavar los pocillos con jeringa. Funcionamiento previo el gel con 60 W durante 30 minutos. Calentar las muestras en bloque de calor de 80 ° C por 2 min y 5 μl de cada muestra por pozo de carga. Active gel caja de alimentación y ajuste el gel con vatios constante a 2,5 h de 60 W. Desmontar la placa del gel del gel de soporte, limpie el cristal y la placa entera en gel escáner para iniciar la exploración de gel. Cuantificar el gel con análisis de 1D ImageQuant TL. Trazar el logaritmo natural del cociente de la cantidad de la cartilla en un momento dado a la cantidad inicial de la cartilla vs tiempo, ajuste a una línea y calcular la velocidad de reacción orden pseudo-primer (figura 2). 5. martillo uno mismo ARN escote en vesículas Preparación y purificación de ribozyme encapsulado en vesículas Preparar una película delgada de lípidos (OA: OMG = 9:1) como en la sección 1.1 con componentes como en tabla 1.2. Nota: OMG caliente a menos de 60 ° C para derretir completo antes de usar. Preparar el tampón de rehidratación de vesícula con 5 μm de cada filamento de ribozyme del hammerhead y 250 mM tris-HCl pH 8.0. Añadir 250 μl de tampón de rehidratación a la película lipídica y seguir la concentración de lípidos pasos 1.2.2 y 1.2.3 hacer vesículas con 0.15 M total. Para hacer unilaminar pequeña vesículas monodispersa, sigue sección 1.3 para la protuberancia de la vesícula. Purificar las vesículas en una columna de exclusión de tamaño de Sepharose 4B, con 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0.15 M mezclada lípidos como fase móvil. Reacción de Hammerhead ribozyme self-escote Preparar solución de magnesio y mezclar con las vesículas purificadas como se describe en la sección 3.1 para iniciar la reacción de uno mismo-escote. Para estudios cinéticos, tomar 100 μl de la mezcla en cada momento y directamente repurify esta alícuota a través de una columna de exclusión de tamaño de Sepharose 4B con 250 mM tris-HCl pH 8.0 como fase móvil. Recoger la fracción de la vesícula. Análisis de la página Siga los pasos 4.3.6 a 4.3.8 para preparar carga muestra de RNA. Coloque gel de TBE Urea 15% comercialmente casted en gel caja y llene la caja de gel con gel de 1xTBE buffer de corriente. Calentar las muestras en bloque de calor de 80 ° C por 1 min y 5 μl de cada muestra por pozo de carga. Correr el gel con constante de 200 V durante alrededor de 1 hora. El gel de la exploración. Cuantificar el gel con un software de análisis, como ImageQuant TL D 1, para medir el grado de hendidura comparando la intensidad de la restante banda de RNA substrato y exfoliado RNA fragmento banda (figura 3). 6. las vesículas de ácidos grasos gigante para microscopía Preparación de las vesículas de ácidos grasos gigante Seguir sección 1.1 y 1.3 tabla para preparar una película delgada de ácido oleico con 0,2 mol % de lípido marcado fluorescente para mejor observación de la membrana. Rehidratar la película lipídica con 500 μl 250 mM tris-HCl pH 8.0 para hacer los lípidos de vesícula muestra 10 mM en total. El buffer puede contener colorantes fluorescentes o moléculas de ARN si se desea. Deje la vesícula muestra cayendo durante la noche. Para preparar 150 mL de buffer de diálisis puro ácido graso con 10 mM lípidos totales 470 μl de ácido oleico y 150 mL de 250 mM tris-HCl pH 8,0 con NaOH equivalente ½ de mezcla. Sacar la muestra de la vesícula a través de una membrana de policarbonato μm 10 para eliminar grandes agregados. Transferir la muestra de la vesícula en cassettes de diálisis de poro grande de 1 μm, como se describió anteriormente. 12 Coloque el cartucho de diálisis en un vaso de precipitados de 100 mL que contenga 30 mL de tampón de diálisis. Agitar el vaso suavemente en una coctelera de mesa a 80-100 rpm. Cambiar el buffer de diálisis cada 30 minutos por 5 veces eliminar tintes gratis o RNA y pequeñas vesículas. Cuidadosamente retire la muestra de la vesícula de los cassettes de diálisis con una jeringa y una transferencia a un tubo Eppendorf. Observación de la microscopia Pipetear 10 μl de vesículas sobre un portaobjetos limpio estándar y coloque un cubreobjetos de vidrio sobre la muestra. Sello cubierta vidrio con esmalte de uñas transparente. Observar las vesículas con un 60 X dispersión de aceite o similar objetivo mediante microscopía confocal utilizando la fuente láser apropiada para membrana marcada con fluorescencia, RNA o tinte encapsulado (figura 4).