Sentetik polimerler karakterizasyonu kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) numune hazırlama, spektral toplama ve veri analizi getirilmesi de dahil olmak üzere anlatılan uçuş matris yardımlı Lazer Desorpsiyon iyonlaşma süresi için bir protokol.
Sentetik homopolymers karakterizasyonu istihdam edilebilir birçok teknik vardır, ancak az son grup analiz için bilgi matris yardımlı Lazer Desorpsiyon iyonlaşma zaman uçuş kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) olarak yararlı sağlar. Bu öğretici için numune hazırlama, spektral satın alma, optimizasyon yöntemleri gösterir ve veri analizi numune hazırlama sırasında MALDI-TOF Bayan kritik parametreleri kullanarak sentetik polimerlerin matrix seçime dahil, bir uygun cationization tuz ve matris, katyon ve analit göreli orantılarını ayarlama tanımlaması. Modu gibi edinme parametreleri (doğrusal veya reflektör), polarizasyon (pozitif veya negatif), ivme voltaj ve gecikme süresi, Ayrıca önemli vardır. Kimya sentez polimer ve örnek hazırlama koşulları ve veri toplama parametrelerini optimize etmek için ilgili hakkında bazı bilgilere göz önüne alındığında, spectra benzersiz etkinleştirmek için yeterli çözünürlük ve kitle doğruluk ile alınmalıdır çoğu homopolymers (10.000 aşağıda kütlesi) tekrar birimi ek olarak son grupları belirlenmesi kütle ve genel moleküler ağırlık dağılımı. Son grup belirlenmesi sadece dar dispersity ile homopolymers için mümkün olsa polimerler, sınırlı bir kümesini esas gösterdi rağmen bu genel teknikleri sentetik polimerlerin toplu dağıtımları, belirlemek için daha geniş bir aralığı için geçerlidir.
Yaşam gelişmeler ile polimerizasyonu, hassas polimerler kantitatif functionalized son gruplarla tekniklerdir giderek kullanılabilir1. Azid alkin ve thiolene tıklayın kimyaları eşzamanlı gelişimi oluştururlar hibrid malzemeler2,3,4 bir dizi erişim sağlayan diğer moieties için neredeyse nicel kaplin sağladı . Ancak, kesin analitik teknikler başlangıç malzeme ve ürünlerin bu polimer konjugasyon reaksiyonları karakterize etmek için gereklidir. Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma uçuş kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) bir tek fiyat istemek durumunda en az ile polimer iyonları oluşturabilir çünkü polimerler karakterize bir değerli yumuşak iyonlaşma analitik yöntem zamanı parçalanma5,6. Çünkü bu kitle spectra ile kararlılık-in bireysel n-mers polimer toplu dağıtım içinde sağlayabilir MALDI-TOF MS polimer karakterizasyonu diğer geleneksel yöntemlerle üzerinde büyük avantajları vardır. Sonuç olarak, bu tür kitle spectra ortalama molekül ağırlığı hakkında kesin bilgi, birim kütle ve hangi sırayla zincir transfer8 gibi rakip polimerizasyon mekanizmaları aydınlatmak molekül ağırlığı dispersity7, tekrar . Ancak, özellikle son grup değişiklikler10,11 onaylamak için kullanılan polimer uç grupları9,10hakkında bilgi sağlayan güçlü ve diğer MALDI-TOF MS dönüşümleri12 gibi polimer cyclizations11,13. Aynı derecede önemli, analitin (alt-mikrogram) nispeten az miktarda kütle spektrometrik analiz tek iz miktarda malzeme kullanılabilir olduğunda bu tekniği karakterizasyonu için yararlı yapar gerekli.
Polimerler MALDI-TOF MS analizini dört ayrı adım ayrılabilir: örnek hazırlama, aleti kalibrasyon, spektral toplama ve veri analizi. Örnek hazırlıktır üretmek için en önemli adım MALDI-TOF Kütle spectra en iyi duruma getirilmiş ve örnek enstrüman14,15tanıtıldı önce oluşur. Benzer çözünürlük parametreleri ile uygun bir matris seçimi polimer analit olarak yüksek kaliteli MALDI-TOF Kütle spectra elde etmek için önemlidir ve matris seçimi için yönergeler-si olmak be14,15, başka bir yerde bildirdi 16,17. Bir veritabanı polimer maldı numune hazırlama için “yemek tarifleri” de yayınlanan online18oldu. Roman polimerler için matris seçimi ilk polimer çözünürlük anlama ve bir matris ile benzer Çözünürlük parametrelerini14,19seçerek yaklaşılabilir. Yüksek proton benzeşimli polimerler (genellikle karboksilik asit grubu içerir) çoğu matrisler14 tarafından protonated olabilir ama diğer polimerler için cationization Aracısı gerekli14. Alkali iyonları adduct ile de oksijen-içeren türler (Örn. polyesterler ve polieter), oysa doymamış hidrokarbonlar (e.g. Polistiren) geçiş metal gümüş ve bakır iyonları14, gibi sigara 19. polimer örnekleri bu deneyde oksijen atomları omurgasında içerdiğinden, sodyum veya potasyum trifluoroacetate (TFA) kullanılan cationization ajan olarak. Matris ve cationization ajanlar seçtikten sonra analit, katyon Ajan ve matris göreli orantılarını dikkatle yüksek sinyal-gürültü sağlamak için optimize edilmiş olması gerekir. Bu yordam, numune hazırlama için parametreler zaten, ancak optimize edilmiştir bir ampirik örnek en iyi duruma getirme yordamı (adım 1.4.1., Şekil 1) bu üç bileşenden (analit, konsantrasyonları sistematik olarak değişir Matris ve katyon) onların en iyi oranları hızla belirlemek için etkilidir.
Veri toplama Ayrıca bir dizi parametre optimizasyonu gerektirir. En önemli parametreler Spektrometre pozitif veya negatif iyon modu, enstrüman çalışma modu (reflektör karşı doğrusal), ivme gerilim ve ayıklama gecikme süresini içerir. Çözünürlük daha çalışır başka bir ile “reflektron” modu20,21,22,23kullanımını yoludur. Reflektron modu esasen Detector iyonların uçuş yolu geri doğru odaklamayı iyonları ile farklı yükselişler kaynağını yakınındaki bir dedektör uçuş tüp sonundaki iyonları yansıtan ve bu nedenle çözünürlük olsa da artan iki katına sinyal gücü azalan. Buna ek olarak, daha yüksek çözünürlük spectra azalan numarası ve enerji çarpışmaları ve bu nedenle azaltılması parçalanma ve kinetik inhomogeneities24sinyal-gürültü oranı en aza indirir lazer gücü azaltarak elde edilebilir. Tüm bu parametreleri ayarlama tarafından iyonlar herhangi bir inhomogeneity ilk pozisyonu veya Lazer Desorpsiyon sürecinde ortaya çıkıyor hız etkisini en aza indirmek için odaklı olabilir. Ne zaman satın alma parametrelerini optimize edilmiştir, bu da uzunluğuna uçuş tüp ve tasarım bağımlı olmasına rağmen izotopik çözünürlük kez 10.000 Da aşan kitleler ile iyonları için elde edilebilir. En az bir heteroatom içeren en organik bileşikler alkali katyonlar Lityum, sodyum ve potasyum gibi ile kompleks yatkındır. Monoisotopes alkali metallerin çoğu veya sınırlı izotoplar ve bu nedenle dağıtım genişletmek değil.
Aracı parametreleri veri duyarlık en iyi duruma getirmek için ayarlanmış olsa da, veri doğruluğunu sadece uygun kalibrasyon11ile elde edilir. Proteinler ve peptidler aslında calibrants monodispersity ve kullanılabilirlik nedeniyle olarak kullanıldı ama değişken istikrar ve kirleri25yaygınlığı muzdarip. Daha maliyet-etkin ve kararlı alternatifler, inorganik kümeleri ve polydisperse polimerler26,27,28,29dahil ettik. Ne yazık ki, bu alternatifler özelliği toplu atamalarının yanı sıra daha küçük kitlelerin genel olarak, onları sadece 10.000 Da aşağıda kalibrasyonlar için faydalı hale karmaşık kitleler dağıtmak. Bu sorunlar, Grayson ve arkmücadele etmek için. 25 monodisperse ve hem geniş matris ve solvent uyumluluk, raf ömrü kararlılık (> 8 yıl) ve düşük prodüksiyon maliyeti sahiptir bir dendrimer tabanlı, polyester MS kalibrasyon sistem geliştirdi. Bu sistem güçlü bağlı olarak, bu deneyleri için calibrant olarak seçilmiştir.
Kalibrasyon iki ana türü vardır: iç ve dış30. Dışarıdan ayarlama zaman bu analit ayraç kitleler ile bir standart hangi-ebilmek var olmak oluşturmak bir kalibrasyon dosya ayrı bir kitle spektrum oluşturmak için analit daha farklı örnek konumda maldı hedef tabakta yerleştirilir. Öte yandan, yüksek doğruluk kez calibrant calibrant ve analit sinyalleri ile hibrid spektrum elde etmek için analit ile karıştırma içerir bir iç kalibrasyon ile elde edilebilir. Aşağıda açıklanan yordamı, bir dış kalibrasyon uygulanmıştır. Sonra uygun kalibrasyon kitle ölçekte doğru analit kitlesel veri elde edilebilir. En doğru kalibrasyon emin olmak için veri toplama yakında kalibrasyon sonra oluşur önemlidir.
Son olarak, en iyi duruma getirilmiş, kalibre bir kez veri kümeleri satın alınan ve polimer örnekleri hakkında yapısal bilgi sağlamak için verileri analiz edildi. N-mers polimer dağıtım içinde arasındaki boşluğu yinelenen biriminin doğru ölçüm sağlayabilir kitle. Sayı ortalama molekül ağırlığı (Mn) ve diğer toplu dağıtım hesaplamalar (Örneğin, Mw (ağırlığı ortalama molekül ağırlığı) ve Đ (dispersity)) da kitle spectra (sinyal dağılımından belirlenebilir Adım 4.2 hesaplamalar için). Belki de en benzersiz olarak, homopolymers söz konusu olduğunda, son grup kitleler toplamı ofset yinelenen birimleri tek başına kütlesi ile ilgili olarak polimer dağılımının belirlenmesi tarafından onaylanabilir. Bilgi açısından zengin MALDI-TOF Kütle spectra boyutu dışlama kromatografi, Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopi, gibi daha geleneksel polimer karakterizasyonu teknikleri tamamlayıcı değerli karakterizasyonu verileri sağlamak ve nükleer manyetik rezonans.
MALDI-TOF Kütle spektrometresi polimer karakterizasyonu için paha biçilmez bir analitik araç tek başına şarj edilmiş durumda ve çok az parçalanma ile polimer iyonları oluşturmak için onun yetenek nedeniyle biridir. Bu yumuşak iyonlaşma tekniği bir matris polimer iyonları gaz aşamasında oluşturmak için bileşik gömülü polimer analit katı hal örnekleri desorb için kısa lazer bakliyat kullanır. Oluştururlar genellikle onların analiz etkinleştirmek için matris kütle spektrometresi tarafından eklenen özellikler ile complexation tarafından iyonize. Bu makromoleküllerin iyonlar daha sonra onları tespit edilecek onların m/z -ebilmek olanaklı kılmak saat-in-uçuş İyon kaynağı ve dedektör5 arasındaki temel uçuş tüp alanı içermeyen bölgenin içine getirmek için bir ayıklama gerilim tarafından hızlandırılmış , 32.
Diğer polimer karakterizasyonu teknikleri için karşılaştırıldığında, MALDI-TOF MS spectra kalite veri toplama parametrelerini ve numune hazırlama ağır bağlıdır. Numune hazırlama için küme bir formül yoktur ancak numune hazırlama her bileşenin işlevini anlamak için daha hızlı ampirik optimizasyonu sağlar. Polimer analit ile Matrix uyumluluk heyecanlı matris bir iyonize devlet5‘tek, desorbed oluştururlar oluşturmak izin verdiği için önemli olduğundan maldı örnek hazırlanmasında en önemli faktör matrisi seçimdir, 15,17,19. Uygun matris ve cationization ajanlar seçtikten sonra analit, matris ve cationization Ajan doğru oranını tespit edilmelidir. Bu ampirik örnekleri (Şekil 1) matris konsantrasyonu bir eksen üzerindeki artan ve cationization Ajan konsantrasyonu artan MALDI-TOF MS hedef plaka (Şekil 2) üzerinde oluşan iki boyutlu bir tablo oluşturarak elde edilebilir diğer.
MALDI numune hazırlama, orada benzer veri toplama parametrelerini belirlemek için küme bir formül yoktur; Ancak, bazı eğilimleri spektral en iyi duruma getirme işlemini hızlandırmak için düşünülmelidir. Çözünürlüğü artırır ancak genel sinyal azaltır, reflektron modu genellikle nerede izotopik çözünürlük elde edilebilir daha düşük kitle aralıkları için (Bu örnekler, 4.000 Da aşağıda) seçilir. Bu gibi durumlarda, monoisotopic toplu hesaplamalar ve yöntemleri toplama tepe kullanıldı. 4.000 Da yukarıda kitleler ile polimer örnekleri için doğrusal modu ortalama toplu hesaplamalar ve pik malzeme çekme yöntemleri kullanıldı. Sinyal çözünürlüğünü artırmak için iyon kaynağı voltaj daha büyük kitle polimerler daha büyük gerilim fark olan genel eğilim ile küçük artışlarla ayarlanmalıdır (IS2 karşı IS1).
Süre en iyi duruma getirilmiş numune hazırlama ve satın alma parametrelerini hassas sağlayabilir, kitle doğruluğu sadece etkili kalibrasyon elde edilebilir. Zaman-in-uçuş belirli bir kitle için ustaca değişken edinme parametreleri ve hatta plaka pozisyonlar ile ilgili olarak değişebilir, bu nedenle bir kalibrasyon en iyi duruma getirilmiş edinme parametreleri her kümesi için doğru kitle verim için yapılmalıdır tespitler5,30. Bir kez satın alma parametrelerini ve numune hazırlama optimize edilmiştir, spectra tam olarak bu aynı koşullar kullanılarak kalibre.
Olağanüstü çözünürlük ve en iyi duruma getirilmiş MALDI-TOF Kütle spectra polimerlerin içinde gözlenen kitle doğruluk nedeniyle, bu teknik polimer toplu dağıtım veri belirlemek için değerli bir ücretsiz araç haline gelmiştir. Ancak, polimer toplu dağıtım içindeki bireysel tekrar birim çözme yeteneğini belirli bir avantaj için son grup analiz diğer polimer göre jel Permeasyon Kromatografi (GPC) gibi karakterizasyonu teknikleri sağlar ve nükleer manyetik rezonans (NMR). Bu son grup functionalization reaksiyonlar sadakat ve son grup conjugations reaksiyonlar nicel doğasını belirlemek için özellikle değerlidir. Bu el yazması bireysel polimer tekrar birimleri kitle iki ondalık puana kitle doğruluk, son Grup değişiklik onayı ile güven yüksek düzeyde etkinleştirme ile gidermek için yetenek göstermiştir. Son zamanlarda hassas polimer sentez alanında yapılan önemli gelişmeler ile MALDI-TOF MS giderek önemli bir araç haline geliyor makromoleküllerin yapısı ve işlevi için belirler.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar akıllı malzeme tasarım, analiz ve işleme Konsorsiyumu (SMATDAP) tarafından Ulusal Bilim Vakfı işbirliği anlaşması altında IIA-1430280 ve LA kurulu Regents bir yüksek lisans bursu (MEP) finanse etmiş oluyorsunuz. Bu deneyler için polimer örnekleri MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) tarafından temin edilmiştir. Açık erişim yayın Bu makalenin MilliporeSigma tarafından desteklenmektedir.
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 689696 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US |
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 757918 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US |
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500) | MilliporeSigma (Aldrich) | 747386 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide low | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS20 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide medium | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS21 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide high | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS22 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US |
2,4 dinitrofluorobenzene | TCI | A5512 | |
maleimide | MilliporeSigma (Aldrich) | 129585 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US |
1-ethynylfluorobenzene | Fisher Scientific | 766-98-3 | |
triethylamine | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 471283 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US |
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine | MilliporeSigma (Aldrich) | 369497 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US |
Copper(I)Bromide | MilliporeSigma (Aldrich) | 254185 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US |
glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38212 | |
sodium metabisulfite | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 13459 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US |
potassium trifluoroacetate | MilliporeSigma (Aldrich) | 281883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US |
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile | MilliporeSigma (Aldrich) | 727881 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US |
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid | MilliporeSigma (Sigma) | C8982 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US |
tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T425-1 | |
dichloromethane | VWR Analytical | BDH1113-4LG |