Un protocole pour le temps d’ionisation laser assistée par matrice désorption de la caractérisation des polymères synthétiques de spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) est décrit notamment l’optimisation de la préparation de l’échantillon, spectrale acquisition et analyse des données de vol.
Il existe de nombreuses techniques qui peuvent être employées dans la caractérisation des homopolymères synthétique, mais peu fournissent aussi utile d’informations pour l’analyse du groupe fin comme du temps d’ionisation laser assistée par matrice désorption vol de spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS). Ce didacticiel illustre les méthodes d’optimisation de la préparation des échantillons, acquisition spectrale, et analyse des données des polymères synthétiques à l’aide de paramètres de MALDI-TOF Mme critique au cours de la préparation de l’échantillon incluent la sélection de la matrice, identification d’un sel de cationisation approprié et tuning les proportions relatives de la matrice, cation et d’analytes. Les paramètres d’acquisition, tels que le mode (linéaire ou réflecteur), polarisation (positive ou négative), la tension d’accélération et temps de retard, sont également importants. Compte tenu des connaissances de la chimie impliquée synthétiser le polymère et optimiser les paramètres d’acquisition de données tant les conditions de préparation d’échantillon, spectres devraient être obtenues avec une résolution suffisante et la précision de masse pour permettre à l’ambiguïté détermination des groupes fin des homopolymères plupart (masses au-dessous de 10 000) en plus de l’unité de répétition de masse et la répartition globale du poids moléculaire. Si a démontré sur un nombre limité de polymères, ces techniques générales sont appliquent à un éventail beaucoup plus large des polymères synthétiques pour la détermination des distributions de massives, se détermination du groupe fin n’est pas possible pour les homopolymères avec dispersion étroite.
Avec des améliorations dans la vie techniques de polymérisation, polymères de précision avec groupements terminaux quantitativement fonctionnalisés sont de plus en plus disponible1. Le développement simultané des chimies de clic azoture-alcyne et thiolene a permis à l’accouplement presque quantitative des macromolécules d’autres moitiés, donnant accès à une gamme d’hybrides matériaux2,3,4 . Cependant, des techniques analytiques précises sont nécessaires pour caractériser aussi bien les matières premières et produits de ces réactions de conjugaison de polymère. Temps de désorption-ionisation laser assistée par matrice vol de spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) est une technique d’analyse précieux ionisation douce pour la caractérisation des polymères car il peut générer des ions de polymère dans un état de charge simple avec un minimum fragmentation5,6. MALDI-TOF MS a grands avantages par rapport aux autres méthodes conventionnelles de caractérisation de polymère parce qu’elle peut offrir des spectres de masse avec une résolution de la n-mers individuels au sein de la distribution de masse de polymère. En conséquence, ces spectres de masse peut fournir des informations précises sur la masse moléculaire moyenne, répétez l’unité de masse et poids moléculaire polydispersité7, qui peut à son tour élucider les mécanismes de polymérisation concurrentes telles que transfert de chaîne8 . Cependant, MALDI-TOF MS est particulièrement puissant à fournir des informations sur polymère fin groupes9,10, qui peut être utilisé pour confirmer la fin du groupe modifications10,11 et autres les transformations12 comme polymère cyclisations11,13. Tout aussi important, la quantité relativement faible d’analyte (sub-microgrammes) requis pour spectrométrie de masse analyse rend cette technique utile pour la caractérisation lorsque seulement quelques traces de matériel sont disponibles.
L’analyse de MALDI-TOF MS polymères peut être divisée en quatre étapes distinctes : préparation des échantillons, d’étalonnage des instruments, acquisition spectrale et analyse des données. Préparation de l’échantillon est l’étape la plus essentielle pour générer optimisé des spectres de masse MALDI-TOF et se produit avant que l’échantillon est introduit dans l’instrument14,15. La sélection d’une matrice appropriée avec les paramètres de solubilité similaires comme l’analyte de polymère est essentielle pour obtenir des spectres de masse MALDI-TOF de haute qualité et lignes directrices pour la sélection de la matrice ont été signalés ailleurs14,15, 16,17. Une base de données de polymère MALDI « recettes » pour la préparation de l’échantillon a été également publiée en ligne18. De nouveaux polymères, sélection de la matrice peut être abordée en première compréhension la solubilité du polymère et en sélectionnant une matrice avec la même solubilité paramètres14,19. Polymères avec une affinité élevée protons peuvent être protonés par la plupart des matrices14 (qui contiennent fréquemment des groupes acide carboxylique), mais pour les autres polymères, un agent de cationisation est requis14. Les ions alcalins adduit avec contenant de l’oxygène espèces (par exemple. polyesters et polyéthers), tandis que les hydrocarbures insaturés (e.g. polystyrène) adduit avec les métaux de transition tels que les ions d’argent et de cuivre14, 19. parce que les échantillons de polymère dans cette expérience contenaient des atomes d’oxygène dans la colonne vertébrale, trifluoroacétate de sodium ou de potassium (TFA) ont été utilisées comme agent cationisation. Une fois que les agents de la matrice et cationisation ont été sélectionnés, les proportions relatives de l’analyte, agent de cation et la matrice doivent être soigneusement optimisées pour assurer un signal au bruit. Dans cette procédure, les paramètres de préparation des échantillons ont déjà été optimisés, toutefois une procédure d’optimisation échantillon empirique (étape 1.4.1., Figure 1) qui varie systématiquement les concentrations des trois composantes (analyte, matrice et cations) est efficace pour déterminer rapidement leur ratio optimal.
Acquisition de données requiert également l’optimisation d’un certain nombre de paramètres. Les paramètres les plus importants incluent le mode ion positif ou négatif du spectromètre, au mode de fonctionnement (linéaire par rapport à réflecteur), la tension d’accélération et le temps de retard d’extraction. Une autre façon que la résolution peut être augmentée est par le biais de l’utilisation du « réflectron » mode20,21,22,23. Mode réflectron double essentiellement la trajectoire des ions dans le détecteur en reflétant les ions à la fin du tube vol vers un détecteur près de la source tout en ions recentrer avec différents élans et par conséquent augmenter la résolution bien que diminuer l’intensité du signal. On trouvera en outre, les spectres de résolution plus élevées en diminuant la puissance du laser qui minimise le rapport signal sur bruit en diminuant le nombre et l’énergie des collisions et donc réduire la fragmentation et la cinétique inhomogénéités24. Par le réglage de tous ces paramètres, les ions peuvent se concentrer afin de minimiser l’effet de tout manque d’homogénéité dans la position initiale ou de la vitesse qui se produit pendant le processus de la désorption laser. Lorsque les paramètres d’acquisition sont optimisées, résolution isotopique souvent est possible pour les ions de masse supérieure à 10 000 Da, si ce n’est aussi dépendant de la longueur du tube vol et la conception de l’appareil. Plupart des composés organiques qui contiennent au moins un hétéroatome sont sujettes à la complexation avec les cations alcalins tels que lithium, de sodium et potassium. La plupart des métaux alcalins sont monoisotopes ou d’isotopes limitées et par conséquent n’élargissent pas la distribution.
Alors que les paramètres de l’instrument peuvent être ajustés afin d’optimiser la précision des informations, l’exactitude des données n’est possible avec un étalonnage approprié11. Protéines et peptides servaient initialement calibrants en raison de leur monodispersity et leur disponibilité, mais souffrent de stabilité variable et la prévalence des impuretés25. Plus stables et rentables des solutions de rechange ont inclus des agrégats inorganiques et polydispersés polymères26,27,28,29. Malheureusement, la fonctionnalité de ces alternatives se dispersent masses qui compliquent massives affectations, ainsi que des masses plus petites dans l’ensemble, ce qui les rend utiles uniquement pour les étalonnages au-dessous de 10 000 Da. Pour lutter contre ces problèmes, Grayson et al. 25 a développé un système de calibration de la MS dendrimère-based, polyester monodispersé, qui possède tant large matrice et compatibilité solvant, stabilité de durée de vie (> 8 ans) et moindre coût de production. D’après les points forts de ce système, il a été choisi comme le degré de ces expériences.
Il existe deux principaux types d’étalonnage : internes et externes30. Lors de l’étalonnage externe, une norme dont les masses que celui de l’analyte support sont placés sur la plaque de mire MALDI dans une position de l’échantillon différent que l’analyte pour générer un spectre de masse séparé, d’où un fichier de calibration peut être généré. En revanche, une plus grande précision possible souvent avec un étalonnage interne, ce qui implique le degré de mélange avec l’analyte pour obtenir un spectre d’hybride avec les calibrant analyte signaux et. La procédure décrite ci-dessous, un étalonnage externe est mis en oeuvre. Après un étalonnage approprié de l’échelle de masse, analyte précises données massives peuvent être acquises. Afin d’assurer l’étalonnage plus précis, il est important que l’acquisition des données se produit peu de temps après l’étalonnage.
Enfin, une fois calibré l’optimisée, des ensembles de données ont été acquises, et les données ont été analysées pour fournir des informations structurelles sur les échantillons de polymère. L’espacement entre n-mers dans la distribution de polymère peut fournir une mesure précise de l’unité de répétition de masse. La masse moléculaire moyenne en nombre (n) et autres calculs de distribution de masse (par exemple, Mw (masse moléculaire moyenne en poids) et Đ (dispersion)) peut également être déterminée par la distribution des signaux dans les spectres de masse ( l’étape 4.2 pour les calculs). Peut-être plus unique, dans le cas des homopolymères, la somme des masses groupe fin peut être confirmée en déterminant le décalage de la distribution de polymère en ce qui concerne la masse de l’unités répétitives seules. Les spectres de masse MALDI-TOF riches en information fournissent des données de caractérisation précieux qui sont complémentaires aux techniques de caractérisation de polymère plus traditionnelles comme la chromatographie d’exclusion, spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, et résonance magnétique nucléaire.
Spectrométrie de masse MALDI-TOF est un outil inestimable analytique pour la caractérisation des polymères en raison de sa capacité à générer des ions polymères à l’État chargé individuellement et avec fragmentation minime. Cette technique d’ionisation douce utilise des impulsions courtes pour désorber des échantillons à l’état solide de l’analyte de polymère noyées dans une matrice composée pour générer des ions de polymère en phase gazeuse. Les macromolécules sont généralement ionisés par complexation avec les cations qui sont ajoutés à la matrice pour permettre leur analyse par spectrométrie de masse. Ces ions macromoléculaires sont ensuite accélérées par une tension d’extraction pour les amener dans la région de champ sans le tube de vol qui permettent leur m/z à déterminer basé sur leur temps de vol entre la source d’ions et le détecteur5 , 32.
Par rapport à d’autres techniques de caractérisation de polymère, qualité de spectres de MALDI-TOF MS est fortement tributaire de paramètres d’acquisition de données et de préparation des échantillons. Bien qu’il n’y a pas de formule établie pour la préparation de l’échantillon, comprendre la fonction de chaque composant de la préparation de l’échantillon permet d’optimisation empirique plus rapide. Le facteur le plus important dans la préparation de l’échantillon MALDI est la sélection de la matrice car la compatibilité de la matrice avec l’analyte de polymère est critique pour permettre à matrice excité générer des macromolécules unique, désorbés dans un État ionisé5, 15,17,19. Une fois que les agents appropriés de matrice et de cationisation ont été sélectionnés, le rapport correct de l’analyte, la matrice et cationisation agent doit être déterminé. Ceci peut être réalisé de façon empirique en créant une grille à deux dimensions des échantillons (Figure 1) sur la plaque de mire MALDI-TOF MS (Figure 2) avec l’augmentation de la concentration de la matrice sur un axe et augmentation de la concentration d’agent de cationisation sur la autres.
Similaire à la préparation de l’échantillon MALDI, il n’y a pas de formule établie pour la détermination des paramètres d’acquisition de données ; Cependant, certaines tendances envisagera d’accélérer spectrale optimization. Mode réflectron, ce qui augmente la résolution, mais diminue le signal global, est généralement choisi pour les gammes inférieures massives (dans ces exemples, au-dessous de 4 000 Da) où isotopique résolution peut être obtenue. Dans ces cas, calculs de Masse monoisotopique et PIC cueillette des méthodes ont été utilisées. Pour les échantillons de polymère avec des masses au-dessus de 4 000 Da, mode linéaire a été utilisé avec des calculs de massives moyennes et pointe des méthodes de cueillette. Pour améliorer la résolution du signal, il convient de modifier la tension de source d’ions par petits incréments avec la tendance générale de plus grands Polymères de massives ayant une plus grande tension différentielle (IS1 versus IS2).
Certain temps optimisé acquisition et préparation des échantillons paramètres peuvent fournir de précision, exactitude de masse n’est possible que par le biais de calibrage efficace. Le temps de vol pour une masse donnée peut varier subtilement en ce qui concerne les paramètres d’acquisition variable et les positions de la même plaque, donc un étalonnage doit se faire pour chaque jeu de paramètres d’acquisition optimisée afin de donner la masse exacte déterminations5,30. Une fois que les paramètres d’acquisition et de la préparation de l’échantillon ont été optimisés, le spectre doit être étalonné à l’aide de ces mêmes conditions exactes.
En raison de la résolution exceptionnelle et une précision masse observées dans les spectres de masse MALDI-TOF optimisées des polymères, cette technique est devenue un outil gratuit permettant de déterminer les données de répartition des masses moléculaires de polymères. Cependant, sa capacité à résoudre des unités de répétition individuelles au sein de la distribution de masse polymère fournit un avantage particulier pour l’analyse du groupe fin par rapport à d’autres polymères techniques de caractérisation comme la chromatographie par perméation de gel (GPC) et nucléaire résonance magnétique (RMN). Ceci est particulièrement utile pour la détermination de la fidélité des réactions de fonctionnalisation groupe fin et la nature quantitative de réactions de conjugaison pour le groupe fin. Ce manuscrit a démontré sa capacité à résoudre la masse des unités de répétition de polymère individuels avec jusqu’à deux points de décimales de précision de masse, permettant la confirmation des modifications du groupe fin avec un niveau de confiance élevé. Les progrès considérables qui ont été faites récemment dans le domaine de la synthèse de polymère de précision, MALDI-TOF MS devient un outil de plus en plus important pour déterminer la structure macromoléculaire et fonctionnalité.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs reconnaissent que la conception intelligente de matériaux, analyse et traitement consortium (SMATDAP) financé par la National Science Foundation en vertu de l’accord de coopération IIA-1430280 et le Conseil de LA des régents pour une bourse d’études supérieures (MEP). Échantillons de polymère pour ces expériences ont été fournis par MilliporeSigma (Sigma-Aldrich). Publication d’accès ouverte de cet article est sponsorisée par MilliporeSigma.
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 689696 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US |
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 757918 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US |
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500) | MilliporeSigma (Aldrich) | 747386 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide low | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS20 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide medium | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS21 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide high | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS22 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US |
2,4 dinitrofluorobenzene | TCI | A5512 | |
maleimide | MilliporeSigma (Aldrich) | 129585 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US |
1-ethynylfluorobenzene | Fisher Scientific | 766-98-3 | |
triethylamine | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 471283 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US |
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine | MilliporeSigma (Aldrich) | 369497 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US |
Copper(I)Bromide | MilliporeSigma (Aldrich) | 254185 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US |
glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38212 | |
sodium metabisulfite | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 13459 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US |
potassium trifluoroacetate | MilliporeSigma (Aldrich) | 281883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US |
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile | MilliporeSigma (Aldrich) | 727881 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US |
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid | MilliporeSigma (Sigma) | C8982 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US |
tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T425-1 | |
dichloromethane | VWR Analytical | BDH1113-4LG |