Um protocolo para o tempo de ionização de dessorção do laser assistida por matriz de caracterização de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) de polímeros sintéticos é descrita, incluindo a otimização da preparação da amostra, espectral aquisição e análise de dados de voo.
Existem muitas técnicas que podem ser empregadas na caracterização de homopolímeros sintéticos, mas poucos fornecem tão útil de informações para análise de grupo final como tempo de ionização de dessorção do laser assistida por matriz de espectrometria de massa de voo (MALDI-TOF-MS). Este tutorial demonstra métodos para otimização da preparação amostra, aquisição espectral, e análise de dados de polímeros sintéticos, usando parâmetros críticos de MALDI-TOF MS. durante a preparação da amostra incluem a seleção da matriz, identificação de um sal de cationization apropriado e ajuste as proporções relativas da matriz, cação e analito. Os parâmetros de aquisição, tais como o modo (linear ou refletor), polarização (positiva ou negativa), tensão de aceleração e tempo de atraso, também são importantes. Espectros dado algum conhecimento da química envolvida na síntese do polímero e otimizando tanto os parâmetros de aquisição de dados e as condições de preparação de amostra, devem ser obtidos com precisão em massa e resolução suficiente para permitir a inequívoca determinação dos grupos final da maioria dos homopolímeros (massas abaixo de 10.000), além da unidade de repetição em massa e a distribuição de peso molecular geral. Embora demonstrado em um conjunto limitado de polímeros, estas técnicas gerais são aplicáveis a uma gama mais ampla de polímeros sintéticos para determinar a distribuição em massa, apesar de determinação de grupo final só é possível para homopolímeros com dispersity estreita.
Com melhorias em visitas técnicas de polimerização, polímeros de precisão com grupos quantitativamente funcionalizados final são cada vez mais disponível1. O desenvolvimento simultâneo de azida-alquino e thiolene clique químicas permitiu o acoplamento quase quantitativo de macromoléculas para outras partes, fornecendo acesso a uma gama de híbridos materiais2,3,4 . No entanto, são necessárias técnicas de analíticas precisas para caracterizar tanto a partida materiais e produtos destas reações de conjugação de polímero. Tempo de dessorção/ionização do laser assistida por matriz de espectrometria de massa de voo (MALDI-TOF MS) é uma técnica analítica de ionização suave valioso para caracterizar polímeros porque pode gerar íons de polímero em um estado de carga única com mínimo fragmentação de5,6. MALDI-TOF MS tem grandes vantagens sobre outros métodos convencionais de caracterização de polímeros, porque pode fornecer espectros de massa com resolução da n-mers individuais dentro da distribuição em massa de polímero. Como consequência, tais espectros de massa pode fornecer informações precisas sobre o peso molecular médio, repita a unidade de massa e peso molecular dispersity7, que por sua vez pode elucidar mecanismos de polimerização concorrentes tais como transferência de cadeia8 . No entanto, MALDI-TOF MS é particularmente poderoso para fornecer informações sobre o polímero final grupos9,10, que pode ser usado para confirmar o final grupo modificações10,11 e outros transformações12 como polímero cyclizations11,13. Igualmente importante, a relativamente pequena quantidade do analito (submicrogramas) necessários para espectrometria de massa análise torna esta técnica útil para a caracterização, quando somente quantidades de traço de material estão disponíveis.
A análise de MALDI-TOF MS de polímeros pode ser dividida em quatro etapas distintas: preparação, calibragem, aquisição espectral e análise dos dados da amostra. Preparação da amostra é o mais essencial passo para gerar otimizado de espectros de massa MALDI-TOF e ocorre antes que a amostra é introduzida o instrumento14,15. A seleção de um apropriado matriz com parâmetros de solubilidade semelhantes como o analito de polímero é fundamental para obter espectros de massa MALDI-TOF da alta qualidade e diretrizes para a seleção da matriz têm sido relatados em outros lugares14,15, 16,17. Um banco de dados de polímero MALDI “receitas” para a preparação da amostra também foi publicado on-line18. Para polímeros romance, seleção de matriz pode ser abordada primeiro compreender a solubilidade do polímero e selecionando uma matriz com solubilidade similares parâmetros14,19. Polímeros com afinidade protônica alta podem ser protonados pela maioria das matrizes14 (que frequentemente contêm grupos carboxila), mas para outros polímeros, um agente de cationization é necessário14. Íons alcalinos aduto bem com oxigênio-contendo espécies (EG. poliésteres e poliéteres), Considerando que hidrocarbonetos insaturados (ex. poliestireno) aduto com metais de transição como íons de prata e cobre14, 19. porque as amostras de polímero neste experimento continham átomos de oxigênio na espinha dorsal, de sódio ou potássio contra-íons (TFA) foram usados como o agente cationization. Uma vez que os agentes de matrix e cationization foram selecionados, as proporções relativas de analito, agente cação e matriz devem ser cuidadosamente otimizadas para garantir alto sinal de ruído. Neste procedimento, os parâmetros para a preparação da amostra já foram otimizados, no entanto um procedimento de otimização de amostra empírica (passo 1.4.1., Figura 1) que varia sistematicamente as concentrações dos três componentes (analito, cações e matriz) é eficaz para determinar rapidamente suas proporções ideais.
Aquisição de dados também exige a otimização de um número de parâmetros. Os parâmetros mais importantes incluem o modo de íon positivo ou negativo do aparelho, o modo de operação do instrumento (linear versus refletor), a tensão de aceleração e o tempo de atraso de extração. Outra forma que a resolução pode ser aumentada é através da utilização de “reflectron” modo20,21,22,23. Reflectron modo essencialmente duplica a trajetória dos íons ao detector refletindo os íons na extremidade do tubo de voo para um detector perto da fonte enquanto reorientação íons com diferentes ímpetos, e, portanto, aumentando a resolução embora diminuindo a intensidade do sinal. Além disso, espectros de resolução mais elevados podem ser obtidos, diminuindo a potência do laser que minimiza a relação sinal-ruído, diminuindo o número e a energia das colisões e, portanto, reduzindo a fragmentação e heterogeneidades cinética24. Por tuning todos esses parâmetros, os íons podem ser focados para minimizar o efeito de qualquer homogeneidade na posição inicial ou a velocidade que ocorre durante o processo de dessorção do laser. Quando os parâmetros de aquisição são otimizados, resolução isotópica muitas vezes pode ser alcançada para íons com massas superiores a 10.000 Da, embora este também é dependente do comprimento do tubo de voo e o design do instrumento. Mais orgânicos compostos que contêm pelo menos um heteroátomo são propensos a complexantes com cátions alcalinos, tais como lítio, sódio e potássio. Muitos dos metais alcalinos são monoisotopes ou isótopos limitado e, portanto, não ampliar a distribuição.
Enquanto os parâmetros do instrumento podem ser ajustados para otimizar a precisão de dados, precisão dos dados só é alcançado com uma calibração adequada11. Proteínas e peptídeos foram originalmente usados como calibrants devido à sua monodispersity e disponibilidade, mas sofrem de estabilidade variável e a prevalência de impurezas25. Alternativas mais rentáveis e estáveis incluíram aglomerados inorgânicos e polydisperse polímeros26,,27,28,29. Infelizmente, estes apresentam alternativas dispersar massas, que complicam atribuições em massa, bem como massas menores, em geral, tornando-os úteis apenas para calibrações abaixo de 10.000 Da. Para combater estes problemas, Grayson et al. 25 desenvolveu um sistema de calibração MS baseado em dendrímeros, poliéster que é monodisperso e possui tanto ampla matriz e solvente compatibilidade, estabilidade de vida útil (> 8 anos) e menor custo de produção. Com base nos pontos fortes deste sistema, foi selecionado como o calibrant para estas experiências.
Existem dois tipos principais de calibração: interno e externo de30. Quando calibrar externamente, um padrão com massas que suporte isso do analito são colocados sobre a placa de destino MALDI numa posição diferente da amostra que o analito para gerar um espectro de massa separado do qual pode ser gerado um arquivo de calibração. Por outro lado, maior precisão, muitas vezes pode ser conseguido com uma calibração interna, que envolve a mistura de calibrant com o analito para obter um espectro de híbrido com sinais de calibrant e de analito. O procedimento descrito abaixo, foi implementada uma calibração externa. Após a calibração adequada da escala maciça, podem ser adquiridos em massa dados precisos do analito. Para garantir a calibragem mais precisa, é importante que a aquisição de dados ocorre logo após a calibração.
Finalmente, uma vez calibrado o otimizado, conjuntos de dados foram adquiridos, e os dados foram analisados para fornecer informações estruturais sobre os exemplos de polímero. O espaçamento entre n-mers dentro da distribuição do polímero pode fornecer uma medida exata da unidade de repetição em massa. O número de massa molecular média (Mn) e outros cálculos de distribuição de massa (por exemplo, Mw (peso molecular médio de peso) e Đ (dispersity)) também pode ser determinada a partir da distribuição do sinal no espectro de massa ( Passo 4.2 para cálculos). Talvez mais excepcionalmente, no caso de homopolímeros, a soma das massas do grupo da final pode ser confirmada por determinar o deslocamento da distribuição do polímero com relação a massa das unidades de repetição sozinhos. Os espectros de massa MALDI-TOF ricos em informação fornecem dados valiosos de caracterização que são complementares às técnicas de caracterização de polímeros mais tradicionais tais como cromatografia de exclusão, espectroscopia de infravermelho-transformada de Fourier, e ressonância nuclear magnética.
Espectrometria de massa MALDI-TOF é uma ferramenta analítica inestimável para a caracterização do polímero devido à sua capacidade de gerar íons de polímero no estado isoladamente carregado e com mínima fragmentação. Esta técnica de ionização suave utiliza pulsos de laser curto para desorb estado sólidas amostras do analito polímero incorporado em uma matriz composto para gerar íons de polímero na fase gasosa. Normalmente, as macromoléculas são ionizadas por complexação com cátions são adicionados à matriz para permitir sua análise por espectrometria de massa. Estes íons macromoleculares são então acelerados por uma tensão de extração para trazê-los para a região de campo-livre do tubo do voo que pode habilitar seus m/z a ser determinado com base em seu tempo de voo entre a fonte de íon e o detector5 , 32.
Em comparação com outras técnicas de caracterização de polímeros, qualidade de espectros de MALDI-TOF MS é fortemente dependente de parâmetros de aquisição de dados e preparação da amostra. Embora não haja nenhuma fórmula definida para a preparação da amostra, compreendendo a função de cada componente da preparação amostra permite a otimização empírica mais rápida. O fator mais importante na preparação da amostra MALDI é seleção da matriz pois compatibilidade da matriz com o analito de polímero é fundamental para permitir que a matrix animado para gerar macromoléculas dessorvidas, única em um estado ionizado5, 15,17,19. Uma vez apropriado matriz e cationization agentes foram selecionados, deve ser determinada a relação correta de analito, matriz e cationization agente. Isto pode ser conseguido empiricamente, criando uma grade bidimensional de amostras (Figura 1) sobre a placa-alvo MALDI-TOF MS (Figura 2) com o aumento da concentração de matriz em um eixo e aumento da concentração do agente de cationization sobre o outros.
Semelhante à preparação da amostra MALDI, não há nenhuma fórmula definida para a determinação de parâmetros de aquisição de dados; no entanto, certas tendências devem ser consideradas para agilizar a otimização espectral. Modo de Reflectron, que aumenta a resolução, mas diminui o sinal global, normalmente é escolhido para baixa massa varia (nestes exemplos, abaixo Da 4.000) onde será possível resolução isotópica. Nestes casos, cálculos de massa monoisotópico e pico escolher métodos foram utilizados. Para amostras de polímero com massas acima Da 4.000, modalidade linear foi usada com cálculos de massa médios e pico de métodos de colheita. Para melhorar a resolução do sinal, as tensões de fonte do íon devem ser ajustadas em pequenos incrementos, com a tendência geral de maiores massa polímeros com maior tensão diferencial (IS1 contra IS2).
Tempo otimizado a preparação da amostra e aquisição parâmetros podem fornecer precisão, exatidão em massa só pode ser alcançado através da calibração eficaz. O tempo de voo para uma determinada massa pode variar sutilmente com relação a parâmetros de aquisição variável e posições de placa mesmo, portanto uma calibração deve ser efectuada para cada conjunto de parâmetros de aquisição otimizada para produzir massa exata determinações de5,30. Uma vez que os parâmetros de aquisição e preparação da amostra foram otimizadas, o espectro deve ser calibrado usando essas mesmas condições.
Por causa do excepcional resolução e precisão em massa observada nos espectros de massa MALDI-TOF otimizados de polímeros, essa técnica tornou-se uma valiosa ferramenta gratuita para a determinação de dados de distribuição em massa de polímero. No entanto, sua capacidade de resolver as unidades individuais de repetição dentro da distribuição em massa de polímero fornece uma vantagem específica para análise de grupo final em relação ao outro polímero técnicas de caracterização, como cromatografia de permeação de gel (GPC) e nuclear ressonância magnética (NMR). Isto é particularmente valioso para determinar a fidelidade de reações de functionalization grupo final e a natureza quantitativa de reacções de conjugações de grupo final. Este manuscrito tem demonstrado a capacidade de resolver a massa de repetir unidades individuais de polímero, com até dois pontos decimais de precisão em massa, permitindo a confirmação de modificações de grupo final com um elevado nível de confiança. Com os avanços substanciais que têm sido feitos recentemente no campo da síntese do polímero de precisão, MALDI-TOF MS está se tornando uma ferramenta cada vez mais importante para determinar a estrutura macromolecular e funcionalidade.
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem que o consórcio Smart Design de materiais, análise e processamento (SMATDAP) financiado pela National Science Foundation sob acordo de cooperação IIA-1430280 e o LA placa de Regents para uma bolsa de pós-graduação (MEP). Amostras de polímero para estas experiências foram fornecidas por MilliporeSigma (Sigma-Aldrich). Publicação de acesso aberta do presente artigo é patrocinada pela MilliporeSigma.
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 689696 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US |
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 757918 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US |
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500) | MilliporeSigma (Aldrich) | 747386 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide low | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS20 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide medium | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS21 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide high | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS22 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US |
2,4 dinitrofluorobenzene | TCI | A5512 | |
maleimide | MilliporeSigma (Aldrich) | 129585 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US |
1-ethynylfluorobenzene | Fisher Scientific | 766-98-3 | |
triethylamine | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 471283 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US |
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine | MilliporeSigma (Aldrich) | 369497 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US |
Copper(I)Bromide | MilliporeSigma (Aldrich) | 254185 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US |
glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38212 | |
sodium metabisulfite | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 13459 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US |
potassium trifluoroacetate | MilliporeSigma (Aldrich) | 281883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US |
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile | MilliporeSigma (Aldrich) | 727881 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US |
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid | MilliporeSigma (Sigma) | C8982 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US |
tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T425-1 | |
dichloromethane | VWR Analytical | BDH1113-4LG |