Een protocol voor de laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie tijd van de vlucht de karakterisering van de Spectrometrie van de massa (MALDI-TOF MS) van synthetische polymeren wordt beschreven, met inbegrip van de optimalisering van de bereiding van de monsters, spectrale acquisitie en data-analyse.
Er zijn vele technieken die kunnen worden ingezet in de karakterisering van synthetische homopolymeren, maar weinigen als nuttige informatie voor eind groep analyse als laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie tijd van flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS). Deze tutorial toont methodes voor optimalisatie van de bereiding van de monsters, spectrale verwerving, en data-analyse van synthetische polymeren met behulp van MALDI-TOF MS. kritische parameters tijdens de bereiding omvatten de selectie van de matrix, identificatie van een passende cationization zout en het afstemmen van de relatieve verhoudingen van de matrix, kation en analyt. De overname-parameters, zoals de modus (lineaire of reflector), polarisatie (positief of negatief), spanning van de versnelling en vertraging, zijn ook belangrijk. Gegeven enige kennis van de betrokken voor het synthetiseren van het polymeer en het optimaliseren van de parameters van de overname gegevens zowel de sample voorbereiding voorwaarden chemie, moeten spectra worden verkregen met voldoende resolutie en massale nauwkeurigheid om de ondubbelzinnige bepaling van de eindgroepen van meeste homopolymeren (massa’s onder 10.000) naast de Herhaal eenheid massa en de algehele molecuulgewichtsverdeling. Hoewel aangetoond op een beperkte set van polymeren, deze algemene technieken gelden voor een veel breder scala van synthetische polymeren voor de bepaling van de massa distributies, al eind groep bepaling alleen mogelijk voor homopolymeren met smalle dispersiteit is.
Met verbeteringen in levende polymerisatie technieken, precisie polymeren met een kwantitatief matiemaatschappij eindgroepen zijn steeds beschikbaar1. De gelijktijdige ontwikkeling van azide-alkyn en thiolene Klik op Doorgaan in staat heeft gesteld de bijna kwantitatieve koppeling van macromoleculen naar andere wordt, biedt toegang tot een aantal hybride materialen2,3,4 . Echter precieze analytische technieken moeten karakteriseren van zowel de uitgangsstoffen en producten van deze polymeer vervoeging reacties. Laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie tijd van flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) is een waardevolle zachte ionisatie analytische techniek voor de karakterisering van polymeren, omdat het polymeer ionen in een enkele lading staat met minimale genereren kan fragmentatie5,6. MALDI-TOF MS heeft grote voordelen ten opzichte van andere conventionele methoden van polymeer karakterisering van omdat het massaspectra in resolutie van de individuele n-mers binnen de verdeling van massa van polymeer voorzien kan. Dientengevolge, kan dergelijke massaspectra bieden nauwkeurige gegevens over de gemiddelde molecuulgewicht, herhaal massa-eenheid, en moleculair gewicht dispersiteit7, die kan op zijn beurt het verhelderen van concurrerende polymerisatiemechanismen zoals keten overdracht8 . MALDI-TOF MS is echter bijzonder krachtige op het verstrekken van informatie over polymeer einde groepen9,10, die kan worden gebruikt voor het bevestigen van eind groep wijzigingen10,11 en andere transformaties12 zoals polymeer cyclizations11,13. Even belangrijk, de relatief kleine hoeveelheid analyt (sub-microgram) vereist voor massa-spectrometrische analyse maakt deze techniek handig voor karakterisering, wanneer enige trace hoeveelheden materiaal beschikbaar zijn.
De MALDI-TOF MS-analyse van polymeren kan worden onderverdeeld in vier afzonderlijke stappen: proeven van voorbereiding, kalibreren van het instrument, spectrale acquisitie en data-analyse. Bereiding van de monsters is de meest essentiële stap voor het genereren van geoptimaliseerd MALDI-TOF massaspectra en treedt op voordat het monster wordt ingevoerd in het instrument14,15. De keuze van een geschikte matrix met soortgelijke oplosbaarheid parameters als de analyt polymeer is essentieel voor het verkrijgen van hoge kwaliteit MALDI-TOF massaspectra en richtsnoeren voor de selectie van de matrix zijn gemeld elders14,15, 16,17. Ook is een database van polymeer MALDI “recepten” voor monstervoorbereiding gepubliceerde online18. Voor roman polymeren, kan matrix selectie worden benaderd door eerste inzicht in de oplosbaarheid van het polymeer en het selecteren van een matrix met soortgelijke oplosbaarheid parameters-14,19. Polymeren met een hoog proton affiniteit kunnen geprotoneerd door meeste matrices14 (die vaak bevatten carbonzuur groepen), maar voor andere polymeren, een cationization-agent is vereist14. Alkali ionen adduct goed met zuurstof-bevattende soorten (bv. polyesters en polyethers), terwijl onverzadigde koolwaterstoffen (bijv. polystyreen) adduct met overgangsmetalen, zoals zilver en koper ionen14, 19. omdat de polymeer monsters in dit experiment opgenomen zuurstofatomen in de ruggengraat, natrium- of kaliumzouten trifluoroacetate (TFA) werden gebruikt als de agent cationization. Zodra de agenten matrix en cationization hebt geselecteerd, moeten de relatieve verhoudingen van de analyt, kation agent en matrix zorgvuldig worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen de hoge signaal-ruis. In deze procedure, de parameters voor de bereiding van de monsters zijn al geoptimaliseerd, maar een empirische voorbeeldprocedure optimalisatie (stap 1.4.1., Figuur 1) die systematisch varieert de concentraties van de drie onderdelen (analyt, matrix en catie) is effectief voor het snel bepalen hun optimale verhoudingen.
Data-acquisitie vereist ook de optimalisering van een aantal parameters. De belangrijkste parameters omvatten het positief of negatief ion-modus van de spectrometer, de bewerkingsmodus instrument (lineair ten opzichte van de reflector), de spanning van de versnelling en de vertragingstijd van extractie. Een andere manier dat de resolutie kan worden verhoogd is door het gebruik van “reflectron” modus20,21,22,23. Reflectron modus verdubbelt in wezen de vliegroute van de ionen naar de detector door als gevolg van de ionen aan het einde van de buis van de vlucht terug naar een detector in de buurt van de bron terwijl heroriëntatie ionen met verschillende momentums, en dus het verhogen van de resolutie wel afnemende sterkte van het signaal. Bovendien kunnen hogere resolutie spectra worden verkregen door de laser-macht die minimaliseert de signal-to-noise verhouding te verlagen met verminderend het aantal en de energie van botsingen en dus vermindering van de versnippering en kinetische inhomogeneities24. Door tuning al deze parameters, kunnen de ionen worden geconcentreerd om het minimaliseren van het effect van elke heterogeniteit in de oorspronkelijke positie of de snelheid die tijdens het desorptie laser optreedt. Wanneer de verwerving parameters worden geoptimaliseerd, kan isotopische resolutie vaak worden bereikt voor ionen met massa’s meer dan 10.000 Da, maar dit ook afhankelijk van de lengte van de buis van de vlucht en het ontwerp van het instrument is. Meest organische stoffen die ten minste één heteroatoom bevatten zijn gevoelig voor complexvormers met alkali kationen zoals lithium, natrium en kalium. Veel van de alkalimetalen zijn monoisotopes of van beperkte isotopen en daarom geen uitbreiding inhouden van de verdeling.
Terwijl de instrument-parameters kunnen worden afgestemd om te optimaliseren gegevens precisie, wordt nauwkeurigheid van gegevens alleen bereikt met een juiste kalibratie-11. Eiwitten en peptiden werden oorspronkelijk gebruikt als kalibranten als gevolg van hun monodispersity en beschikbaarheid, maar lijden variabele stabiliteit en de prevalentie van onzuiverheden25. Meer rendabele en stabiele alternatieven hebben opgenomen anorganische clusters en polydisperse polymeren26,27,28,29. Helaas, de functie van deze alternatieven dispergeren massa, die bemoeilijken massa toewijzingen, evenals kleinere massa’s over het algemeen, waardoor ze alleen nuttig voor kalibraties onder 10.000 Da. Ter bestrijding van deze problemen, Grayson et al. 25 een Dendrimeer gebaseerde, polyester MS kalibratie systeem ontwikkeld dat is monodispers, en biedt zowel brede matrix en oplosmiddel compatibiliteit, houdbaarheid stabiliteit (> 8 jaar) en lagere productiekosten. Gebaseerd op de sterke punten van dit systeem, werd het gekozen als de kalibrant voor deze experimenten.
Er zijn twee hoofdtypen van kalibratie: interne en externe30. Wanneer extern kalibreren, een standaard met massa’s die beugel die van de analyt gebruikt worden geplaatst op de MALDI doel plaat verschillende monster ten opzichte van de analyt voor het genereren van een aparte massaspectrum waaruit een kalibratie-bestand kan worden gegenereerd. Aan de andere kant, kan verhoogde nauwkeurigheid vaak worden bereikt met een interne kalibratie, waarbij de kalibrant mengen met de analyt te verkrijgen van een hybride spectrum met kalibrant zowel analyt signalen. In de procedure hieronder beschreven, werd een externe kalibratie geïmplementeerd. Na de juiste kalibratie van de massale schaal wordt kan nauwkeurig analyt massa gegevens worden verkregen. Om ervoor te zorgen de meest nauwkeurige kalibrering, is het belangrijk dat de data-acquisitie spoedig na de kalibratie plaatsvindt.
Ten slotte, zodra de geoptimaliseerde, gekalibreerd datasets werden verworven, en de gegevens werden geanalyseerd om structurele informatie over de polymeer-monsters te verstrekken. De afstand tussen n-mers binnen de distributie van het polymeer kan bieden nauwkeurige meting van de herhalende eenheid massa. Het aantal gemiddelde molecuulgewicht (Mn) en andere massa distributie berekeningen (bvMw (gewicht gemiddeld molecuulgewicht) en Đ (dispersiteit)) kan ook worden bepaald uit het signaal distributie in de massaspectra ( stap 4.2 voor berekeningen). Misschien meest uniek, kan in het geval van homopolymeren, de som van de massa van de groep eind worden bevestigd door de verschuiving van de verdeling van de polymeer met betrekking tot de massa van de herhalende eenheden alleen vast te stellen. De informatie-rijke MALDI-TOF massaspectra bieden waardevolle karakterisering gegevens die vormen een aanvulling op de meer traditionele polymeer karakterisering technieken zoals grootte uitsluiting chromatografie, Fourier-transform infrarood spectroscopie, en nucleaire magnetische resonantie.
De Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF is een analytisch instrument van onschatbare waarde voor de karakterisering van het polymeer vanwege de mogelijkheid voor het genereren van polymeer ionen de afzonderlijk opgeladen en met minimale fragmentatie. Deze zachte ionisatie-techniek maakt gebruik van korte laserpulsen om solid-state monsters van de polymeer analyt ingesloten in een matrix voor het genereren van polymeer ionen in de gasfase samengestelde desorb. De macromoleculen zijn meestal geïoniseerd door complexvorming met kationen die zijn toegevoegd aan de matrix om hun analyse door massaspectrometrie. Deze macromoleculaire ionen zijn daarna versneld door de spanning van een extractie om hen te brengen in het veld-gebied van de vlucht-buis die kan hun m/z te bepalen op basis van hun time-of-flight tussen de ion-bron en de detector5 , 32.
Vergeleken met andere polymeer karakterisering technieken, is MALDI-TOF MS-spectra-kwaliteit sterk afhankelijk van de data acquisitie parameters en bereiding van de monsters. Hoewel er geen vaste formule voor de bereiding van de monsters is, zorgt inzicht in de functie van elke component van de bereiding van de monsters voor een snellere empirische optimalisatie. De belangrijkste factor in de bereiding van de monsters van de MALDI is selectie van de matrix, omdat de compatibiliteit van de matrix met de analyt polymeer is van cruciaal belang voor het toestaan van opgewonden matrix voor het genereren van één, gedesorbeerde macromoleculen in een geïoniseerd staat5, 15,17,19. Zodra de geschikte matrix en cationization agenten hebt geselecteerd, moet de juiste verhouding van de agent van de analyt, matrix, en cationization worden bepaald. Dit kan worden bereikt empirisch door het creëren van een tweedimensionaal raster van monsters (Figuur 1) op de MALDI-TOF MS doelwit plaat (Figuur 2) met toenemende matrix concentratie op één as en toenemende cationization agent concentratie op de andere.
Net als bij de bereiding van de monsters van de MALDI, er is geen vaste formule voor het bepalen van de data acquisitie parameters; echter, moeten bepaalde tendensen worden beschouwd voor het versnellen van de spectrale optimalisatie. Reflectron modus, die resolutie verhoogt maar totale signaal vermindert, wordt meestal gekozen voor lagere massa bereiken (in deze voorbeelden hieronder 4.000 Da) waar isotopische resolutie kan worden bereikt. In deze gevallen, werden exacte massa berekeningen en piek plukken methoden gebruikt. Voor de monsters van polymeer met massa’s boven 4.000 Da, werd lineair modus gebruikt met gemiddelde massa berekeningen en piek plukken methoden. Ter verbetering van de resolutie van het signaal, de ion bron spanningen moeten worden aangepast in kleine stappen met de algemene tendens van grotere massa polymeren met een grotere spanning differentiële (IS1 versus IS2).
Tijdje geoptimaliseerd monstervoorbereiding en overname parameters kunnen precisie, massale nauwkeurigheid kan alleen worden bereikt door middel van effectieve kalibratie. De time-of-flight voor een bepaalde massa subtiel met betrekking tot de verwerving van de variabele parameters en zelfs plaat posities kan variëren, daarom een kalibratie moet worden uitgevoerd voor elke set van geoptimaliseerde overname parameters om de opbrengst van nauwkeurige massa vaststellingen5,30. Zodra de overname parameters en de bereiding van de monsters zijn geoptimaliseerd, moeten de spectra worden gekalibreerd met behulp van deze exacte dezelfde voorwaarden.
Vanwege de buitengewone resolutie en massale nauwkeurigheid waargenomen in de geoptimaliseerde MALDI-TOF massa spectra van polymeren, deze techniek uitgegroeid tot een waardevol gratis hulpmiddel voor het bepalen van polymeer massaverdeling gegevens. Haar vermogen om op te lossen van afzonderlijke herhalen eenheden binnen de verdeling van de massa polymeer biedt echter een bijzonder voordeel ten opzichte van andere polymeer p.a. eind groep karakterisering technieken zoals gelpermeatiechromatografie (GPC) en nucleaire magnetische resonantie (NMR). Dit is met name waardevol voor het bepalen van de trouw van eind groep functionalization reacties en de kwantitatieve aard van eind groep vervoegingen reacties. Dit manuscript is gebleken de mogelijkheid om op te lossen van de massa van individuele polymeer herhalen eenheden met maximaal twee decimalen punten van massale nauwkeurigheid, waardoor de bevestiging van einde groep wijzigingen met een hoge mate van vertrouwen. Met de aanzienlijke vooruitgang die onlangs zijn gedaan op het gebied van precisie polymeer synthese, MALDI-TOF MS wordt een steeds belangrijker instrument voor het bepalen van macromoleculaire structuur en functionaliteit.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen dat het slimme materialen ontwerp, analyse en verwerking consortium (SMATDAP) gefinancierd door de National Science Foundation onder samenwerkingsovereenkomst IIA-1430280 en de LA Raad van regenten voor een graduate fellowship (MEP). Polymeer monsters voor deze experimenten werden verstrekt door MilliporeSigma (Sigma-Aldrich). Open Access publicatie van dit artikel wordt gesponsord door MilliporeSigma.
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 689696 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US |
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 757918 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US |
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500) | MilliporeSigma (Aldrich) | 747386 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide low | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS20 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide medium | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS21 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide high | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS22 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US |
2,4 dinitrofluorobenzene | TCI | A5512 | |
maleimide | MilliporeSigma (Aldrich) | 129585 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US |
1-ethynylfluorobenzene | Fisher Scientific | 766-98-3 | |
triethylamine | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 471283 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US |
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine | MilliporeSigma (Aldrich) | 369497 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US |
Copper(I)Bromide | MilliporeSigma (Aldrich) | 254185 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US |
glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38212 | |
sodium metabisulfite | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 13459 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US |
potassium trifluoroacetate | MilliporeSigma (Aldrich) | 281883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US |
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile | MilliporeSigma (Aldrich) | 727881 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US |
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid | MilliporeSigma (Sigma) | C8982 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US |
tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T425-1 | |
dichloromethane | VWR Analytical | BDH1113-4LG |