샘플 준비, 스펙트럼 획득 및 데이터 분석의 최적화를 포함 하 여 합성 고분자의 질량 분석 (MS MALDI TOF) 특성을 설명 하는 비행의 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 시간에 대 한 프로토콜.
합성 homopolymers의 특성에 사용할 수 있는 많은 기술이 있다 그러나 몇 가지 유용한 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 시간의 비행 질량 분석 (MS MALDI TOF) 끝 그룹 분석에 대 한 정보 제공. 이 자습서의 샘플 준비, 스펙트럼 수집, 최적화에 대 한 메서드를 보여 줍니다 및 견본 준비 동안 MALDI TOF 양 중요 한 매개 변수를 사용 하 여 합성 고분자의 데이터 분석, 매트릭스의 선택을 포함 적절 한 cationization 소금 및 행렬, 양이온, 및 분석의 상대적 비율 조정의 식별. 인수 매개 변수 모드 등 (선형 또는 반사), 편광 (양수 또는 음수), 가속 전압 및 지연 시간, 중요 한도 있습니다. 화학 합성 고분자 및 데이터 수집 매개 변수 및 예제 준비 조건 최적화 관련 된 지식이 주어진 스펙트럼 얻을 수 있어야 충분 한 해상도와 대량 정확도 명확한 수 있도록 반복 단위 뿐만 아니라 대부분 homopolymers (10000 아래 대 중)의 끝 그룹의 질량 및 전반적인 분자량 분포. 고분자의 제한 된 집합에 설명, 비록 끝 그룹 결정은 좁은 dispersity와 homopolymers에 대 한 가능 하지만 이러한 일반적인 기법을 질량 분포를 결정 하기 위한 합성 고분자의 훨씬 넓은 범위에 적용 됩니다.
생활 개선 중 합 기술, 정밀 고분자 양적 기능성된 끝 그룹은 점점 더 사용할 수 있는1. 아 지 드 alkyne 및 thiolene 클릭 화학의 동시 개발 활성화 고분자 하이브리드 재료2,3,4의 범위에 대 한 액세스를 제공 하는 다른 moieties에의 약 양적 커플링 . 그러나, 정확한 분석 기법 모두 시작 자료와이 폴리머 활용 반응의 제품을 특성화 해야 합니다. 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (MS MALDI TOF)은 최소 하나의 충전 상태에서 폴리머 이온을 생성할 수 있기 때문에 고분자 특성화에 대 한 귀중 한 부드러운 이온화 분석 기술 조각화5,6. MALDI TOF MS 폴리머 대량 유통 내 개별 n mers의 해상도 가진 질량 스펙트럼을 제공할 수 있기 때문에 고분자 특성의 다른 기존의 방법에 비해 주요 이점이 있다. 결과적으로, 같은 질량 스펙트럼 평균 분자량에 대 한 정확한 정보를 제공할 수, 단위 질량, 및 분자량 dispersity7, 차례로 전송 체인8 등 경쟁 중 합 메커니즘을 명료 수 있는 반복 . 그러나, MALDI TOF MS는 특히 강력한 폴리머 끝 그룹9,10, 끝 그룹 수정10,11 를 확인 하는 데 사용할 수 있습니다에 대 한 정보를 제공 하 고 다른 변환12 폴리머 cyclizations11,13등. 똑같이 중요 한, 상대적으로 적은 양의 분석 (서브-마이크로 그램)에 필요한 대량 spectrometric 분석 하면이 기술을 특성화에 대 한 유용한 유일한 재료 양의 추적 사용할 수 있습니다.
고분자의 MALDI TOF MS 분석 4 명료한 단계로 분할 될 수 있다: 준비, 장비 교정, 스펙트럼 수집 및 데이터 분석. 샘플 준비 이며 생성 하기 위한 가장 중요 한 단계 MALDI TOF 질량 스펙트럼에 최적화 된 샘플은 악기14,15에 도입 되기 전에 발생 합니다. 고분자 분석으로 유사한 가용성 매개 변수를 적절 한 매트릭스의 선택은 고품질 MALDI TOF 질량 스펙트럼을 얻기 위해 중요 한 고 매트릭스 선택에 대 한 지침14,15, 다른 곳에서 보고 16,17. 폴리머 MALDI 시료 준비에 대 한 “조리법”의 데이터베이스 또한 출판된 온라인18있다. 새로운 폴리머 매트릭스 선택 첫 번째 고분자의 용 해도 이해 유사한 가용성 매개 변수14,19행렬을 선택 하 여 접근 수 있다. 높은 양성자 선호도 고분자 protonated 대부분 행렬14 (이 자주 carboxylic 산 그룹 포함), 수 있지만 다른 폴리머 cationization 에이전트는 필요한14. 알칼리 이온 포함 하는 산소와 잘 adduct 종 (예. 폴리에스터 및 polyethers), 불포화 탄화수소 (예. 폴리스 티 렌) 전이 금속은과 구리 이온14, 와 adduct 19. 등뼈에 산소 원자를 포함 하는이 실험에서 폴리머 샘플, 때문에 나트륨 또는 칼륨 trifluoroacetate (TFA) cationization 요원으로 사용 되었다. 일단 행렬 및 cationization 에이전트를 선택 분석, 양이온 에이전트, 그리고 매트릭스의 상대적 비율 높은 신호 잡음을 보장 하기 위해 신중 하 게 낙관 되어야 한다. 그러나이 절차에서는 샘플 준비에 대 한 매개 변수는 이미 최적화 된, 실험 샘플 최적화 절차 (단계 1.4.1., 그림 1)을 체계적으로 세 가지 구성 요소 (분석의 농도 변화 매트릭스와 양이온) 급속 하 게 그들의 최적 비율을 결정 하는 데 효과적 이다.
데이터 수집에는 매개 변수 수의 최적화를 필요합니다. 가장 중요 한 매개 변수는 분석기의 포지티브 또는 네거티브 이온 모드, 악기의 동작 모드 (선형 반사 체 대), 가속 전압 및 추출 지연 시간을 포함합니다. 해상도 증가 시킬 수 있다 또 다른 방법은 “reflectron” 모드20,21,,2223의 활용을 통해 이다. Reflectron 모드 본질적으로 다시 바꾸고 이온 다른 momentums와 함께 하는 동안 소스 근처 검출기 향해 비행 튜브의 끝에 이온을 반영 하 고 따라서 비록 해상도 증가 하 여 검출기에 이온의 비행 경로 두 배로 신호 강도 감소. 또한, 더 높은 해상도 스펙트럼 수와 충돌의 에너지를 감소 시키고 따라서 조각화 및 키네틱 이질성24신호 대 잡음 비율을 최소화 하는 레이저 파워를 감소 하 여 얻을 수 있습니다. 모든 이러한 매개 변수를 조정, 이온 초기 위치 또는 레이저 탈 착 과정에서 발생 하는 속도에 있는 이질성의 효과 최소화 하기 위해 집중 될 수 있습니다. 인수 매개 변수는 최적화 될 때 동위 해상도 자주 얻을 수 있습니다 10000 다 이상의 질량을 가진 이온에 대 한 비록 이것이 또한 악기 디자인과 비행 튜브의 길이 따라 다릅니다. 적어도 하나의 heteroatom 포함 하는 대부분의 유기 화합물 complexing 리튬, 나트륨, 칼륨 등 알칼리 양이온으로 하는 경향이 있다. 알칼리 금속 많은 monoisotopes 또는 제한 된 동위의 따라서 분포 확대 하지 않습니다.
악기 매개 변수 데이터 정밀도 최적화 하기 위해 조정 될 수 있다, 하는 동안 데이터 정확도 적절 한 교정11만 달성 된다. 단백질 및 펩 티 드 그들의 monodispersity 및 가용성, calibrants로 원래 이용 되었다 그러나 가변 안정성과 불순물25의 유행에서. 더 비용 효율적이 고 안정적인 대안 무기 클러스터와 polydisperse 고분자26,27,,2829를 포함 했다. 불행히도, 이러한 대안 기능 복잡 하 게 더 작은 질량으로 대량 할당, 전반적으로, 그들을 교정 10000 다 아래에 유용 하 중 분산. 이 대처 하기 위해, 그레이 외문제. 25 는 dendrimer 기반, 폴 리 에스테 MS 교정 시스템을 개발 단 분산, 그리고 둘 다 광범위 한 매트릭스 및 용 매 호환성, 선반 수명 안정성 (> 8 년), 그리고 낮은 생산 비용을 자랑. 이 시스템의 강점을 바탕으로, 그것은 이러한 실험에 대 한 calibrant로 선정 됐다.
교정의 두 가지 주요 유형이 있다: 내부와 외부30. 외부 보정, 대괄호는 분석의 질량을 가진 표준 교정 파일을 생성할 수 있는 별도 질량 스펙트럼을 생성 하는 분석 보다 다른 샘플 위치에 MALDI 표적 격판덮개에 배치 됩니다. 다른 한편으로, 높은 정확도를 calibrant 및 분석 신호 하이브리드 스펙트럼 분석으로는 calibrant 혼합을 포함 하는 내부 캘리브레이션 자주 얻을 수 있습니다. 아래 설명 된 절차에는 외부 교정 구현 되었습니다. 대량 규모의 적절 한 교정, 후 정확한 분석 대량 데이터 취득 될 수 있다. 가장 정확한 구경 측정을 위해 데이터 수집 보정 후 곧 발생 하는 것 중요 하다.
마지막으로, 일단 최적화, 보정 데이터 세트 인수 했다, 그리고 폴리머 샘플에 대 한 구조 정보를 제공 하는 데이터 분석 했다. 폴리머 분포 내에서 n-메 사이의 간격 반복 단위의 정확한 측정을 제공할 수 있다 질량. 수 평균 분자량 (Mn) 및 기타 대량 메일 계산 (예를 들어, Mw (중량 평균 분자량) 및 Đ (dispersity)) 또한 질량 스펙트럼 (에서 신호 분배에서 결정 될 수 있다 4.2 계산 단계). 아마도 가장 독특한, homopolymers, 경우 끝 그룹의 합계 확인할 수 있습니다 혼자 반복 단위의 질량에 관하여 폴리머 분포의 오프셋을 결정 하 여. 크기 배제 크로마토그래피, 푸리에 변환 적외선 분광학, 등 전통적인 폴리머 특성화 기법을 보완 하는 귀중 한 특성 데이터를 제공 하는 풍부한 정보 MALDI TOF 질량 스펙트럼 및 핵 자기 공명입니다.
TOF MALDI 질량 분석은 최소한의 조각화와 단독으로 충전된 상태에서 폴리머 이온을 생성 하는 기능 고분자 특성에 대 한 귀중 한 분석 도구. 이 부드러운 이온화 기술을 복합 가스 단계에서 폴리머 이온을 생성 하는 매트릭스에 포함 된 고분자 분석의 고체 샘플을 desorb를 짧은 레이저 펄스를 사용 합니다. 고분자는 질량 분석에 의해 그들의 분석 매트릭스에 추가 된 양이온과 complexation에 의해 일반적으로 이온화 된다. 이 고분자 이온은 다음 그들의 시간–비행의 이온 소스 및 탐지기5 사이 따라 결정 됩니다 그들의 m/z 를 사용할 수 있는 비행 관의 분야 자유로운 지역으로 그들을가지고 추출 전압에 의해 가속 , 32.
다른 폴리머 특성화 기법에 비해, MALDI TOF MS 스펙트럼 품질이 데이터 수집 매개 변수 및 예제 준비에 크게 의존 합니다. 샘플 준비를 위한 설정 공식은 없습니다, 비록 샘플 준비의 각 부품의 기능을 이해 더 빠른 경험적 최적화 할 수 있습니다. MALDI 시료 준비의 가장 중요 한 요소 이므로 매트릭스의 선택을 호환성 매트릭스의 폴리머 분석을 흥분된 매트릭스 이온된 상태5, 싱글, desorbed 고분자를 생성 하는 허용을 위한 중요 한 15,,1719. 일단 적절 한 매트릭스 및 cationization 에이전트를 선택 분석, 매트릭스, 그리고 cationization 에이전트의 올바른 비율을 결정 합니다. 이것은 경험적으로 한 축에 매트릭스 농도 증가에 cationization 에이전트 농도 증가와 MALDI TOF MS 대상 접시 (그림 2)에 (그림 1) 샘플의 2 차원 격자를 생성 하 여 얻을 수 있는 다른.
MALDI 시료 준비와 마찬가지로, 공식은 설정 데이터 수집 지정 매개 변수를 결정 하기 위한 그러나, 특정 동향 스펙트럼 최적화를 신속 하 게 고려해 야 합니다. Reflectron 모드, 해상도 증가 하지만 전반적인 신호 감소, 일반적으로 동위 해상도 얻을 수 있습니다 (이 예제에서 4000 다 아래)에 낮은 질량 범위에 대 한 선택 됩니다. 이러한 경우 monoisotopic 질량 계산 및 피크 따기 방법 사용 되었다. 4000 다 위에 질량을 가진 폴리머 샘플에 대 한 선형 모드 평균 질량 계산 및 피킹 따기 방법 사용 되었다. 신호 해상도 개선, 더 큰 전압 차동 데 큰 대량 고분자의 일반적인 추세와 작은 단위로 이온 소스 전압을 조정 (IS1 IS2 대).
샘플 준비 및 수집을 최적화 하는 동안 매개 변수는 정밀도 제공할 수 있습니다, 대량 정확도 효과적인 교정을 통해 달성 될 수 있다. 주어진된 질량에 대 한 비행의 시간 가변 인수 매개 변수 및 심지어 접시 위치 미묘 하 게 다를 수 있습니다, 그리고 따라서는 보정을 수행 각 최적화 된 인수 매개 변수 집합에 대 한 정확한 질량을 산출 하기 위해 결정5,30. 일단 인수 매개 변수 및 예제 준비 최적화 되어, 스펙트럼이 정확한 동일한 조건을 사용 하 여 보정 한다.
뛰어난 해상도 고분자의 최적화 된 MALDI TOF 질량 스펙트럼에서 관찰 하는 대량 정확도 때문에이 기술은 폴리머 대량 유통 데이터를 결정 하기 위한 유용한 무료 도구 되고있다. 그러나, 폴리머 대량 유통 내 개별 반복 단위를 해결 하는 능력 특정 이점 분석을 위한 제공 끝 그룹 다른 폴리머를 기준으로 젤 투과 크로마토그래피 (GPC) 등 특성화 기법 및 핵 자기 공명 (NMR) 이것은 특히 끝 그룹 기능화 반응의 충실도 및 끝 그룹 활용형 반응의 양적 성격을 결정 하기 위한 중요 합니다. 이 원고는 대량 정확도, 신뢰의 높은 수준의 끝 그룹 수정 확인 가능 최대 두 개의 소수 포인트로 개별 고분자 반복 단위의 질량을 해결 하는 능력을 보여 주었다. 정밀 고분자 합성 분야에서 최근 수행 된 실질적인 진보 MALDI TOF MS는 점점 더 중요 한 도구가 되고있다 결정 고분자 구조와 기능.
The authors have nothing to disclose.
저자는 스마트 재료 설계, 분석 및 처리 컨소시엄 (SMATDAP)에 의해 자금 국립 과학 재단 협력 계약 IIA-1430280와 라 보드 Regents의 대학원 친교 (MEP)에 대 한 인정 합니다. 이러한 실험에 대 한 폴리머 샘플 MilliporeSigma (시그마-올드 리치)에 의해 제공 되었다. 오픈 엑세스 출판이 문서는 MilliporeSigma에 의해 후원 됩니다.
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 689696 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US |
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 757918 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US |
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500) | MilliporeSigma (Aldrich) | 747386 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide low | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS20 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide medium | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS21 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide high | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS22 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US |
2,4 dinitrofluorobenzene | TCI | A5512 | |
maleimide | MilliporeSigma (Aldrich) | 129585 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US |
1-ethynylfluorobenzene | Fisher Scientific | 766-98-3 | |
triethylamine | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 471283 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US |
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine | MilliporeSigma (Aldrich) | 369497 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US |
Copper(I)Bromide | MilliporeSigma (Aldrich) | 254185 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US |
glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38212 | |
sodium metabisulfite | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 13459 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US |
potassium trifluoroacetate | MilliporeSigma (Aldrich) | 281883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US |
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile | MilliporeSigma (Aldrich) | 727881 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US |
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid | MilliporeSigma (Sigma) | C8982 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US |
tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T425-1 | |
dichloromethane | VWR Analytical | BDH1113-4LG |