פרוטוקול עבור לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS) אפיון של פולימרים סינתטיים מתואר כולל אופטימיזציה של הכנת הדוגמא, רכישת ספקטרלי וניתוח נתונים.
קיימות שיטות רבות, זה יכול להיות מועסק באפיון homopolymers סינתטי, אך מעטים לספק שימושי של מידע לצורך סיום הקבוצה ניתוח לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS). ערכת לימוד זו מדגימה שיטות אופטימיזציה של הכנת המדגם, רכישת ספקטרלי, ניתוח נתונים של פולימרים סינתטיים באמצעות פרמטרים גב’ MALDI-TOF קריטית במהלך הכנת הדוגמא כוללים את הבחירה של המטריצה, זיהוי של מלח cationization המתאים ולאחר כוונון של כמויות יחסיות של מטריקס, הקטיון, analyte. הפרמטרים רכישה, כגון מצב (ליניארי או צלחת לוויין), קיטוב (חיובי או שלילי), האצת מתח, זמן ההשהיה, חשובים גם. בהתחשב קצת ידע של הכימיה מעורב לסנתז הפולימר ומיטוב הפרמטרים רכישת הנתונים והן את התנאים הכנת המדגם, ספקטרה צריכה להתקבל עם רזולוציה מספיק ודיוק המונית כדי לאפשר את ברורה וחד משמעית הנחישות של קבוצות הקצה של רוב homopolymers (גושים מתחת 10,000) בנוסף אני חוזר ליחידה מסה וחלוקת משקל מולקולרי הכללית. למרות הפגינו על קבוצה מוגבלת של פולימרים, שיטות כלליות אלה ניתנים ליישום טווח רחב של פולימרים סינתטיים לקביעת הפצות המוני, למרות סיום קבוצה נחישות אפשרי רק עבור homopolymers עם dispersity הצר.
עם שיפורים חי הפילמור טכניקות, דיוק פולימרים עם קבוצות הקצה באופן כמותי functionalized הם יותר ויותר זמין1. פיתוח מקביל של אזיד-אלקין, thiolene לחץ על בדיקות, הביוכימיה אפשרה את צימוד כמעט כמותית של מקרומולקולות כדי moieties אחרים, מתן גישה למגוון של היברידית חומרים2,3,4 . עם זאת, שיטות אנליטיות מדויק נדרשים לאפיין המוצא חומרים והן מוצרים של תגובות אלו ההטיה פולימר. לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS) היא טכניקה אנליטי יינון רך בעל ערך עבור אפיון פולימרים כי זה יכול ליצור פולימר יונים במצב תשלום יחיד עם מינימלי פיצול5,6. MALDI-תוף MS יש יתרונות חשובים כל השיטות המקובלת של פולימר אפיון כי זה יכול לספק ספקטרה המוני עם רזולוציה של n-שהרובוט בודדים בתוך התפלגות מסה של פולימר. כתוצאה מכך, ספקטרה המוני כזה יכול לספק מידע מדויק על משקל מולקולרי הממוצע, לחזור ליחידת מסה, משקל מולקולרי dispersity7, אשר בתורו יכול להבהיר את מנגנוני הפילמור מתחרות כגון שרשרת העברת8 . עם זאת, MALDI-TOF MS הוא עוצמה לספק מידע אודות פולימר סוף קבוצות9,10, אשר יכול לשמש כדי לאשר סוף קבוצה שינויים10,11 במיוחד, אחרים המרות12 כמו פולימר cyclizations11,13. לא פחות חשוב, כמות קטנה יחסית של analyte (sub-מיקרוגרם) הדרושים עבור המוני spectrometric ניתוח גורם טכניקה זו שימושית עבור אפיון כאשר רק כמויות עקבות של חומר זמינים.
ניתוח MALDI-TOF MS של פולימרים יכול להיות מחולק לארבעה שלבים נפרדים: לטעום הכנה, כיול מכשיר, רכישת ספקטרלי וניתוח נתונים. הכנת הדוגמא היא צעד חיוני ביותר ליצירת ממוטב MALDI-TOF ספקטרה המוני מתרחש לפני המדגם מוחדרים לכלי ה-14,15. הבחירה של מטריקס המתאים עם פרמטרים דומים מסיסות פולימר analyte הוא קריטי כדי להשיג באיכות גבוהה MALDI-TOF המוני ספקטרה, קווים מנחים לבחירת מטריקס היה דיווח במקום14,15, 16,17. מסד נתונים של פולימר MALDI “מתכונים” הכנת הדוגמא היה גם שפורסם באינטרנט18. עבור הרומן פולימרים, ניתן לצפות מטריקס הבחירה הראשונה להבנת המסיסות של הפולימר, בחירת מטריצה עם דומה מסיסות פרמטרים14,19. פולימרים עם זיקה גבוהה פרוטון יכול להיות protonated על ידי רוב מטריצות14 (אשר לעתים קרובות מכילים חומצה קרבוקסילית קבוצות), אבל עבור פולימרים אחרים, סוכן cationization הוא נדרש14. אלקלי יונים adduct טוב עם המכיל חמצן מינים (למשל. פוליאסטר ו- polyethers), ואילו פחמימנים רוויים (למשל-פוליסטירן) adduct עם המעבר מתכות כמו נחושת וכסף יונים14, 19. כי הדגימות פולימר בניסוי זה הכיל אטומי חמצן עמוד השדרה, trifluoroacetate נתרן או אשלגן (TFA) שימשו את סוכן cationization. ברגע מטריקס ו- cationization הסוכנים נבחרו, כמויות יחסיות של analyte, הסוכן הקטיון מטריקס חייב להיות בקפידה ממוטב כדי להבטיח גבוהה אות רעש. בהליך זה, הפרמטרים עבור הכנת הדוגמא שכבר מוטבו, אולם הליך אופטימיזציה מדגם אמפיריים (שלב 1.4.1., איור 1) זה משתנה באופן שיטתי את ריכוזי שלושת המרכיבים (analyte, מטריקס והקטיון) יעיל לקביעת יחסי אופטימלית שלהם במהירות.
חדרי קירור והקפאה דורש גם אופטימיזציה של מספר פרמטרים. הפרמטרים החשובים ביותר כוללים את מצב יון חיובי או שלילי של ספקטרומטר, את מצב הפעולה המכשיר (לינארית לעומת רפלקטור), המתח האצת את זמן ההשהיה החילוץ. דרך נוספת כי ניתן להגדיל רזולוציה היא דרך הניצול של “reflectron” מצב20,21,22,23. Reflectron מצב למעשה מכפיל את נתיב הטיסה של היונים את הגלאי על ידי המשקף היונים בסוף הצינור טיסה בחזרה לעבר גלאי ליד המקור תוך refocusing יונים עם momentums שונים, ולכן להגדיל את הרזולוציה למרות הפחתת עוצמת האות. בנוסף, ספקטרה ברזולוציה גבוהה ניתן להשיג על ידי הפחתת את עוצמת הלייזר אשר ממזער את יחס אות לרעש מאת להקטין את מספר ואת האנרגיה של התנגשויות, ולכן הפחתת פיצול של inhomogeneities קינטי24. על-ידי כוונון כל הפרמטרים הללו, ניתן למקד את היונים כדי לצמצם את ההשפעה של כל inhomogeneity ראשונית או מהירות המתרחשת במהלך תהליך desorption לייזר. כאשר הפרמטרים רכישה מיטביות, רזולוציה איזוטרופי לעתים קרובות ניתן להשיג עבור יונים עם גושים מעל 10,000 דא, למרות שזה גם תלוי אורך הצינור טיסה, עיצוב כלי נגינה. תרכובות אורגניות ביותר המכילות heteroatom אחת לפחות נוטים complexing עם אלקליות קטיונים כגון ליתיום, נתרן, אשלגן. רבים מתכות אלקליות הם monoisotopes או של איזוטופים מוגבלת, ולכן לא להרחיב את ההתפלגות.
אמנם ניתן לכוונן את הפרמטרים כלי כדי למטב את דיוק הנתונים, דיוק המידע מושגת רק עם כיול המתאים11. חלבונים ופפטידים שימשו במקור calibrants עקב monodispersity והזמינות שלהם, אבל סובלים השכיחות של זיהומים25והיציבות משתנה. חלופות חסכונית ויציב יותר כללו אשכולות אורגניים, polydisperse פולימרים26,27,28,29. למרבה הצער, אלה תכונה חלופות לפזר את ההמונים, אשר לסבך הקצאות המונית, כמו גם גושים קטנים יותר באופן כללי, שהופך אותם שימושיים רק עבור ולידציות מתחת 10,000 Da. כדי להתמודד עם בעיות אלה, גרייסון ואח. 25 פיתח מבוססי דנדרימר פוליאסטר MS כיול מערכת, monodisperse, ויש מתגאה מטריקס רחבה, תאימות הממס, יציבות חיי מדף (> 8 שנים) וגם עלות הייצור נמוכה יותר. זה מבוסס על החוזק של מערכת זו, נבחר את calibrant עבור ניסויים אלה.
ישנם שני סוגים עיקריים של כיול: פנימי וחיצוני30. כאשר מכייל מבחוץ, תקן עם ההמונים, כי סוגר של analyte ממוקמים על הצלחת היעד MALDI בעמדה דגימה שונים מאשר analyte כדי ליצור קשת המונית נפרד שממנו ניתן להפיק קובץ כיול. מצד שני, לעיתים קרובות ניתן להשיג דיוק רב יותר עם כיול פנימי, אשר כוללת ערבוב של calibrant עם analyte כדי להשיג מנסרה היברידית עם אותות הן calibrant והן analyte. בהליך המתואר להלן, יושם על כיול חיצוניים. לאחר כיול נאותה של הסולם המוני, ניתן לרכוש analyte מדויק מסה נתונים. כדי להבטיח את הכיול המדויקות ביותר, חשוב כי רכישת נתונים מתרחשת זמן קצר לאחר הכיול.
בסופו של דבר, ברגע מכויל ממוטבת, ערכות נתונים נרכשו, הנתונים נותחו לספק מידע מבניים על הדגימות פולימר. המרווח בין n-שהרובוט בתוך ההתפלגות פולימר יכול לספק מדידה מדויקת של היחידה החוזרת המוני. מספר ממוצע משקל מולקולרי (Mn) ועוד המוני חישובי התפלגות (למשל, Mw (משקל משקל מולקולרי הממוצע) Đ (dispersity)) יכול להיקבע גם התפלגות אות ב (ספקטרה המונית שלב 4.2 עבור חישובים). אולי באופן ייחודי ביותר, במקרה של homopolymers, הסכום של ההמונים קבוצה סוף יכול להיות מאושרות על ידי קביעת ההיסט של ההתפלגות פולימר ביחס המסה של יחידות חוזרות לבד. מידע עשיר MALDI-TOF המוני ספקטרום לספק נתונים יקרי ערך אפיון אינם משלימים מסורתיים יותר טכניקות אפיון פולימרי כגון גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה, פורייה-ספקטרוסקופיית, ו תהודה מגנטית גרעינית.
MALDI-תוף ספקטרומטר מסה הוא כלי אנליטי רב ערך עבור פולימר אפיון בשל יכולתה ליצור פולימר יונים במדינה ביחידים טעון עם פיצול מינימלי. טכניקה זו יינון רך מנצל פעימות לייזר קצר כדי מפסידה solid-state דוגמאות analyte פולימריים מוטבע בתוך מטריצה מורכבת כדי ליצור פולימר יונים בשלב גז. מקרומולקולות הם בדרך כלל מיונן מאת complexation עם קטיונים הנוספים אל המטריקס כדי לאפשר ניתוח שלהם באמצעות ספקטרומטר מסה. יונים macromolecular האלה ואז הם מואצת של מתח החילוץ כדי להביא אותן לתוך האזור ללא שדה של הצינור טיסה המאפשרים שלהם מ/z נקבע בהתבסס על הזמן-של-הטיסה שלהם בין המקור יון גלאי5 , 32.
לעומת טכניקות אפיון אחרות פולימר, איכות ספקטרה MALDI-TOF MS היא תלויות מאוד פרמטרים רכישת נתונים, הכנת הדוגמא. למרות שיש נוסחה קבע עבור הכנת הדוגמא, הבנת את הפונקציה של כל רכיב של הכנת המדגם מאפשר אופטימיזציה אמפירי מהירה יותר. הגורם החשוב ביותר הכנת הדוגמא MALDI הוא הבחירה של המטריקס כי תאימות של המטריצה פולימר analyte הוא קריטי עבור המאפשר מטריקס נרגש לייצר מקרומולקולות יחיד, desorbed המדינה מיונן5, 15,17,19. ברגע המתאים סוכנים מטריקס ו- cationization נבחרו, היחס הנכון בין הסוכן analyte, מטריקס, cationization צריכה להיקבע. אפשר להשיג מדעית על-ידי יצירת רשת דו-ממדית של דגימות (איור 1) על הצלחת המטרה MALDI-TOF MS (איור 2) עם הגדלת ריכוז מטריקס על ציר אחד, הגדלת ריכוז הסוכן cationization אחרים.
בדומה הכנת הדוגמא MALDI, יש נוסחה set לקביעת פרמטרים רכישת נתונים; עם זאת, יש לשקול מגמות מסוימות כדי לזרז אופטימיזציה ספקטרלי. מצב Reflectron, אשר מגביר את הרזולוציה אך מפחית את האות הכללית, נבחר בדרך כלל נמוך טווחי המוני (בדוגמאות אלה, להלן 4,000 Da) היכן ניתן להשיג רזולוציה איזוטרופי. במקרים אלה, שימשו שיא אוסף שיטות וחישובים המונים monoisotopic. לקבלת דוגמאות פולימר עם גושים מעל 4,000 Da, שימש מצב לינארי עם חישובים המונית הממוצע ושיטות האיסוף לשחקנים. כדי לשפר את האות רזולוציה, החשמלי מקור יון צריך להיות מותאם במרווחים קטנים עם המגמה הכללית של פולימרים המונים גדול יותר יש מתח גדול יותר דיפרנציאלית (IS1 לעומת IS2).
זמן מיטבי הכנת הדוגמא ורכישה פרמטרים יכולה לספק דיוק, דיוק מסת תושג רק באמצעות כיול יעיל. הזמן-של-טיסה מסה נתון יכול להשתנות בעדינות הפרמטרים רכישה משתנה, אפילו צלחת עמדות, לכן כיול צריכה להתבצע עבור כל ערכה של רכישת ממוטבת פרמטרים על-מנת לתת מסה מדויק האישושים5,30. לאחר רכישת פרמטרים של הכנת הדוגמא מוטבו, צריך להיות מכויל הספקטרום אלה בדיוק באותם התנאים.
בגלל רזולוציה יוצאת דופן דיוק מסת שנצפתה ספקטרום המוני MALDI-TOF אופטימיזציה של פולימרים, טכניקה זו הפכה כלי חינם חשוב לקביעת פולימריות ההפצה ההמונית נתונים. עם זאת, היכולת שלו לפתור יחידות נפרדות אני חוזר תוך התפלגות מסה של פולימר מספק יתרון מסוים סוף ניתוח הקבוצה ביחס פולימר אחרות אפיון טכניקות כגון ג’ל הסתננות כרומטוגרפיה (GPC) הגרעינית תהודה מגנטית (NMR). . זה יקר במיוחד לקביעת את הנאמנות של סיום קבוצה functionalization תגובות והטבע כמותית של סיום קבוצה ההטיות תגובות. כתב היד הזה הוכיח את היכולת לפתור את המסה של פולימר בודדים יחידות אני חוזר עם נקודות לשתי ספרות עשרוניות של דיוק המוני, הפעלת האישור של סיום קבוצה שינויים עם רמה גבוהה של ביטחון. עם ההתקדמות ניכר שנעשו לאחרונה בתחום של דיוק פולימר סינתזה, MALDI-TOF MS הופך להיות כלי חשוב יותר ויותר בשביל לקבוע מבנה macromolecular ופונקציונליות.
The authors have nothing to disclose.
המחברים להכיר שהאיחוד עיצוב חומרים חכמים, ניתוח ועיבוד (SMATDAP) הממומן על ידי הקרן הלאומית למדע במסגרת הסכם שיתוף פעולה IIA-1430280 וההנהלה LA עבור מלגת תואר שני ושלישי (חבר הפרלמנט האירופי). פולימר דוגמאות לניסויים אלה נמסרו על ידי MilliporeSigma (סיגמה-אולדריץ). פרסום גישה פתוחה של מאמר זה היא בחסות MilliporeSigma.
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 689696 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US |
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 757918 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US |
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500) | MilliporeSigma (Aldrich) | 747386 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide low | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS20 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide medium | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS21 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide high | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS22 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US |
2,4 dinitrofluorobenzene | TCI | A5512 | |
maleimide | MilliporeSigma (Aldrich) | 129585 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US |
1-ethynylfluorobenzene | Fisher Scientific | 766-98-3 | |
triethylamine | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 471283 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US |
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine | MilliporeSigma (Aldrich) | 369497 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US |
Copper(I)Bromide | MilliporeSigma (Aldrich) | 254185 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US |
glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38212 | |
sodium metabisulfite | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 13459 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US |
potassium trifluoroacetate | MilliporeSigma (Aldrich) | 281883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US |
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile | MilliporeSigma (Aldrich) | 727881 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US |
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid | MilliporeSigma (Sigma) | C8982 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US |
tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T425-1 | |
dichloromethane | VWR Analytical | BDH1113-4LG |