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Immunology and Infection

Extracción de hemocitos de larvas de Drosophila melanogaster para infección microbiana y análisis

Published: May 24, 2018
doi:
10.3791/57077
, ,
1School of Molecular Biosciences, College of Veterinary Medicine,Washington State University, 2Integrative Physiology and Neuroscience, College of Veterinary Medicine,Washington State University

Summary

Este método muestra cómo visualizar la invasión del patógeno en las células de los insectos con modelos tridimensionales (3D). Hemocitos de larvas de Drosophila estaban infectadas con patógenos virales o bacterianos, o ex vivo o en vivo. Hemocitos infectados luego fijados y teñidos para la proyección de imagen con un microscopio confocal y la posterior reconstrucción celular 3D.

Abstract

Durante la infección patógena de Drosophila melanogaster, hemocitos juegan un papel importante en la respuesta inmune durante la infección. Así, el objetivo de este protocolo es desarrollar un método para visualizar la invasión del patógeno en un compartimiento inmune específico de las moscas, es decir, hemocitos. El método presentado aquí, 3 × 106 vivo hemocitos pueden obtenerse 200 larvas de Drosophila 3rd estadio en 30 min para la infección ex vivo . Alternativomente, hemocitos pueden ser infectado en vivo a través de la inyección de 3 larvas de estadiord seguido por extracción hemocyte a la infección después de 24 h. Estas células infectadas de la primaria fueron fijadas, teñidos y reflejada usando microscopia confocal. Entonces, se generaron representaciones 3D de las imágenes para mostrar definitivamente la invasión de patógenos. Además, se puede obtener RNA de alta calidad para qRT-PCR para la detección de siguiente de mRNA de patógeno infección y suficiente proteína pueden ser extraído de estas células para el análisis de Western blot. Tomados en conjunto, se presenta un método para la reconciliación definitiva de la invasión de patógenos y confirmación de la infección con tipos de patógeno bacterianos y virales y un método eficiente para la extracción de hemocyte obtener suficiente energizados hemocitos de Drosophila larvas para experimentos de infección ex vivo e in vivo .

Introduction

Drosophila melanogaster es un organismo modelo bien establecido para el estudio de la inmunidad innata1. Durante la respuesta inmune innata, hemocitos juegan un papel importante en la respuesta al desafío de patógeno. Hemocitos son cruciales para el encapsulamiento de parásitos, así como tener una función importante en la lucha contra el patógeno a través de la acción fagocítica durante la infección por hongos, virales y bacterianas2,3.

Para mejor entender la respuesta inmune innata del hospedador a la infección microbiana patógena, es importante visualizar cómo el patógeno invade las células del huésped durante la infección. Esta visualización contribuye a una comprensión del mecanismo de invasión. Junto con los datos de localización intracelular del patógeno y la respuesta celular, estos datos pueden proporcionar pistas sobre la respuesta del huésped a la infección y los orgánulos celulares con los cuales interactúa el microbio. Por lo tanto, reconstrucción 3D modelo después de la proyección de imagen por microscopia puede ser útil para determinar la ubicación precisa de los patógenos en las células del huésped. En este estudio, visualizamos la invasión de Coxiella burnetii (C. burnetii), el agente causal de la fiebre Q, una enfermedad zoonótica que plantea una grave amenaza para la salud humana y animal, en primarias hemocitos de Drosophila . Recientemente, se demostró que la Drosophila son susceptibles al nivel de bioseguridad 2 fase nueve milla II (NMII) clon 4 cepa de C. burnetii y que esta cepa es capaz de replicarse en Drosophila4, indicando Drosophila puede utilizarse como un organismo modelo para estudiar la patogenesia de C. burnetii .

Estudios previos han utilizado hemocitos para examinar la respuesta inmunológica innata del hospedador. Hemocitos se han utilizado para observaciones morfológicas5,6,7, morfométricos análisis2,8, fagocitosis análisis2,3, qRT-PCR2 , 9, inmunoprecipitación10,11, análisis inmunofluorescente10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 e immunohistochemistry9,14. Aunque las células S2 de Drosophila también están disponibles para varios experimentos en vitro , inmortalización y potencial infección viral existente cambian su comportamiento15,16. El uso de pilas en lugar de una línea celular inmortalizada, como células de S2, permite el estudio de la función inmune innata en un sistema más representativo de todo el organismo. Además, la infección de hemocitos en vivo, antes de la extracción, permite a las células interactuar con otras proteínas de host y el tejido, una ventaja sobre extracción de hemocitos antes infección ex vivo . Un número de diferentes métodos se han utilizado para obtener un número suficiente de hemocitos en un corto período de tiempo para mantener los hemocitos vivo8,17,18,19.

En este estudio, se presenta un método para extraer hemocitos de larvas de Drosophila 3rd estadio de infección microbiana patógena con C. burnetii, Listeria monocytogenes (listeriosis) o invertebrados iridiscente Virus 6 (IIV6). Se describen los métodos para las infecciones hemocyte tanto in vivo y ex vivo . In vivoy ex vivo-hemocitos infectados fueron visualizadas con microscopía confocal y usados para construir modelos 3D de invasión de C. burnetii . Además, usando el protocolo de extracción, ex vivo-hemocitos infectados fueron utilizados para la expresión de gene y proteína ensayos. Específicamente, para examinar el grado de infección por IIV6 y Listeria, proteína o RNA total fue aislada de las células para qRT-PCR o análisis de Western blot. Tomados en conjunto, el protocolo proporciona métodos para recolectar rápidamente un número elevado de hemocitos de 3 larvas de estadio de lard y evidencia que los hemocitos primarias, infectado ya sea en vivo o ex vivo, son una plataforma conveniente para microbiana estudios de infección de los patógenos y análisis posteriores aplicables como la microscopía, transcriptómica y proteómica.

Protocol

1. infección ex vivo Y aparatos Bajo condiciones estériles, preparar fresco Drosophila Hemocyte aislamiento medio (DHIM) que contiene de 75% Schneider Drosophila medio 25% suero bovino Fetal (FBS) y filtro de esterilización lo. Capa de 2-3 pedazos de la película de parafina 10 cm x 10 cm bajo un estereomicroscopio. Preparar el tubo capilar de vidrio. Ajuste el tirador capilar a 55% del máximo. Tire el tubo capilar a un punto agudo de aproximadamente …

Representative Results

Para cobrar altura hemocitos para infección ex vivo de 3 × 106 hemocitos se obtuvieron de 200 larvas de Drosophila 3rd estadio. Para el desarrollo de nuestro método, se trató de un número de técnicas diferentes. Disección larvas individual llevaría hasta 1,5 h y un promedio de ~ 8000 células fueron obtenidos usando este método18, la mayoría de los cuales no estaban viva al final de la colección. A continuación, i…

Discussion

Para entender mejor cómo se infectan las células del huésped, es importante aclarar la localización del patógeno en las células, especialmente cuando experimenta previamente patógeno y células tipo combinaciones4. Mientras que el estudio de la cascada de la respuesta celular después de la infección puede indicar invasión patógeno productiva, la combinación de datos de respuesta de imagen y celular es esencial para demostrar la infección y la invasión de patógenos. Mientras reportes…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos agradecidos con el Dr. Robert Heinzen para proporcionar reservas de expresar mCherry burnetii de la coxiella. Agradecemos a Dr. Luis Teixeira para proporcionar virus iridiscente invertebrados 6 y el centro de Stock de Bloomington para proporcionar a las poblaciones de la mosca. Este proyecto fue financiado en parte por NIH subsidio R00 AI106963 (A.G.G.) y Universidad Estatal de Washington.

Materials

Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii – mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot
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References

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Hiroyasu, A., DeWitt, D. C., Goodman, A. G. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57077, doi:10.3791/57077 (2018).
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