JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Извлечение Hemocytes из личинки Drosophila melanogaster микробной инфекции и анализа

Published: May 24, 2018
doi:
10.3791/57077
, ,
1School of Molecular Biosciences, College of Veterinary Medicine,Washington State University, 2Integrative Physiology and Neuroscience, College of Veterinary Medicine,Washington State University

Summary

Этот метод демонстрируется визуализировать возбудителя вторжения в насекомое клетки с трехмерной (3D) модели. Hemocytes от дрозофилы личинки были инфицированы вирусных или бактериальных патогенов, ex vivo или в естественных условиях. Зараженных hemocytes были затем фиксированной и витражи для изображений с конфокального микроскопа и последующих клеточных 3D реконструкции.

Abstract

Во время патогенной инфекции Drosophila melanogaster, hemocytes играют важную роль в иммунной реакции на протяжении инфекции. Таким образом цель настоящего Протокола заключается в разработке метода для визуализации возбудителя вторжения в конкретных иммунной отсеке мух, а именно hemocytes. С помощью метода, представленные здесь, до 3 × 106 живой hemocytes можно получить из 200 дрозофила 3rd instar личинок в 30 минут для ex vivo инфекции. Кроме того hemocytes может быть зараженных в естественных условиях путем инъекций личинок 3rd instar следуют кровяные добычи 24 ч после инфекции. Эти зараженные клетки первичной были исправлены, витражи и образы с помощью конфокальной микроскопии. Затем 3D представлений были созданы из изображений, чтобы окончательно показать возбудителя вторжения. Кроме того, можно получить РНК высокого качества для qRT ПЦР для выявления возбудителя мРНК следующие инфекции и достаточно белка могут быть извлечены из этих клеток для Западный анализ помаркой. Взятые вместе, мы представляем метод определенное согласование возбудителя вторжения и подтверждения инфекции, используя типы бактериальных и вирусных патогенов и эффективный метод для извлечения кровяные для получения достаточно живой hemocytes от дрозофилы Личинки для ex vivo , так и в естественных условиях инфекции экспериментов.

Introduction

Drosophila melanogaster это организм устоявшихся моделей для изучения врожденного иммунитета1. Во время врожденный иммунный ответ hemocytes играют важную роль в ответ на вызов возбудителя. Hemocytes являются критическими для инкапсуляции паразитов, а также важную роль в борьбе против возбудителя через фагоцитарной действий во время грибковые, вирусные и бактериальные инфекции2,3.

Для того чтобы лучше понять врожденный иммунный ответ хозяина патогенные микробные инфекции, важно для визуализации, как возбудитель поражает клетки хозяина во время инфекции. Эта визуализация способствует пониманию механизма вторжения. Вместе с детали внутриклеточной локализации возбудителя и клеточного ответа эти данные могут предоставить подсказки о принимающей реакции на инфекции и клеточных органелл, с которыми взаимодействует микроба. Таким образом 3D-модель восстановления после съемки по микроскопии может быть полезно определить точное местоположение патогенов в клетки хозяина. В этом исследовании мы визуализирована вторжения Coxiella burnetii (C. burnetii), возбудитель Ку-лихорадки, зоонозные болезни, которая представляет собой серьезную угрозу для здоровья человека и животных, в первичной Drosophila hemocytes. Недавно было продемонстрировано, что дрозофилы восприимчивы к биобезопасности уровня 2 9 км фаза II (NMII) клон 4 штамм C. burnetii и что этот штамм имеет возможность реплицировать в дрозофилы4, указанием что Дрозофила может использоваться в качестве модельного организма для изучения патогенеза C. burnetii .

Предыдущие исследования использовали hemocytes для изучения врожденный иммунный ответ хозяина. Hemocytes были использованы для морфологических замечания5,6,7, морфометрический анализ2,8, фагоцитоз анализ2,3, qRT ПЦР2 , 9, иммунопреципитация10,11, immunofluorescent анализ10,12, иммуноокрашивания13,, immunoblotting3,10 11 и иммуногистохимии9,14. Хотя дрозофилы S2 клетки также доступны для различных экспериментов в пробирке , увековечении и потенциальных существующей вирусной инфекции изменить их поведение15,16. Использование первичных элементов увековечен клеток линии, таких как S2 клетки, в отличие от позволяет для изучения врожденной иммунной функции в системе более представителя всего организма. Кроме того инфекции hemocytes в естественных условиях, до извлечения, позволяет клетки взаимодействуют с другими принимающей белков и ткани, преимущество над добычей hemocytes до ex vivo инфекции. Получить достаточное количество hemocytes в течение короткого времени, чтобы сохранить hemocytes жив8,,1718,19были использованы несколько различных методов.

В этом исследовании мы представляем метод для извлечения hemocytes из дрозофила 3rd instar личинки патогенные микробные инфекции с C. burnetii, листерий (листериоз) или беспозвоночных радужные вирус 6 (IIV6). Мы описываем методы как в естественных условиях , так и ex vivo кровяные инфекций. В естественных условиях– и ex vivo-зараженных hemocytes были визуализируется с помощью конфокальной микроскопии и используется для создания 3D-моделей C. burnetii вторжения. Кроме того, используя протокол извлечения, ex vivo-зараженных hemocytes были использованы для выражения генов и белков анализов. В частности изучить масштабы инфицирования с IIV6 и Listeria, всего RNA или протеина был изолирован от клеток для qRT ПЦР или Западный анализ помаркой. Взятые вместе, протокол предоставляет методы быстро собрать большое количество hemocytes от 3rd instar личинок и доказательства того, что основной hemocytes, инфицированных в vivo или ex vivo, являются подходящей платформой для микробной возбудитель инфекции исследования и применимым течению анализы микроскопии, transcriptomics и протеомики.

Protocol

1. ex vivo инфекции Средний и оборудование В стерильных условиях, подготовить Свежая дрозофилы кровяные изоляции среднего (DHIM) содержащие 75% Шнайдер дрозофилы средних с 25% плода Bovine сыворотки (ФБС) и фильтр стерилизовать его. Слой 2-3 куска пленки парафин 10 см х 10 …

Representative Results

Собирать жить hemocytes ex vivo инфекции, до 3 × 106 hemocytes были извлечены из 200 дрозофила 3rd instar личинки. Развивать наш метод, были попытки ряда различных методов. Индивидуальные личиночной рассечение примет до 1,5 ч, и в среднем ~ 8000 клетки были получены с помощ?…

Discussion

Чтобы лучше понять, как инфицированных клеток хозяина, важно уточнить локализации возбудителя в клетках, особенно когда эксперименты на ранее непроверенных возбудителя и ячейки типа комбинации4. Во время учебы Каскад клеточный ответ, после инфицирования может указывать п…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны д-р Роберт Heinzen для обеспечения запасов выражая mCherry Coxiella burnetii. Мы благодарим д-р Луис Тейшейра за предоставление беспозвоночных радужные вирус 6 и фондового центра Bloomington для предоставления летать запасов. Этот проект частично финансировался NIH Грант R00 AI106963 (A.G.G.) и университета штата Вашингтон.

Materials

Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii – mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
  2. Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).
  3. Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
  4. Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
  5. Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).
  6. Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
  7. Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
  8. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
  9. Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).
  10. Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
  11. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  12. Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
  13. Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
  14. Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
  15. Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
  16. Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
  17. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
  18. Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
  19. Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).
  20. . Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).
  21. Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).
  22. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  23. Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  24. Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
  25. Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
  26. Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
  27. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
  28. Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
  29. Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
  30. Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
  31. Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
  32. De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
  33. Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).
  34. Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
  35. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
  36. Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).
  37. Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
  38. Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
  39. Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).

Tags

HemocytesDrosophila MelanogasterMicrobial InfectionImmune ResponseEx Vivo InfectionConfocal Microscopy3D Model ReconstructionCapillary TubeNanoinjectorHemolymphHemocyte IsolationDrosophila Hemocyte Isolating Medium (DHIM)AnesthesiaGrape Juice Agar PlateYeast Paste

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hiroyasu, A., DeWitt, D. C., Goodman, A. G. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57077, doi:10.3791/57077 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image