Summary

細菌感染や解析のためのキイロショウジョウバエ幼虫血球の抽出

Published: May 24, 2018
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Summary

このメソッドは、三次元 (3 D) モデルを昆虫細胞に病原体の侵入を視覚化する方法を示します。ショウジョウバエ幼虫から血液細胞は、細菌やウイルスの病原体、体外体内に感染していた。感染した血球、固定され共焦点顕微鏡とそれに続く細胞三次元イメージングのステンド グラスします。

Abstract

ショウジョウバエ病原菌の感染中に血球は感染で免疫応答に重要な役割を果たします。したがって、このプロトコルの目標は、ハエ、すなわち血液細胞の特定の免疫のコンパートメントの病原体の侵入を可視化する手法を開発することです。最大 3 × 10、ここで提示法を用いた6ライブ血球は、 ex vivo感染症のため 30 分で 200ショウジョウバエ3rd齢幼虫から入手できます。また、血球は感染した体内感染後 24 時間を追った血球抽出による 3rd幼虫の注射を通してできます。これらの感染した一次電池は修正され、ステンド グラス、共焦点顕微鏡を用いたイメージングします。その後、3 D 表現は、病原体の侵入を決定的に表示する画像から生成されました。また、qRT PCR のための質の高い RNA は mRNA 次の病原体の検出のため得ることができる感染症、および十分な蛋白質、西部のしみの分析のためのこれらの細胞から抽出されます。病原体の侵入の明確な和解と細菌やウイルスの病原体の種類と血球抽出のための効率的な方法を使用して、ショウジョウバエから十分なライブの血球を取得する感染症の確認法を提案する一緒に取られて、ex vivoin vivoの感染実験の幼虫。

Introduction

キイロショウジョウバエは免疫1の研究の確立されたモデル生物です。生得の免疫反応の間に血液細胞は病原体の挑戦への応答に重要な役割を果たします。血液細胞は、ウイルス、真菌や細菌感染2,3貪食作用を通じて病原体との闘いにおける重要な機能を持っていることと同様、寄生虫をカプセル化するために重要です。

最高病原微生物感染ホストの生得の免疫反応を理解し、病原体が伝染の間に宿主細胞に侵入する方法を視覚化することが重要です。この可視化は、侵入のメカニズムの理解に貢献しています。細胞応答し病原体の細胞内局在性の詳細と、これらのデータは感染症と微生物の相互作用、細胞細胞器官に対する宿主の反応についての手がかりを提供できます。したがって、顕微鏡によるイメージング後 3次元モデルの再構成は、宿主細胞に病原体の正確な位置を決定することができます。本研究ではコクシエラ中 (c.burnetii)、 Q 熱、プライマリショウジョウバエ血球に人間や動物の健康に深刻な脅威をもたらす人畜伝染病疾患の病原の侵略を可視化。最近、ショウジョウバエが 2 の 9 マイル相 II (NMII) クローンのc.burnetiiの 4 種、この株はショウジョウバエ4、複製することが、そのを示すバイオ セーフティ レベルに敏感であることを示したショウジョウバエ c.burnetii病因を研究するモデル生物として使用できます。

以前の研究では、ホストの生得の免疫反応を調べる血球を使用しています。血球は、形態学的観察5,6,7, 形態計測学的解析2,8、貪食分析2,3, qRT PCR2に使用されています。,9, 免疫沈降10,11、免疫蛍光分析10,12, 免疫染色13, イムノブロット3,10 11および免疫組織化学の9,14ショウジョウバエS2 細胞が様々 な体外実験の利用も、不死化および既存ウイルス感染の可能性は、動作15,16を変更します。S2 細胞などの不死化細胞ラインではなく一次電池の使用は、自然免疫の研究システムで全体の生物の代表的な。また、血液細胞の生体内での抽出の前に感染症は、他のホスト蛋白質および組織前のヴィヴォ感染前に血液細胞の抽出上の優位性と対話するセルをできます。血液細胞の生きている8,17,18,19を保つために時間の短い期間での血球の十分な数を取得するさまざまな方法の番号を利用されています。

本研究ではショウジョウバエ3rd病原微生物感染c.burnetiiリステリア菌(リステリア菌) や無脊椎動物の虹色の幼虫から血球を抽出する手法を提案します。ウイルス 6 (IIV6)。体内体外の両方の血球感染症法について述べる。生体内でおよび前のヴィヴォ-感染した血液細胞の共焦点顕微鏡による可視化し、, c.burnetii侵略の 3 D モデルを構築するために使用します。また前のヴィヴォの抽出のプロトコルを使用して-感染した血液細胞は遺伝子および蛋白質の表現のために使用されたアッセイ。具体的には、IIV6 とリステリア感染症の程度を確認する総 RNA やタンパク質が分離された qRT PCR または西部のしみの分析のための細胞から。一緒に取られて、プロトコル 3rd幼虫と体内または体外に主な血液細胞が感染している証拠から急速に血球数を収集するメソッドを提供します、適切なプラットフォームの微生物病原体感染症研究および適用の下流解析顕微鏡、トランスクリプトミクス、プロテオミクスなど。

Protocol

1 感染前のヴィヴォ。 媒体および装置 生殖不能の条件の下で新鮮なショウジョウバエ血球分離培地 (DHIM) 75% シュナイダーのショウジョウバエを含む準備中] 25% で胎仔ウシ血清 (FBS)、フィルター殺菌それ。 顕微鏡下で 10 cm × 10 cm パラフィン フィルムの 2 〜 3 個をレイヤーします。 ガラス毛細管を準備します。キャピラリーの引き手のヒータ?…

Representative Results

収集ex vivo感染症、血球を 3 × 10 まで生きて6血球は 200ショウジョウバエ3rd幼虫から抽出されました。本手法を開発するには、さまざまなテクニックの数を行った。個々 の幼生解離 1.5 h までと 8000 ~ セルの平均を得たこの法18、その大半はコレクションの終わりまで生きてなかった。次に、我々 は、血液を含んだ体液を?…

Discussion

宿主細胞が感染になる方法を理解、特に、以前テストされていない病原体および細胞型の組み合わせ4実験細胞、病原体の局在を明らかにすることが重要です。感染細胞反応カスケードを勉強して生産的な病原体の侵入を示すことができます、イメージングと細胞応答データの組み合わせ病原体の侵入、感染を示すことが欠かせません。一方、宿主細胞に病原体の侵入の 2D ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MCherry 表現コクシエラ ラベンダーの株を提供するため博士ロバート ・ Heinzen に感謝しております。博士ルイス ・ テイシェイラにありがとうはえの在庫を提供する無脊椎動物虹色ウイルス 6 およびブルーミントン ストック センターを提供します。このプロジェクトは、NIH グラント R00 AI106963 (A.G.G.) に、ワシントン州立大学によって一部で賄われていた。

Materials

Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii – mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot

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Hiroyasu, A., DeWitt, D. C., Goodman, A. G. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57077, doi:10.3791/57077 (2018).

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