Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise
Summary
Este método demonstra como visualizar a invasão do patógeno em células de inseto com modelos tridimensionais (3D). Hemócitos de larvas de Drosophila foram infectados com patógenos virais ou bacterianos, ou ex vivo ou no vivo. Hemócitos infectados foram, em seguida, fixa e manchados para a imagem latente com um microscópio confocal e subsequente reconstrução celular 3D.
Abstract
Durante a infecção patogênica de Drosophila melanogaster, hemócitos desempenham um papel importante na resposta imune durante a infecção. Assim, o objetivo do presente protocolo é desenvolver um método para visualizar a invasão do patógeno em um compartimento específico imune de moscas, nomeadamente hemócitos. Usando o método apresentado aqui, até de 3 × 106 hemócitos ao vivo podem ser obtidos 200 drosófila 3rd ínstar larvas em 30 min para infecção ex vivo . Como alternativa, hemócitos podem ser infectado na vivo através da injeção de 3rd ínstar larvas acompanhados por extração hematócito a pós-infecção 24 h. Estas células primárias infectadas foram fixadas, manchado e fotografada usando microscopia confocal. Em seguida, representações 3D foram geradas a partir das imagens para mostrar definitivamente a invasão do patógeno. Além disso, o RNA de alta qualidade para qRT-PCR pode ser obtido para a deteção do seguinte de mRNA do patógeno infecção e proteína suficiente podem ser extraídas destas células para análise ocidental do borrão. Tomados em conjunto, apresentamos um método para a reconciliação definitiva de invasão do patógeno e confirmação de infecção usando tipos de patógenos bacterianos e virais e um método eficiente para extração hematócito para obter suficiente ao vivo hemócitos de Drosophila larvas para experimentos de infecção ex vivo e na vivo .
Introduction
Drosophila melanogaster é um organismo modelo bem estabelecida para o estudo da imunidade inata1. Durante a resposta imune inata, hemócitos desempenham um papel importante na resposta ao desafio do patógeno. Hemócitos são críticos para encapsular parasitas, bem como tendo uma função importante na luta contra o patógeno através de ação fagocitária durante infecção fúngica, bacteriana e viral,2,3.
A fim de melhor compreender a resposta imune inata do hospedeiro à infecção microbiana patogénica, é importante Visualizar como o patógeno invade células hospedeiras durante a infecção. Esta visualização contribui para uma compreensão do mecanismo de invasão. Juntamente com detalhes de localização intracelular de patógeno e a resposta celular, esses dados podem fornecer pistas sobre a resposta do hospedeiro à infecção e as organelas celulares com os quais interage o micróbio. Assim, a reconstrução 3D modelo após a geração de imagens por microscopia pode ser útil para determinar a localização precisa de patógenos em células hospedeiras. Neste estudo, nós visualizado a invasão da Coxiella burnetii (c. burnetii), o agente causador da febre Q, uma zoonose que representa uma séria ameaça à saúde humana e animal, em primários hemócitos de Drosophila . Recentemente, foi demonstrado que a drosófila são suscetíveis ao nível de biossegurança 2 fase de nove milhas II (NMII) clone 4 tensão de c. burnetii e que esta cepa é capaz de replicar em Drosophila4, indicando que Drosófila pode ser usado como um organismo modelo para estudar a patogênese de c. burnetii .
Estudos anteriores usaram hemócitos para examinar a resposta imune inata do host. Hemócitos têm sido utilizados para observações morfológicas5,6,7, de2,de Análise morfométrica8, fagocitose análise2,3, qRT-PCR2 , 9, imunoprecipitação10,11, imunofluorescência análise10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 e imuno-histoquímica de9,14. Embora a drosófila S2 células também estão disponíveis para várias em vitro experiências, immortalization e potencial de infecção viral pré-existente alterar seu comportamento15,16. O uso de células primárias em oposição a uma linhagem de células imortalizado, tais como células de S2, permite o estudo da função imune inata em um sistema mais representativo de todo o organismo. Além disso, a infecção de hemócitos na vivo, antes da extracção, permite que as células interagir com outras proteínas do hospedeiro e o tecido, uma vantagem sobre extração de hemócitos antes da infecção ex vivo . Um número de diferentes métodos têm sido utilizado para obter um número suficiente de hemócitos em um curto período de tempo para manter os hemócitos vivo8,17,18,19.
Neste estudo, apresentamos um método para extrair hemócitos de Drosophila 3rd ínstar larvas para infecção microbiana patogénica com c. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) ou invertebrado iridescente vírus 6 (IIV6). Descrevemos os métodos para infecções de hematócito in vivo e ex vivo . In vivo– e ex vivo-hemócitos infectados foram visualizadas com microscopia confocal e usados para construir modelos 3D de invasão de c. burnetii . Além disso, usando o protocolo de extração, ex vivo-hemócitos infectados foram usados para a expressão de gene e proteína ensaios. Especificamente, para examinar a extensão da infecção com IIV6 e Listeria, total RNA ou proteína foi isolada das células por qRT-PCR ou análise ocidental do borrão. Tomados em conjunto, o protocolo fornece métodos para coletar rapidamente números elevados de hemócitos de 3rd ínstar larvas e provas que primário hemócitos, infectados in vivo ou ex vivo, são uma plataforma adequada para microbiana estudos de infecção do patógeno e aplicável a jusante análises como microscopia, transcriptomics e proteômica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para entender melhor como células hospedeiras tornar-se infectado, é importante esclarecer a localização do patógeno nas células, especialmente quando a fazer experiências com o patógeno previamente testado e de combinações de tipo de célula4. Enquanto estuda a cascata de resposta celular após infecção pode indicar invasão do patógeno produtiva, a combinação dos dados de resposta celular e imagem é essencial para demonstrar a infecção e invasão do patógeno. Enquanto relatór…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós estamos gratos ao Dr. Robert Heinzen para fornecimento de estoques de mCherry-expressando Coxiella burnetii. Agradecemos o Dr. Luis Teixeira para fornecer invertebrados iridescente vírus 6 e o centro de estoque de Bloomington para fornecer estoques voar. Este projeto foi financiado em parte pelo NIH grant R00 AI106963 (para A.G.G.) e Universidade de estado de Washington.
Materials
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii – mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
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