استخراج هيموسيتيس من اليرقات melanogaster المورفولوجية للعدوى الميكروبية والتحليل
Summary
هذا الأسلوب يوضح كيفية تصور غزو العوامل الممرضة في خلايا الحشرات مع نماذج ثلاثية الأبعاد (3D). هيموسيتيس من اليرقات المورفولوجية مصابات بمسببات الأمراض الفيروسية أو البكتيرية، أما فيفو السابقين أو في الجسم الحي. هيموسيتيس المصابة ثم الثابتة والملون للتصوير بالمجهر [كنفوكل] والتعمير الخلوية 3D اللاحقة.
Abstract
خلال العدوى المسببة للأمراض من melanogaster المورفولوجية، هيموسيتيس دوراً هاما في الاستجابة المناعية في جميع أنحاء العدوى. وهكذا، والهدف من هذا البروتوكول التوصل إلى أسلوب لتصور غزو العوامل الممرضة في حجرة محصنة محددة من الذباب، إلا وهي هيموسيتيس. استخدام الطريقة المعروضة هنا، تصل إلى 3 × 106 هيموسيتيس يعيش يمكن الحصول على 200 المورفولوجية 3rd الطور اليرقات في 30 دقيقة للعدوى السابقين فيفو . وبدلاً من ذلك، يمكن أن يكون هيموسيتيس المصابة في الجسم الحي من خلال حقن 3 يرقات الطورrd تليها استخراج هيموسيتي إلى 24 ساعة بعد الإصابة. هذه الخلايا المصابة الابتدائية كانت ثابتة والملون، وتصويرها باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. بعد ذلك، تم إنشاؤها تمثيلات ثلاثية الأبعاد من الصور لإظهار غزو الممرض نهائياً. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على الحمض النووي الريبي عالية الجودة قرت PCR للكشف عن العوامل الممرضة مرناً في أعقاب الإصابة، وبروتين كافية يمكن أن تستخلص من هذه الخلايا لتحليل لطخة غربية. أخذت معا، نقدم وسيلة للمصالحة محددة من غزو العوامل الممرضة وتأكيد الإصابة باستخدام أنواع مسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية وطريقة فعالة لاستخراج هيموسيتي للحصول على ما يكفي هيموسيتيس الحية من المورفولوجية يرقات لتجارب العدوى السابقين فيفو و في فيفو .
Introduction
Melanogaster المورفولوجية كائن نموذج راسخة لدراسة الحصانة الفطرية1. خلال الاستجابة المناعية الفطرية، هيموسيتيس دوراً هاما في الاستجابة للتحدي الممرض. هيموسيتيس ذات أهمية حاسمة لتغليف الطفيليات، فضلا عن وجود وظيفة هامة في مكافحة مسببات المرض عن طريق عمل متجولة أثناء الإصابة الفطرية والفيروسية والبكتيرية2،3.
من أجل فهم أفضل للمضيف الاستجابة المناعية الفطرية للعدوى الميكروبية المسببة للأمراض، من المهم أن تصور كيف يغزو الممرض الخلايا المضيفة أثناء الإصابة. ويسهم هذا التصور فهم الآلية للغزو. جنبا إلى جنب مع تفاصيل عن التعريب الممرض داخل الخلايا والاستجابة الخلوية، يمكن أن توفر هذه البيانات أدلة حول استجابة المضيف للعدوى والعضيات الخلوية التي يتفاعل الميكروب. وهكذا، يمكن إعادة بناء نموذج ثلاثي الأبعاد بعد التصوير بواسطة الفحص المجهري مفيدة لتحديد الموقع الدقيق للعوامل الممرضة في الخلايا المضيفة. في هذه الدراسة، يمكننا تصور غزو الكوكسيلا البورنيتية (C. بورنيتيه)، المسبّب من حمى Q، أمراض الحيوانية المصدر التي يشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان والحيوان على حد سواء، في الابتدائي المورفولوجية هيموسيتيس. في الآونة الأخيرة، اتضح أن المورفولوجية معرضة لمستوى السلامة الأحيائية 2 “ميل تسعة” المرحلة الثانية (نميي) استنساخ سلالة البورنيتية جيم- 4 وأن هذه السلالة غير قادرة على إجراء نسخ متماثل في المورفولوجية4، مشيراً إلى أن المورفولوجية يمكن استخدامها ككائن نموذج لدراسة إمراضية البورنيتية جيم .
الدراسات السابقة استخدمت هيموسيتيس لدراسة الاستجابة المناعية الفطرية للمضيف. وقد استخدمت هيموسيتيس للملاحظات المورفولوجية5،،من67، البلعمه التحليل2،3قرة-بكر2 ، شكلي التحليل2،8 , 9، تحليل إيممونوفلوريسسينت10،12إيمونوستاينينج13،، إيمونوبلوتينج3،10،10،إيمونوبريسيبيتيشن11 9، 11 وإيمونوهيستوتشيميستري14. على الرغم من أن الخلايا S2 المورفولوجية متاحة أيضا لمختلف التجارب في المختبر ، تخليد واحتمال العدوى الفيروسية الموجودة من قبل تغيير على15،السلوك16. استخدام الخلايا الأولية بدلاً من خط خلية مخلدة، مثل الخلايا S2، يسمح لدراسة وظيفة المناعة الفطرية في نظام أكثر تمثيلاً في الحي كله. بالإضافة إلى ذلك، يسمح العدوى من هيموسيتيس في فيفو، قبل الاستخراج، الخلايا للتفاعل مع بروتينات المضيف والأنسجة، وميزة على استخراج هيموسيتيس قبل السابقين فيفو العدوى الأخرى. وقد استخدمت عددا من الأساليب المختلفة للحصول على عدد كاف من هيموسيتيس في فترة قصيرة من الزمن أن تبقى على قيد الحياة8،هيموسيتيس17،،من1819.
في هذه الدراسة، نقدم طريقة لاستخراج هيموسيتيس من يرقات الطورrd المورفولوجية 3 للعدوى الميكروبية المسببة للأمراض مع جيم-البورنيتية، الليستريه المستوحدة (الليستريا) أو اللافقاريات قزحي الألوان فيروس 6 (IIV6). يصف لنا طرق العدوى هيموسيتي في فيفو و السابقين فيفو على حد سواء. في فيفو-و السابقين فيفو-هيموسيتيس المصابة كانت تصور مع الفحص المجهري [كنفوكل] وتستخدم لبناء نماذج ثلاثية الأبعاد لغزو البورنيتية جيم . بالإضافة إلى ذلك، باستخدام بروتوكول الاستخراج، السابقين فيفو-هيموسيتيس المصابة واستخدمت تعبير الجينات والبروتين فحوصات. على وجه التحديد، لدراسة مدى العدوى مع IIV6 والليستيريا، مجموع الحمض النووي الريبي أو البروتين كانت معزولة من خلايا بكر qRT أو تحليل لطخة غربية. أخذت معا، البروتوكول يوفر أساليب لسرعة جمع إعداد كبيرة من هيموسيتيس من 3rd الطور اليرقات والأدلة أن المصابين هيموسيتيس الأولية، أما في فيفو أو فيفو السابقين، وهي منبر مناسب للجراثيم الممرض الإصابة بالدراسات والتحليلات المتلقين للمعلومات السارية مثل الفحص المجهري، ترانسكريبتوميكس، والبروتينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
لفهم كيف تصاب الخلايا المضيفة، من المهم توضيح إضفاء الطابع المحلي على الممرض في الخلايا، ولا سيما عند تجارب على الممرض لم تختبر سابقا و تركيبات نوع الخلية4. بينما تدرس تتالي الاستجابة الخلوية بعد الإصابة يمكن أن تشير إلى غزو الممرض الإنتاجية، مزيج بيانات الاستجابة الخلوية وا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للدكتور روبرت هينزين لتوفير مخزون من التعبير عن متشيري الكوكسيلا البورنيتية. ونحن نشكر الدكتور لويس تيكسيرا لتوفير مركز الأسهم بلومينغتون واللافقاريات فيروس قزحي الألوان 6 لتوفير الأرصدة يطير. وكان تمويل هذا المشروع في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منحة R00 AI106963 (A.G.G.)، وجامعة ولاية واشنطن.
Materials
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii – mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
References
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).
- Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
- Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
- Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).
- Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).
- Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
- Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
- Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
- Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
- Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
- Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).
- . Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).
- Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
- Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
- Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
- Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
- Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
- Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
- De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
- Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).
- Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
- Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).
- Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
- Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
- Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).
