Generazione di Genome-wide cromatina conformazione cattura librerie da strettamente in fasi precoce embrioni della drosofila

1. raccolta di embrioni di drosophila Nota: Una collezione di embrione equivalente può essere eseguita come indicato in una precedente pubblicazione15. Trasferimento giovane eGFP-PCNA mosche (< 1 settimana di età) in gabbie collezione uovo con yeasted collezione piastre16 (1% di etanolo, acido acetico 1% e 4% agar). Spostare gabbie insieme in un incubatore a 25 ° C. Incubazione per 1 – 2 giorni prima del prelievo degli ovociti migliora significativamente la resa di uovo. Cambiare collezione piatti due volte al giorno. Rimuovere le piastre contenenti embrioni dal vano di raccolta in intervalli di 30 – 60 min. Intervalli più piccoli comportare un minor numero di embrioni, ma più stretta distribuzione delle fasi di sviluppo. Raccogliere da gabbie multiple in parallelo così che idealmente > 200 uova ogni 30-60 min. Conservare le piastre a 25 ° C fino a quando gli embrioni raggiungono l’età desiderata. Per embrioni in fase blastoderm (ciclo nucleare 14), incubare per circa 2 h. Dopo 2 h di incubazione, aggiungere acqua di rubinetto da una spruzzetta per la piastra di raccolta in modo che l’intera superficie è ricoperta d’acqua. Sospendere gli embrioni e lievito utilizzando una spazzola morbida. Versare sedimento embrioni dalla piastra di raccolta in un cestello di raccolta di embrioni (filtri cella commerciale con porosità di 100 µm o cesti fatti in casa17 funzionano bene), l’aggiunta di acqua di rubinetto supplementare da una spruzzetta, se necessario. In questa fase, combinare gli embrioni da tutti i piatti che sono stati raccolti in parallelo. Il campione rappresenta un singolo batch. Lavare gli embrioni ben risciacquando il cestello con acqua di rubinetto da una spruzzetta per 30 s fino a quando tutti i residui di lievito viene lavato via. Dechorionate embrioni inserendo il cestello di raccolta in una soluzione di ipoclorito di sodio 2,5% in acqua. Luce agitazione agitando facilita la rimozione del corion. Continuare fino a quando gli embrioni sono sufficientemente idrofobi che galleggiano sulla superficie della soluzione quando il cestello è sollevato e sommersa di nuovo, che dovrebbe prendere ~1.75–2 min.Attenzione: ipoclorito di sodio è corrosivo. Indossare adeguati dispositivi di protezione personale. Soluzioni contenenti < 10% di ipoclorito di sodio può solitamente essere smaltito nel lavandino, assicurati di controllare le regolazioni dell'Istituto ospitante. Togliete il cestello dalla soluzione e sciacquare abbondantemente con acqua di rubinetto da una spruzzetta, fino a quando l’odore della candeggina non è più evidente. 2. embrione fissazione Nota: Condizioni di fissaggio ottimale, soprattutto la concentrazione del detergente, formaldeide e la durata della fissazione, devono essere empiricamente determinato a montare il palco degli embrioni. Per le fasi intorno il blastoderm sinciziale, una concentrazione finale di 0,5% Triton X-100 e 1,8% formaldeide nella fase acquosa funzionano bene. Per fasi successive oltre stadio embrionale 9, ulteriore ottimizzazione di questi parametri può essere necessario. Tutte le soluzioni utilizzate durante la fissazione e l’ordinamento dovrebbero contenere inibitori della proteasi. Capovolgere il cestello di raccolta e posto sopra un tubo di centrifugazione conico da 15 mL. Lavare gli embrioni dal cesto nel tubo usando una pipetta di Pasteur erogazione PBS-T (PBS, 0,5% Triton X-100). Lasciate che gli embrioni depositano sul fondo e regolare il volume totale da 2 mL con PBS-T. Aggiungere 6 mL di eptano e 100 µ l di formaldeide al 37% in acqua.Attenzione: Eptano e formaldeide sono tossici per inalazione o contatto pelle. Indossare adeguati dispositivi di protezione personale e lavorare in una cappa aspirante. Rifiuti contenenti eptano o formaldeide deve essere smaltito separatamente secondo le normative dell’Istituto ospitante. Dopo l’aggiunta della formaldeide, avviare un timer 15 min e agitare vigorosamente il tubo su e giù per 1 min a mano. La fase acquosa e organica si combina alla consistenza forma un shampoo-like. Agitare su un mixer rotatorio fino a 10 min dopo l’aggiunta di formaldeide. Centrifugare a 500 g per 1 min a temperatura ambiente per raccogliere embrioni nella parte inferiore del tubo. Aspirare il liquido di shampoo-come intero e scartarla, avendo cura di non per aspirare eventuali embrioni. Piccole quantità residue del surnatante shampoo-come non causano problemi. 15 min dopo l’aggiunta di formaldeide, risospendere gli embrioni in 5 mL di PBS-T con glicina di 125 mM per placare la formaldeide. Mescolare vigorosamente agitando su e giù per 1 min. Centrifugare a 500 g a temperatura ambiente per 1 min e aspirare il surnatante. Lavare gli embrioni da loro risospendere in 5 mL di PBS ghiacciato-T. Lasciate che gli embrioni settle e aspirato tutto surnatante. Ripetere il lavaggio nel passaggio 2.10 altre due volte. Conservare gli embrioni su ghiaccio fino l’ordinamento. Di solito, è una buona idea per raccogliere 3 – 4 lotti di volare embrioni prima di procedere all’ordinamento. Tuttavia, gli embrioni devono essere ordinati nello stesso giorno. Stoccaggio prolungato su ghiaccio o in frigo conduce alla morfologia dell’embrione alterato. 3. embrione di ordinamento Nota: L’ordinamento può essere fatto su qualsiasi stereo microscopio a fluorescenza equipaggiato con un filtro GFP 60 – 80 ingrandimenti. Utilizzando una pipetta di 1.000 µ l, trasferisce un lotto di circa 100 embrioni un piccolo recipiente di vetro adatto per l’ordinamento, preferibilmente di colore scuro e posizionarlo sul ghiaccio. Embrioni di ordinamento di stato nucleare densità e ciclo cellulare (Figura 1) spingendo gli embrioni desiderabili in una pila separata utilizzando una punta dell’ago o una siringa. Rimuovere tutti gli embrioni con distribuzione disperso, non-nucleari di eGFP-PCNA (Figura 1E). Inoltre, gli embrioni che parzialmente mostrano un segnale GFP non nucleare dovrebbero essere rimosso. Per facilitare l’ordinamento, è possibile assemblare una line-up di embrioni di riferimento al ciclo nucleare 12, 13 e 14 in ogni batch utilizzando le immagini nella Figura 1 come guida. Utilizzare questa line-up per abbinare gli embrioni di una fase sconosciuto con uno degli embrioni di riferimento al fine di determinare la loro fase. Per verificare lo stadio di sviluppo per gli embrioni di riferimento, è possibile misurare la densità nucleare dall’embrione di imaging e contando il numero dei nuclei sulla superficie dell’embrione in un’area di 2.500 µm2 utilizzando software di imaging che fornisce informazioni sulla distanza.Nota: Il numero previsto dei nuclei per un’area di 2.500 µm2 è 12 a 16 nuclei al ciclo nucleare 12 e 20-30 nuclei nucleare ciclo 1313. Una volta che tutti gli embrioni nello stadio appropriato sono separati, scattare foto degli embrioni per la documentazione e il controllo di qualità. Se il microscopio stereo non è di per sé dotato di un modulo di fotocamera, può essere utilizzato qualsiasi microscopio a epifluorescenza con filtri GFP. Pipettare fino gli embrioni desiderati utilizzando una pipetta di 1.000 µ l, trasferimento in una nuova provetta e posto sul ghiaccio. Continuare fino a quando non abbastanza embrioni vengono ordinati per l’esperimento pianificato. Per gli embrioni più anziani che tappa 9, generalmente 20 embrioni sono sufficienti per uno in situ esperimento Hi-C. Al ciclo nucleare 12, 80 embrioni sono un buon punto di partenza. Nei cicli precedenti, il numero di embrioni deve essere raddoppiato circa per ogni ciclo. Piscina e split embrioni in provette da 1,5 mL in modo tale che una provetta contiene abbastanza embrioni per un singolo in situ Hi-C sperimentare. Si consiglia di utilizzare tubi con basse caratteristiche di legame del DNA, dal momento che il tubo stesso verrà utilizzato per l’intero protocollo e adsorbimento del DNA può portare a perdite significative a basse concentrazioni di DNA. Gira tubi brevemente a 100 x g a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Gli embrioni dovrebbero essere più asciutti possibile per il congelamento. Flash congelare gli embrioni immergendo i tubi in azoto liquido e conservare a-80 ° C. 4. in Situ Hi-C Lisi Inserire le provette con embrioni congelati sul ghiaccio. Risospendere embrioni in 500 µ l di tampone di lisi ghiacciata (10 mM Tris-Cl a pH 8.0, 10 millimetri di NaCl, 0,2% IGEPAL CA-630, inibitori della proteasi; disciolto in acqua). Quindi attendere 1 min per lasciare gli embrioni a stabilirsi nella parte inferiore del tubo. Embrioni di macinare con un pestello micro metal, pre-raffreddato su ghiaccio, che è progettato per adattarsi saldamente una microcentrifuga da 1,5 mL. Per evitare gli embrioni di agitazione, inserire il pestello lentamente fino a toccare il fondo del tubo, spingere verso il basso e poi macinare ruotando il pestello due volte in entrambe le direzioni. Sollevare leggermente il pestello, spingere verso il basso del tubo nuovamente e ripetere la rettifica. 4.1.3.2 ripetere per 10 volte, o fino a quando gli embrioni vengono lisati completamente. La soluzione deve essere omogenea, e nessun residui grossi pezzi di embrioni devono rimanere. Incubare la sospensione omogeneizzata in ghiaccio per 15 min. Spin a 1.000 x g, 4 ° C per 5 min ed eliminare il surnatante. Lavare pallina di risospensione in 500 µ l di tampone Lisi ghiacciata, su e giù il pipettaggio. Girare di nuovo come in 4.1.4 e gettare il surnatante. Risospendere il pellet lavato in 100 µ l di 0,5% sodio dodecil solfato (SDS), su e giù il pipettaggio. Permeabilize nuclei incubando per 10 min a 65 ° C in un blocco di riscaldamento. Placare la SDS aggiungendo 50 µ l di 10% Triton X-100 e 120 µ l di acqua. Mescolare, spostando il tubo. Incubare a 37 ° C per 15 min in blocco di calore. Digestione degli enzimi di restrizione Aggiungere 25 µ l di tampone di enzima di restrizione 10x e 20 U di 5 U / µ l MboI. Mescolare, spostando il tubo. Digerire DNA incubando per 90 min a 37 ° C in blocco di calore sotto leggera agitazione (750 giri/min). Aggiungere un altro 20 U di MboI e continuare a incubazione per 90 min. Calore-inattivare MboI incubando a 62 ° C per 20 min. Sporgenza Fill-inNota: Compilando la sporgenza con biotinilati dATP consente la selezione di specifici dei frammenti. Biotina-dATP alle giunzioni di legatura è protetta dall’attività esonucleasi di T4 DNA polimerasi (vedere paragrafo 4.6), mentre la biotina-dATP alle estremità smussate deossiHb viene rimosso in modo efficiente. Il pulldown con perline rivestite con streptavidina nella sezione 4.7 pertanto specificamente arricchisce per chimerici, dei frammenti di DNA. Aggiungere 18 µ l di 0,4 mM biotina-14-dATP, 2,25 µ l di un mix di dCTP/dGTP/dTTP non modificato (3,3 mM) e 8 µ l di 5 U / µ l DNA polimerasi I frammento di Klenow. Mescolare, spostando il tubo e incubare a 37 ° C per 90 min in blocco di calore. Legatura Aggiungere 657 µ l di acqua, 120 µ l di 10 x T4 DNA ligasi Buffer, 100 µ l di 10% Triton X-100, 6 µ l di 20 mg/mL albumina di siero bovino (BSA) e mescolare, spostando il tubo. Infine aggiungere 5 µ l di mix e 5 U / µ l T4 DNA ligasi, spostando il tubo. Tubo ruotare delicatamente (20 giri/min) a temperatura ambiente per 2 h. Aggiungere una seconda rata di 5 µ l di 5 U / µ l T4 DNA ligasi e continuare a ruotare per 2 h più. Rotazione verso il basso i nuclei a 2.500 x g per 5 min ed eliminare il surnatante. Estrazione del DNA Risospendere il pellet in 500 µ l di tampone di estrazione (50 mM Tris-Cl a pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1% SDS; disciolto in acqua) e aggiungere 20 µ l di proteinasi K. Mix di 20 mg/mL, spostando il tubo. Digerire le proteine incubando a 55 ° C per 30 minuti, agitando a 1.000 giri/min. A de-reticolare, aggiungere 130 µ l di 5 M di NaCl e incubare per una notte a 68 ° C, agitando a 1.000 giri/min. Campione di pipetta in una nuova provetta 2 mL, preferenzialmente con basse caratteristiche di legame del DNA. Aggiungere 0,1 x volumi (63 µ l) di 3M sodio acetato pH 5.2 e 2 µ l di 15 mg/mL GlycoBlue. Mescolare bene capovolgendo. Aggiungere 1,6 x volumi (1.008 µ l) di etanolo assoluto puro e mescolare capovolgendo. Incubare a-80 ° C per 15 min. centrifuga a 20.000 x g a 4 ° C per almeno 30 min. Il pellet di DNA è spesso molto piccola, quasi invisibile e può essere individuato solo a causa del colore blu di GlycoBlue. Rimuovere il surnatante con molta attenzione, muovendo il puntale della pipetta nel tubo lungo la parete opposta da dove si trova il pellet di DNA. Piccole goccioline restanti sono spesso facilmente rimosso durante questo passaggio e i seguenti lavaggi, spingendoli fuori i tubi utilizzando una punta di P10 piuttosto che di pipettaggio li fuori. Lavare la pallina con l’aggiunta di 800 µ l di etanolo al 70%. Miscelare accuratamente capovolgendo e centrifugare a 20.000 x g a temperatura ambiente per 5 min, ripetere questo lavaggio almeno una volta. Rimuovere tutte le tracce di etanolo e lasciare il tubo con il coperchio aperto per fino a 5 min a asciugare all’aria. Una volta che nessun liquido è restante, aggiungere 50 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0. Pipettare ripetutamente la soluzione sopra la zona sulla parete del tubo dove era situato il pellet per solubilizzare il DNA. Aggiungere 1 µ l di 20 mg/mL RNasi A, mix, spostando il tubo e incubare a 37 ° C per 15 min da digerire RNA. Il campione ora può essere conservato in frigorifero durante la notte o congelato a-20 ° C a tempo indeterminato. Controllare la concentrazione di DNA usando un’analisi di tintura fluorescente basata secondo le istruzioni del produttore. La quantità totale di DNA nel campione dovrebbe essere almeno 10 ng, altrimenti troppo poco materiale è disponibile per l’amplificazione e complessità biblioteca sarà probabilmente basso. Quando questo accade, la quantità di materiale di partenza probabilmente non era sufficiente, o materiale è stato perso lungo la strada, forse durante la lisi e la precipitazione. Rimozione di biotina e del DNA di taglio Aggiungere insieme 12 µ l di tampone di T4 DNA polimerasi x 10, 3 µ l di 1 mM dATP, 3 µ l di 1 mM dGTP e 46 µ l di acqua. Mescolare, spostando il tubo. Aggiungere 5 µ l di 3 U/mL T4 DNA polimerasi, mescolare, spostando il tubo e incubare a 20 ° C per 30 min. 3 µ l di EDTA 0.5 M per arrestare la reazione e usare l’acqua per portare il campione ad un volume di circa 120 µ l. Taglio del DNA a una dimensione di 200 – 400 bp utilizzando un dispositivo di sonicazione secondo le istruzioni del produttore. Utilizzando il sonicatore menzionato nella Tabella materiali, il seguente programma è appropriato: 2 cicli ciascuno di 50 s, 10% dazio, intensità 5, 200 cicli/scatti in sequenza. Biotina pulldown Pipettare 30 µ l di 10 mg/mL streptavidina biglie magnetiche in un nuovo tubo, separarli su un supporto magnetico e gettare il surnatante. Risospendere perline in 1x tampone B & W (5 mM Tris-Cl a pH 7.4, 0,5 mM EDTA, NaCl di 1m; disciolto in acqua) + 0,1% Triton X-100 e mescolare nel Vortex. Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere per 1 – 5 min che le perle sono separate, a seconda della marca e modello. Aspirare e scartare il surnatante facendo scorrere la punta della pipetta lungo la parete opposta di dove si trovano le perle. Risospendere perline in 120 µ l di tampone B & W (10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA e 2 M NaCl): 2x. Mescolare nel Vortex. Trasferire DNA tranciato un nuovo tubo di associazione DNA basso e mescolare con 120 µ l della sospensione della perla nel buffer 2 X B & W nel Vortex. Ruotare perline con il campione di DNA a 20 rpm per 15 min. Perle su un supporto magnetico di separare ed eliminare il surnatante. Risospendere le perline a 600 µ l di 1x B & W + 0,1% Triton X-100 e incubare a 55 ° C per 2 min, agitazione a 1.000 giri/min. Dopo la separazione, gettare il surnatante. Ripetere questo lavaggio una volta. Lavare le perle di una volta con 600 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0 e scartare il supernatante dopo la separazione. Risospendere perline in 50 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0. 5. sequenziamento libreria preparazione Nota: Tutti i passaggi di libreria vengono eseguiti utilizzando componenti da una preparazione commerciale della libreria DNA kit (Vedi Tabella materiali). Tuttavia, possono essere sostituite Kit alternativo o altri reagenti. Precipitazione tende a formare negli agenti di preparazione di libreria durante la conservazione nel congelatore. È quindi importante assicurarsi che tutte le precipitazioni sono dissolto prima di utilizzare i reagenti. Riparazione di fine Trasferire la sospensione di perlina in 50 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0 in una nuova provetta PCR. Aggiungere 3 µ l di fine preparazione enzima Mix e 7 µ l di tampone di reazione della preparazione della fine. Mescolare pipettando su e giù. Tubo di trasferimento di un termociclatore ed eseguire il seguente programma: 20 ° C per 30 min, 65 ° C per 30 min e tenere a 4 ° C. Legatura di adattatore Aggiungere 30 µ l di legatura Master Mix, 2,5 µ l di 1,5 µM Sequencing adattatore (diluire a 1,5 µM da stock) e 1 µ l di legatura Enhancer per la sospensione della perla. Mescolare pipettando su e giù. Incubare a 20 ° C per 15 min in un termociclatore. 3 µ l di enzima di utente. Mescolare pipettando su e giù. Incubare a 37 ° C per 15 min in un termociclatore. Separare le perle su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante. Per lavare perline, risospendere perline in 100 µ l di 1x buffer B & W + 0,1% Triton X-100. Mescolare nel vortex e trasferimento ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Separare le perle su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante. Ripetere questo lavaggio una volta utilizzando 600 µ l di buffer stesso. Risospendere perline in 600 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0, mix nel vortex e perline di trasferimento ad un nuovo tubo. Separare le perle su un supporto magnetico, eliminare il surnatante e risospendere perline in 50 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0. Amplificazione di PCR Preparare due provette per PCR e in ognuno, mescolare 25 µ l di polimerasi Master Mix, 1,5 µ l di 10 µM in avanti (non indicizzati) PCR primer e 1,5 µ l di 10 µM Reverse primer PCR (indicizzata).Nota: Forward (non indicizzati) PCR primer:5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T-3 ´.Inversa (indicizzata) primer PCR:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T-3 ´. * indica fosforotioato obbligazioni e Ns in indicizzata primer PCR. In ogni provetta, aggiungere 22 µ l di sospensione tallone e mescolare pipettando su e giù. Eseguire PCR usando il seguente programma: 98 ° C per 1 min, (98 ° C per 15 s, 65 ° C per 75 s, rampa 1.5 ° C/s) ripetuto 9 – 12 volte, 65 ° C per 5 min e tenere a 4 ° C.Nota: Il numero di cicli di amplificazione deve essere determinata empiricamente. Tuttavia, abbiamo trovato che le librerie che ha richiesto più di 12 cicli erano generalmente di bassa complessità e non hanno provocato Hi-C mappe di alta qualità. D’altra parte, le librerie che ha richiesto meno di 12 cicli non sono state colpite negativamente da amplificare per un pieno 12 cicli. Di conseguenza, è possibile per 12 cicli di amplificazione per impostazione predefinita. Piscina le due reazioni di PCR in un tubo del microcentrifuge singolo, separare perline su un supporto magnetico e trasferire il supernatante contenente la libreria in una nuova provetta. Selezione dimensione Portare Ampure XP sospensione tallone a temperatura ambiente e mescolare bene agitando. Portare il volume della reazione PCR in pool a esattamente 200 µ l con acqua. Durante la PCR e la separazione magnetica, alcuno del volume originale è solitamente perso. Verificare il volume impostando la pipetta a 200 µ l e aspirare l’intero volume della reazione. Se l’aria è aspirata, più l’acqua deve essere aggiunto. Se il volume supera 200 µ l, regolare il volume di perline aggiunto nei passaggi 5.4.3 e 5.4.6 proporzionalmente.Nota: I volumi tra parentesi sono validi se il volume totale delle reazioni PCR pool è esattamente 200 µ l. Aggiungere volumi x 0,55 (110 µ l) di sospensione tallone Ampure XP e Miscelare pipettando su e giù almeno 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per 5 min, perline separate su un supporto magnetico per 5 min. Spostare surnatante in un nuovo tubo. Gettare la provetta contenente le perline. Le perle sono associati DNA > 700 bp, che è troppo grande per essere sequenziata. Al supernatante, aggiungere 0,2 x volumi (40 µ l, risultante in un totale di 0,75 x Ampure tampone del campione) di sospensione tallone Ampure XP e mescolare pipettando su e giù per 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per 5 min, perline separate su un supporto magnetico per 5 min. Eliminare il surnatante che contiene DNA < 200 bp, che comprende primer gratuito, dimeri dell'iniettore e frammenti troppo piccoli da sequenziare. Lasciare il tubo sul supporto magnetico. Per lavare perline, aggiungere 700 µ l di etanolo di 80%, facendo attenzione a non disturbare il pellet perlina e incubare per 30 s. Eliminare il surnatante, poi prendere la metropolitana fuori il supporto magnetico e risospendere perline in 100 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0. Mescolare pipettando su e giù per 10 volte e incubare a temperatura ambiente per 1 min. Aggiungere 0,8 x volumi (80 µ l) di sospensione tallone Ampure XP. Mescolare pipettando su e giù per 10 volte e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Questo secondo turno di selezione dimensione limite inferiore assicura che la libreria finale è completamente priva di primer e dimeri dell’iniettore. Separare le perle su un supporto magnetico per 5 min ed eliminare il surnatante. Lavare la pallina di perle due volte con 700 µ l di etanolo di 80% per 30 s ciascuno, lasciando il tubo sul supporto magnetico, come sopra. Con il tubo ancora su supporto magnetico, rimuovere tutte le tracce di etanolo. Aiuta a spingere le goccioline di etanolo dal tubo usando una pipetta P10. Evaporare etanolo residuo per un massimo di 5 min. Prendere il tubo fuori il supporto magnetico e risospendere perline in 50 µ l di 10 mM Tris-Cl a pH 8.0. Mescolare pipettando su e giù per 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, poi separate perline su un supporto magnetico. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Questa è la libreria di Hi-C finale, pronta per essere quantificato e sequenziati sulla prossime generazione di macchine di sequenziamento, secondo le istruzioni del produttore.