Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

1. drosophila embryo’s worden verzameld Opmerking: Een gelijkwaardige embryo’s worden verzameld kan worden uitgevoerd zoals wordt weergegeven in een eerdere publicatie15. Overdracht van jonge eGFP-PCNA vliegen (< 1 week oud) in ei collectie kooien met uitgegist collectie platen16 (1% ethanol, azijnzuur 1% en 4% agar). Collectie kooien verplaatsen naar een incubator ingesteld bij 25 ° C. Incubatie gedurende 1-2 dagen voorafgaand aan de eicelpunctie verbetert aanzienlijk, maar de ei-opbrengst. Wijzigen collectie platen tweemaal per dag. Het verwijderen van platen met embryo’s uit de inzamelingskamer in 30-60 min intervallen. Kleinere intervallen resulteren in minder embryo’s, maar de strengere verdeling van de ontwikkelingsstadia. Verzamelen van meerdere kooien parallel zo dat een ideale > 200 eieren worden gelegd om 30-60 min. De platen bij 25 ° C worden opgeslagen totdat de embryo’s de gewenste leeftijd bereiken. Voor blastoderm fase Incubeer embryo’s (nucleaire kringloop 14), gedurende ongeveer 2 h. Na 2 uur incubatie toevoegen leidingwater uit een spuit fles aan de collectie plaat zodat het volledige oppervlak is bedekt met water. Opschorten van de embryo’s en de gist met een zachte borstel. Giet geresuspendeerde embryo’s uit de collectie plaat in een embryo collectie mand (commerciële cel vulinrichtingen met 100 µm poriegrootte of zelfgemaakte manden17 werk goed), het toevoegen van extra kraanwater uit een spuit fles, indien nodig. In dit stadium, embryo’s van alle platen die verzameld werden parallel te combineren. De gebundelde monster vertegenwoordigt één partij. Wassen van embryo’s door de mand met leidingwater te spoelen van een spuit fles voor 30 s totdat alle gist residu is weggespoeld. Dechorionate embryo’s door het plaatsen van de collectie mand in een 2,5% natriumhypochloriet-oplossing in water. Lichte agitatie door wervelende vergemakkelijkt verwijdering van de chorion. Ga zo verder tot embryo’s voldoende hydrofobe zodat ze op het oppervlak van de oplossing zweven wanneer de mand is opgeheven uit en weer, ondergedompeld die ~1.75–2 min moeten nemen.Let op: natriumhypochloriet is corrosief. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen. Oplossingen met < 10% natriumhypochloriet kan meestal worden afgezet in de gootsteen, zorg ervoor om de regeling van de host-Instituut. Verwijder de mand van de oplossing en Spoel grondig met leidingwater uit een spuit fles tot de geur van bleekmiddel niet meer merkbaar. 2. de embryo fixatie Opmerking: Optimale fixatie voorwaarden, voornamelijk de concentratie van wasmiddel, formaldehyde en de duur van fixatie, moeten empirisch vastberaden aan het stadium van de embryo’s. Voor fasen rond de syncytieel blastoderm, een eindconcentratie van 0,5% Triton X-100 en 1,8% formaldehyde in de waterige fase goed werken. Voor latere stadia dan embryo fase 9, kan verdere optimalisering van deze parameters nodig zijn. Alle oplossingen gebruikt tijdens fixatie en sorteren moeten proteaseinhibitors bevatten. Omkeren van de collectie mand en plaats deze over een tube van 15 mL conische centrifugeren. Spoelen van embryo’s uit de mand in de buis met behulp van een pipet van Pasteur toedieningseenheden PBS-T (PBS, 0,5% Triton X-100). Laat embryo’s vestigen op de bodem en het totale volume aan 2 mL met PBS-T. Voeg 6 mL heptaan en 100 µL van 37% formaldehyde in water.Let op: Heptaan en formaldehyde zijn giftig bij inademing of contact na huid. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen en werken in een zuurkast. Afval bevattende heptaan of formaldehyde moet afzonderlijk worden verwijderd volgens de voorschriften van de Instituut van de host. Na de toevoeging van de formaldehyde, start een timer van 15 min en krachtig schudden de buis omhoog en omlaag voor 1 min met de hand. De waterige en organische fase zal de samenhang van het formulier een shampoo-achtige combineren. Agitate op een hiervoor mixer tot 10 min na toevoeging van formaldehyde. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur voor het verzamelen van de embryo’s aan de onderkant van de buis. De gehele shampoo-achtige vloeistof gecombineerd en verwerpen, verzorgen niet om een embryo’s gecombineerd. Kleine resterende hoeveelheden van shampoo-achtige supernatans veroorzaken geen problemen. 15 min na toevoeging van formaldehyde, resuspendeer de embryo’s in 5 mL PBS-T met 125 mM glycine om quench de formaldehyde. Meng krachtig door schudden op en neer voor 1 min. Centrifugeer bij 500 x g bij kamertemperatuur voor 1 min en supernatant gecombineerd. Wassen van embryo’s door hen in 5 mL ijskoud PBS-T. resuspending Laat embryo’s regelen en aspirate alle bezinken. Herhaal de wash in stap 2.10 twee meer tijden. Houd de embryo’s op het ijs tot sorteren. Meestal is het een goed idee om het verzamelen van 3 – 4 loten van vliegen embryo’s alvorens te sorteren. Echter moeten embryo’s worden gesorteerd op dezelfde dag. Uitgebreide opslag op ijs of in de koelkast leidt tot gewijzigde embryo morfologie. 3. de embryo sorteren Opmerking: Sorteren kan worden gedaan op een fluorescente stereo microscoop voorzien van een filter GFP bij 60-80 X vergroting. Met behulp van een pipet 1.000 µL, een partij van ongeveer 100 embryo’s overbrengen in een kleine glazen schip geschikt voor sorteren, bij voorkeur van een donkere kleur, en plaats deze op het ijs. Soort embryo’s door nucleaire dichtheid en celcyclus status (Figuur 1) door duwen wenselijk embryo’s in een afzonderlijke stapel met behulp van een naald of spuit tip. Verwijder alle embryo’s met verspreide, niet-nucleaire verdeling van eGFP-PCNA (figuur 1E). Ook moeten embryo’s die aantonen dat een niet-nucleaire GFP-signaal gedeeltelijk worden verwijderd. Om te helpen bij het sorteren, verzamelen u een line-up van referentie embryo’s bij nucleaire kringloop 12, 13 en 14 in elke batch met behulp van de afbeeldingen in Figuur 1 als een gids. Gebruik deze line-up ter vervanging van embryo’s van een onbekende etappe met één van de referentie-embryo’s om te bepalen hun stadium. Om te controleren of het ontwikkelingsstadium voor referentie embryo’s, de nucleaire dichtheid te meten door beeldvorming van het embryo en tellen van het aantal kernen aan de oppervlakte van het embryo in een oppervlakte van 2.500 µm2 met behulp van beeldbewerkingssoftware waarmee u afstand informatie toevoegt.Opmerking: Het verwachte aantal kernen voor een oppervlakte van 2.500 µm2 is 12 tot en met 16 kernen op nucleaire kringloop 12 en 20 tot 30 kernen op nucleaire kringloop 1313. Zodra alle embryo’s het passende stadium worden gescheiden, neem foto’s van de embryo’s voor documentatie en kwaliteitscontrole. Als de stereo microscoop niet zelf uitgerust met een cameramodule, kan elke epifluorescence Microscoop met GFP filters worden gebruikt. Pipetteer van de gewenste embryo’s met behulp van een 1.000 µL pipette, transfer naar een verse buis, en de plaats op het ijs. Ga verder tot er voldoende embryo’s worden gesorteerd voor de geplande experiment. Voor embryo’s oudere dan etappe 9, zijn over het algemeen 20 embryo’s voldoende voor een in situ Hi-C experiment. Op nucleaire kringloop 12 zijn 80 embryo’s een goed uitgangspunt. In eerdere cycli, moet het aantal embryo’s ongeveer worden verdubbeld voor elke cyclus. Zwembad en split embryo’s in 1,5 mL buizen op een zodanige wijze dat een buis genoeg embryo’s voor een één in situ Hi-C bevat experimenteren. Het is raadzaam om het gebruik van buizen met lage DNA-bindende eigenschappen, aangezien het dezelfde buis zal worden gebruikt voor het gehele protocol en adsorptie van DNA tot aanzienlijke verliezen bij lage concentraties van DNA leiden kan. Spin buizen kort bij 100 x g bij kamertemperatuur en bovendrijvende vloeistof verwijderen. De embryo’s moet zo droog mogelijk voor bevriezing. Flash bevriezen embryo’s door dompelen de buizen in vloeibare stikstof en winkel bij-80 ° C. 4. in Situ Hi-C Lysis Plaatsen van buisjes met ingevroren embryo’s op ijs. Resuspendeer embryo’s in 500 µL van ijskoude lysis buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.2% IGEPAL CA-630, proteaseinhibitors; opgelost in water). Wacht 1 minuut om te laten van embryo’s vestigen op de onderkant van de buis. Embryo’s met behulp van een metalen micro stamper, vooraf gekoeld op het ijs, dat is ontworpen om strak past een 1,5 mL microcentrifuge buis te slijpen. Om te voorkomen dat schudden van de embryo’s, invoegen van de stamper langzaam totdat de onderkant van de buis raakt, duw omlaag en vervolgens vermalen door het draaien van de stamper tweemaal in beide richtingen. Til de stamper zeer licht, duwen naar de onderkant van de buis opnieuw en herhaal slijpen. 4.1.3.2 herhaal 10 keer, of totdat de embryo’s zijn volledig lysed. De oplossing moet homogene, en geen residuele grote stukken van embryo’s moeten blijven. Incubeer de gehomogeniseerde schorsing op ijs voor 15 min. Spin 1.000 x g4 ° C gedurende 5 minuten, en weggeworpen. Wassen pellet door resuspending in 500 µL ijskoude lysis-buffermengsel, pipetting omhoog en omlaag. Spin opnieuw zoals in 4.1.4 en weggeworpen. Resuspendeer de pellet van de gewassen in 100 µL van 0,5% natrium dodecyl sulfaat (SDS), pipetting omhoog en omlaag. Permeabilize kernen door incubatie gedurende 10 minuten bij 65 ° C in een blok van de verwarming. Doven SDS door 50 µL van 10% Triton X-100 en 120 µL water toe te voegen. Meng door flicking de buis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten in warmte blok. Spijsvertering van het beperkingsenzym Voeg 25 µL van 10 x restrictie-enzym buffer en 20 U van 5 U/µL MboI. Meng door flicking de buis. DNA verteren door incubatie gedurende 90 minuten bij 37 ° C in de warmte blok onder lichte agitatie (750 rpm). Voeg nog eens 20 U van MboI en blijven van incubatie gedurende 90 min. Warmte-inactivering van MboI door aan het broeden bij 62 ° C gedurende 20 min. Overhang fill-inOpmerking: Het invullen van de overhang met biotinyleerd dATP selectie van specifieke ligaturen fragmenten kunt. Biotine-dATP bij afbinding kruisingen is beschermd tegen de exonucleaseactiviteit van T4 Polymerase van DNA (sectie 4.6), overwegende dat Biotine-dATP op unligated stompe uiteinden voor het efficiënt wordt verwijderd. De pulldown met streptavidine beklede kralen in sectie 4.7 daarom speciaal verrijkt voor ligaturen, chimeer DNA-fragmenten. 18 µL van 0,4 mM Biotine-14-dATP, 2,25 µL van een ongewijzigde dCTP/dGTP/dTTP mix (elke 3.3 mM) en 8 µL van 5 U/µL DNA-Polymerase I Klenow Fragment toevoegen. Meng door flicking de buis en Incubeer bij 37 ° C gedurende 90 minuten in warmte blok. Afbinding Voeg 657 µL van water, 120 µL van 10 x T4 DNA Ligase Buffer 100 µL van 10% Triton X-100, 6 µL van 20 mg/mL bovien serumalbumine (BSA), en meng door flicking de buis. Ten slotte voeg 5 µL 5 U/µL T4 DNA Ligase en meng door flicking de buis. Draaien buis zachtjes (20 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Voeg een tweede aflevering van 5 µL van 5 U/µL T4 DNA Ligase en blijven draaien voor 2 meer h. Spin down kernen bij 2.500 x g gedurende 5 min en weggeworpen. DNA-extractie Resuspendeer de pellet in 500 µL van extractie buffer (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), 1% SDS; opgelost in water) en Voeg 20 µL van 20 mg/mL proteïnase K. Mix door flicking de buis. Verteren eiwit door het broeden bij 55 ° C gedurende 30 minuten, schudden bij 1000 omwentelingen per minuut. De-dwarslijn, voeg 130 µL van 5 M NaCl en na een nacht bebroeden bij 68 ° C, schudden bij 1000 omwentelingen per minuut. Pipetteer monster af in een nieuwe 2 mL tube, bij voorkeur met lage DNA-bindende kenmerken. Voeg 0,1 x volumes (63 µL) van 3 M natrium acetaat pH 5.2 en 2 µL van 15 mg/mL GlycoBlue. Meng goed door omkeren. Toevoegen 1.6 x volumes (1008 µL) van zuiver absolute ethanol en meng door het omkeren. Incubeer bij-80 ° C gedurende 15 min. Centrifuge bij 20.000 x g bij 4 ° C gedurende ten minste 30 min. De DNA-pellet is vaak zeer klein, bijna onzichtbaar, en alleen als gevolg van de blauwe kleur van de GlycoBlue kan worden gespot. Verwijderen supernatant zorgvuldig, het uiteinde van de pipet verplaatsen in de buis langs de tegenoverliggende muur van waar de DNA-pellet zich bevindt. Kleine overgebleven druppels zijn vaak gemakkelijk te verwijderen tijdens deze stap en de volgende wasbeurten door het duwen van hen uit de buizen met een P10-tip in plaats van pipetteren hen uit. Wassen pellet door 800 µL van 70% ethanol toe te voegen. Meng door omkeren samen en centrifugeer bij 20.000 x g bij kamertemperatuur voor 5 min. Herhaal deze wassing ten minste eenmaal. Verwijderen van alle sporen van ethanol en laat de buis staan met het deksel open voor maximaal 5 minuten te drogen. Zodra geen vloeistof is overgebleven, voeg 50 µL van 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Pipetteer herhaaldelijk de oplossing over het gebied aan de wand van de buis waar de pellet was gelegen aan de solubilize van het DNA. Voeg 1 µL van 20 mg/mL RNase A, Meng door flicking de buis, en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten te verteren RNA. Het monster kan nu worden opgeslagen in de koelkast ‘s nachts of bevroren bij-20 ° C voor onbepaalde tijd. Controleer de concentratie van DNA met een fluorescente kleurstof gebaseerd assay volgens de instructies van de fabrikant. Het totale bedrag van DNA in de steekproef moet ten minste 10 ng, anders te weinig materiaal is beschikbaar voor versterking en complexiteit van de bibliotheek zal waarschijnlijk laag. Wanneer dit gebeurt, de hoeveelheid grondstof was waarschijnlijk niet voldoende, of materiaal was verloren langs de weg, misschien tijdens lysis en neerslag. Biotine verwijdering en DNA afknippen 12 µL van 10 x de Polymerase van DNA van T4 buffer, 3 µL van 1 mM dATP, 3 µL van 1 mM dGTP en 46 µL van water bij elkaar optelt. Meng door flicking de buis. Voeg 5 µL van 3 T4 DNA-Polymerase van U/mL, Meng door flicking de buis en Incubeer bij 20 ° C gedurende 30 minuten. Voeg 3 µL van het EDTA 0.5 M om te stoppen met de reactie en het gebruik van water om het monster met een volume van ongeveer 120 µL. Schuintrekken het DNA tot een grootte van 200-400 bp met behulp van een ultrasoonapparaat apparaat volgens de instructies van de fabrikant. Met behulp van de ultrasoonapparaat vermeld in de Tabel van materialen, het volgende programma is passende: 2 cycli elk 50 s 10% plicht, en intensiteit 5, 200 cycli/burst. Biotine pulldown Pipetteer 30 µL van 10 mg/mL daar gecoat magnetische kralen in een nieuwe buis, scheiden op een magnetische standaard en wordt weggeworpen. Resuspendeer kralen in 1 x B & W buffer (5 mM Tris-Cl pH 7.4, EDTA 0.5 mM, 1 M NaCl; opgelost in water) + 0,1% Triton X-100 en meng door vortexing. Plaats van de buis op een magnetische standaard en 1 – 5 min wachten totdat de kralen zijn gescheiden, afhankelijk van het merk en model. Gecombineerd en weggeworpen tijdens het schuiven van het uiteinde van de pipet langs de muur tegenover van de kralen bevinden. Resuspendeer kralen in 120 µL van 2 x B & W buffer (10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA en 2 M NaCl). Meng door vortexing. Sheared DNA overbrengen naar een nieuwe laag DNA-bindende buis, en meng met 120 µL van de kraal suspensie in 2 X B & W buffer door vortexing. Kralen met het DNA-monster bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 15 minuten draaien. Scheiden van de kralen op een magnetische standaard en wordt weggeworpen. Resuspendeer kralen in 600 µL 1 x B & W + 0,1% Triton X-100 en Incubeer bij 55 ° C gedurende 2 minuten, schudden bij 1000 omwentelingen per minuut. Na scheiding, weggeworpen. Deze wassing eenmaal herhaald. Kralen eenmaal met 600 µL van 10 mM Tris-Cl pH 8,0 wassen, en na scheiding wordt weggeworpen. Resuspendeer kralen in 50 µL van 10 mM Tris-Cl pH 8,0. 5. sequencing bibliotheek voorbereiding Opmerking: Alle bibliotheek stappen zijn gedaan met behulp van componenten uit een commerciële DNA bibliotheek voorbereiding kit (Zie Tabel van materialen). Echter kunnen alternatieve kits of andere reagentia worden vervangen. Neerslag neigt naar formulier in de bibliotheek voorbereiding agenten tijdens de diepvries opslag. Daarom is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle neerslag is ontbonden vóór het gebruik van de reagentia. Einde reparatie Spoel de suspensie van de parel in 50 µL van 10 mM Tris-Cl pH 8,0 in een nieuwe PCR-buis. Voeg 3 µL van einde Prep enzym Mix en 7 µL van einde Prep reactie Buffer. Meng door pipetteren omhoog en omlaag. Buis overbrengen in een thermische cycler en voer het volgende programma: 20 ° C gedurende 30 minuten, 65 ° C gedurende 30 minuten, en houd bij 4 ° C. Adapter afbinding Voeg 30 µL van afbinding Master Mix, 2.5 µL van 1,5 µM Sequencing adapter (verdund tot 1,5 µM uit voorraad) en 1 µL van afbinding Enhancer tot de schorsing van de kraal. Meng door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer bij 20 ° C gedurende 15 min. in een thermische cycler. Voeg 3 µL van gebruiker enzym. Meng door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min. in een thermische cycler. Scheid de kralen op een magnetische standaard en bovendrijvende vloeistof verwijderen. Resuspendeer te wassen kralen parels in 100 µL van 1 x B & W buffer + 0,1% Triton X-100. Meng door vortexing, en overdracht aan een nieuwe microcentrifuge buis. Scheid de kralen op een magnetische standaard en bovendrijvende vloeistof verwijderen. Herhaal deze keer met behulp van 600 µL van de dezelfde buffer wassing. Resuspendeer kralen in 600 µL van 10 mM Tris-Cl pH 8.0, Meng door vortexing, en kralen overbrengen in een nieuwe buis. Aparte parels op een magnetische staan, wordt weggeworpen en resuspendeer kralen in 50 µL van 10 mM Tris-Cl pH 8,0. PCR versterking Twee PCR buizen voor te bereiden en in elk, Meng 25 µL van Polymerase Master Mix, 1.5 µL van 10 µM Forward (niet-geïndexeerde) PCR Inleiding en 1,5 µL van 10 µM Reverse (geïndexeerde) PCR Inleiding.Opmerking: Sturen (niet-geïndexeerde) PCR Inleiding:5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T-3´.Omgekeerde (geïndexeerde) PCR Inleiding:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T-3´. * geeft phosphorothioate obligaties en Ns in de geïndexeerde PCR-primer. In elke buis, voeg 22 µL kraal schorsing en meng door pipetteren omhoog en omlaag. Uitvoeren van PCR met behulp van het volgende programma: 98 ° C gedurende 1 min, (98 ° C gedurende 15 s, 65 ° C gedurende 75 s, speedramp 1,5 ° C/s) herhaald 9 – 12 keer, 65 ° C gedurende 5 minuten, en houd bij 4 ° C.Opmerking: Het aantal cycli van versterking moet empirisch worden bepaald. We vonden echter dat bibliotheken die meer dan 12 cycli vereist over het algemeen lage complexiteit waren en niet resulteren in hoge kwaliteit die Hi-C kaarten. Aan de andere kant, bibliotheken waarvoor minder dan 12 cycli niet negatief beïnvloed door sturen voor een volledige 12 cycli. Het is daarom mogelijk standaard 12 cycli van versterking. Zwembad de twee PCR reacties in een enkele microcentrifuge buis, scheiden van de kralen op een magnetische stand, en breng het supernatant met de bibliotheek om een nieuwe buis. Maat keuze Breng Ampure XP kraal schorsing aan kamertemperatuur en meng goed door schudden. Volume van de gebundelde PCR reactie op precies 200 µL met water te brengen. Tijdens de PCR en de magnetische scheiding is enkele van het oorspronkelijke volume meestal verloren. Controleer volume door het instellen van de pipet op 200 µL en het gehele volume van de reactie gecombineerd. Als lucht is aanzuiging, meer water moet worden toegevoegd. Als het volume groter is dan 200 µL, het volume van kralen toegevoegd in stap 5.4.3 en 5.4.6 proportioneel aanpassen.Noot: De volumes haakjes zijn geldig als het totale volume van de gebundelde PCR reacties precies 200 µL is. Voeg 0.55 x hoeveelheid (110 µL) Ampure XP kraal schorsing en meng door pipetteren op en neer ten minste 10 keer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, aparte kralen op een magnetische stand gedurende 5 minuten. Supernatant verplaatsen naar een nieuwe buis. Gooi de buis met de kralen. De kralen hebben gebonden DNA > 700 bp, die is te groot om te worden gesequentieerd. Toevoegen aan het supernatant, 0,2 x volumes (40 µL, resulterend in een totaal van 0,75 x Ampure buffer in de steekproef) van Ampure XP kraal schorsing en meng door pipetteren op en neer 10 keer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, aparte kralen op een magnetische stand gedurende 5 minuten. Vloeistof wordt weggeworpen waarin DNA < 200 bp, waaronder gratis inleidingen, inleidingsdimeer en fragmenten te klein aan het worden sequenced. Laat de buis op de magnetische stand. Te wassen kralen, voeg 700 µL van 80% ethanol, verzorgen niet te verstoren de kraal pellet en incubeer gedurende 30 s. Vloeistof wordt weggeworpen, dan nemen de buis van de magnetische standaard en resuspendeer kralen in 100 µL van 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Meng door pipetteren op en neer 10 keer en Incubeer bij kamertemperatuur voor 1 min. Voeg 0.8 x hoeveelheid (80 µL) Ampure XP kraal schorsing. Meng door pipetteren op en neer 10 keer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Deze tweede ronde van ondergrens grootte selectie zorgt ervoor dat de definitieve bibliotheek volledig gratis primers en inleidingsdimeer is. Aparte parels op een magnetische staan voor 5 min en weggeworpen. Wassen van de kraal pellet tweemaal met 700 µL van 80% ethanol voor 30 s elk, terwijl het verlaten van de buis op de magnetische voet, zoals hierboven beschreven. Met de buis nog steeds op de magnetische stand, verwijderen van alle sporen van ethanol. Het helpt om te duwen druppels van ethanol uit de buis met behulp van een precisiepipet P10. Laat de resterende ethanol verdampen voor een maximum van 5 min. Neem van de buis van de magnetische standaard en resuspendeer kralen in 50 µL van 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Meng door pipetteren op en neer 10 keer. Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 minuten, dan is aparte kralen op een magnetische voet. Supernatant overbrengen in een verse buis. Dit is de laatste Hi-C bibliotheek, klaar om te worden gekwantificeerd en sequenced op volgende generatie sequencing machines, volgens de instructies van de fabrikant.