Generación de bibliotecas de captura de conformación de genoma cromatina desde etapas bien tempranas embriones de Drosophila

1. colección de embriones de drosophila Nota: Una colección equivalente embrionario puede realizarse como se muestra en una anterior publicación15. Transferencia de moscas jóvenes eGFP-PCNA (< 1 semana de edad) en jaulas de colección de huevo con yeasted colección placas de16 (1% de etanol, ácido acético al 1% y 4% de agar). Mover jaulas de colección a una incubadora a 25 ° C. Incubación de 1 a 2 días antes de la recogida de huevos aumenta significativamente la producción de huevo. Cambiar las placas de la colección dos veces al día. Retire las placas que contienen los embriones de la cámara de recogida en intervalos de 30 a 60 min. Intervalos más pequeños resultan en menos embriones, pero la mayor distribución de etapas de desarrollo. Recoger de varias jaulas en paralelo así que idealmente > 200 huevos se colocan cada 30 – 60 min. Almacenar las placas a 25 ° C hasta que los embriones alcancen la edad deseada. De embriones en fase de blastoderm (ciclo nuclear 14), incuban durante aproximadamente 2 horas. Después de 2 h de incubación, añadir agua del grifo de una botella de squirt a la placa de la colección para que toda la superficie se cubre con agua. Suspender los embriones y la levadura con un cepillo suave. Vierta resuspendidos embriones de la placa de la colección en una canasta de la colecta de embriones (coladores celulares comerciales con tamaño de poro de 100 μm o cestas caseras17 funcionan bien), agregando más agua del grifo de una botella de squirt, si es necesario. En esta etapa, se combinan los embriones de todas las placas que se recolectaron en paralelo. La muestra colectiva representa un único lote. Lavar los embriones bien aclarando la cesta con agua del grifo de una botella de squirt por 30 s, hasta que todo el residuo de la levadura se lava lejos. Dechorionate de embriones mediante la colocación de la canasta en una solución de hipoclorito de sodio al 2,5% en agua. Ligera agitación agitando facilita la eliminación del corión. Continuar hasta que los embriones son suficientemente hidrofóbicos que flotan en la superficie de la solución cuando la cesta está levantada y sumergida de nuevo, que debe tomar ~1.75–2 min.PRECAUCIÓN: hipoclorito de sodio es corrosivo. Use equipo de protección personal. Soluciones que contengan < 10% hipoclorito de sodio generalmente pueden eliminarse en el fregadero, asegúrese de consultar la normativa del Instituto anfitrión. Retire la cesta de la solución y enjuague con agua del grifo de una botella de squirt hasta que el olor de la lejía no es sensible. 2. embrión fijación Nota: Las condiciones de fijación óptima, sobre todo la concentración de detergente, formaldehído y la duración de la fijación, deben ser determinados empíricamente para adaptarse a la etapa de los embriones. Para los estadios en el blastoderm sincitial, una concentración final de 0,5% Tritón X-100 y 1,8% formaldehído en la fase acuosa funciona bien. Para etapas posteriores más allá de la etapa de embrión 9, mayor optimización de estos parámetros puede ser necesario. Todas las soluciones utilizadas durante la fijación y ordenación deben contener inhibidores de la proteasa. Invierta la canasta y coloque sobre un tubo de centrifugación cónicos de 15 mL. Enjuague los embriones de la cesta en el tubo con una pipeta Pasteur dispensación PBS-T (PBS, 0,5% Tritón X-100). Dejar embriones colocan en la parte inferior y ajustar el volumen total de 2 mL con PBS-T. Añadir 6 mL de heptano y 100 μl de formaldehído al 37% en agua.PRECAUCIÓN: Heptano y formaldehído son tóxicos cuando se inhalan o después de la piel en contacto con. Usar equipo de protección personal y trabajar en una campana de humos. Residuos que contengan heptano o formaldehído debe desecharse por separado según las regulaciones del Instituto anfitrión. Después de añadir el formol, iniciar un temporizador de 15 minutos y agite vigorosamente el tubo hacia arriba y abajo durante 1 minuto a mano. La fase acuosa y orgánica se combina para consistencia forma un como shampoo. Agitar en un mezclador rotatorio hasta 10 minutos después de la adición de formaldehído. Centrifugar a 500 x g durante 1 min a temperatura ambiente para recolectar embriones en la parte inferior del tubo. Aspirar el líquido shampoo-como todo y desecharlo, teniendo cuidado de no para aspirar cualquier embriones. Pequeñas cantidades restantes de champú como sobrenadante no causan problemas. 15 minutos después de la adición de formaldehído, resuspender los embriones en 5 mL de PBS-T con glicina 125 mM para saciar el formaldehído. Mezcle vigorosamente agitando arriba y abajo durante 1 minuto. Centrifugar a 500 x g durante 1 min y aspirar el sobrenadante. Lavado de embriones por resuspender en 5 mL de PBS-T. helada Deje el settle de embriones y Aspire todo el sobrenadante. Repetir el lavado en el paso 2.10 dos veces más. No embriones en hielo hasta su clasificación. Por lo general, es una buena idea para recoger 3 o 4 lotes de embriones mosca antes de proceder a la clasificación. Sin embargo, los embriones deben ordenarse el mismo día. Almacenamiento prolongado en hielo o en la nevera lleva a morfología embrionaria alterada. 3. embrión de clasificación Nota: La clasificación se puede hacer en cualquier fluorescente microscopio estéreo equipado con un filtro GFP con aumentos de 60 – 80. Con una pipeta de 1000 μl, transferir un lote de aproximadamente 100 embriones a un recipiente de vidrio adecuado para clasificar, preferiblemente de un color oscuro y coloque en hielo. Embriones de tipo nuclear estado densidad y ciclo celular (figura 1) empujando embriones deseables en una pila separada usando una punta de aguja o jeringa. Quite todos los embriones con distribución dispersa, no nuclear de eGFP-PCNA (Figura 1E). Además, deben eliminarse embriones que parcialmente muestran una señal GFP no nucleares. Para ayudar en la clasificación, montar una line de embriones de referencia en el ciclo nuclear 12, 13 y 14 de cada lote utilizando los cuadros en la figura 1 como guía. Use esta line a embriones de una etapa desconocida con uno de los embriones de referencia para determinar su estado. Para comprobar la etapa de desarrollo de embriones de la referencia, medir la densidad nuclear proyección de imagen del embrión y contar el número de núcleos en la superficie del embrión en un área de 2.500 μm2 utilizando el software de imágenes que proporciona información de la distancia.Nota: El número esperado de núcleos para un área de 2.500 μm2 es 12 a 16 núcleos en el ciclo nuclear 12 y 20 a 30 núcleos en el ciclo nuclear 1313. Una vez que se separan todos los embriones en la etapa adecuada, tomar fotografías de los embriones para la documentación y control de calidad. Si el microscopio estéreo no es equipado con un módulo de cámara, puede utilizarse cualquier microscopio de epifluorescencia con filtros GFP. Pipeta hasta los embriones deseados utilizando una pipeta de 1000 μl, traslado a un lugar y tubo fresco en hielo. Continúe hasta que suficientes embriones se clasifican para el experimento planeado. Mayor de embriones de etapa 9, generalmente 20 embriones son suficientes para uno en situ Hi-C experimento. En el ciclo nuclear 12, 80 embriones son un buen punto de partida. En ciclos anteriores, el número de embriones debe doblarse aproximadamente para cada ciclo. Piscina y dividir los embriones en tubos de 1,5 mL de tal manera que un tubo contiene suficientes embriones para un solo en situ Hi-C del experimento. Es aconsejable utilizar tubos con bajo características de enlace de ADN, ya que el mismo tubo se utilizará para el conjunto del protocolo y adsorción del ADN puede llevar a importantes pérdidas a bajas concentraciones de ADN. Girar los tubos brevemente a 100 x g a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Los embriones deben estar tan secos como sea posible para la congelación. Flash congelar embriones sumergiendo los tubos en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C. 4. in Situ Hi-C Lisis de Colocar tubos con embriones congelados en el hielo. Resuspender los embriones en 500 μl de tampón de lisis helada (10 mM Tris-Cl de pH 8.0, 10 mM NaCl, 0,2% IGEPAL CA-630, inhibidores de la proteasa, disuelto en agua). Espere 1 minuto para permitir que los embriones colocar en la parte inferior del tubo. Embriones de molienda usando un mortero micro metal, previamente enfriado en hielo, está diseñado para caber firmemente un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Para evitar la agitación de los embriones, inserte la mano lentamente hasta que toque la parte inferior del tubo de empuje hacia abajo y luego moler girando la mano dos veces en ambas direcciones. Levante la mano ligeramente empuje hasta el fondo del tubo de nuevo y repita el pulido. Repetir 4.1.3.2 10 veces, o hasta que los embriones son completamente lisados. La solución debe ser homogénea, y no trozos residuales de embriones deben permanecer. Incubar la suspensión homogeneizada en hielo por 15 min centrifugado a 1.000 x g, 4 ° C por 5 min y descartar el sobrenadante. Lavar el pellet a resuspender en 500 μl de tampón de lisis helada, pipeteo arriba y abajo. Vuelta otra vez como en 4.1.4 y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado lavado en 100 μl de 0.5% sodio dodecil sulfato (SDS), pipetear arriba y abajo. Permeabilizar los núcleos por incubar 10 min a 65 ° C en un bloque de la calefacción. Quench SDS agregando 50 μl de 10% Tritón X-100 y 120 μl de agua. Mezclar agitando el tubo. Incubar a 37 ° C durante 15 min en el bloque de calor. Digestión de la enzima de restricción Añada 25 μl de 10 x buffer de la enzima de la restricción y 20 U de 5 U/μl MboI. Mezclar agitando el tubo. Digerir el ADN por incubación durante 90 minutos a 37 ° C en el bloque de calor bajo agitación leve (750 rpm). Añadir otro 20 U de MboI y continuar la incubación durante 90 minutos. Inactive por calor el MboI por incubación a 62 ° C por 20 min. Relleno de la proyecciónNota: Llenar en el alero con dATP biotinilado permite la selección de fragmentos específicos ligados. Biotina-dATP en ensambladuras de la ligadura está protegido de la actividad de exonucleasa de T4 DNA polimerasa (sección 4.6), mientras que la biotina-dATP en unligated extremos romos se elimina eficientemente. El menú desplegable con perlas recubiertas de estreptavidina en la sección 4.7 por lo tanto específicamente enriquece para fragmentos de ADN ligados, quiméricos. Añadir 18 μL de 0.4m m biotina-14-dATP, 2.25 μl de una mezcla sin modificar de la dCTP/dGTP/dTTP (3,3 mM) y 8 μl de 5 U/μl ADN polimerasa I Klenow fragmento. Mezclar agitando el tubo e incubar a 37 ° C durante 90 min en el bloque de calor. Ligadura de Añadir 657 μl de agua, 120 μl de tampón de Ligase de la DNA de 10 x T4, 100 μl de 10% Tritón X-100, 6 μl de 20 mg/mL albúmina sérica bovina (BSA) y homogeneizar agitando el tubo. Finalmente añadir 5 μl de 5 U/μl T4 ADN ligasa y mezcle agitando el tubo. Gire el tubo suavemente (20 rpm) a temperatura ambiente durante 2 h. Añadir una segunda entrega de 5 μl de 5 U/μl T4 ADN ligasa y continúe girando para 2 h más. Desactivación de los núcleos a 2.500 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante. Extracción de ADN Resuspender el precipitado en 500 μl de tampón de extracción (50 mM Tris-Cl de pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1% SDS, disuelto en agua) y agitando el tubo, añada 20 μl de proteinasa K. Mix de 20 mg/mL. Digerir proteínas por incubar a 55 ° C por 30 min, agitando a 1.000 rpm. De reticulación, añadir 130 μl de 5 M NaCl e incubar durante una noche a 68 ° C, agitando a 1.000 rpm. Muestra de la pipeta en un tubo nuevo de 2 mL, preferentemente con bajas características de enlace de ADN. Añadir 0,1 volúmenes de x (63 μL) de acetato de sodio de 3 M pH 5.2 y 2 μl de 15 mg/mL GlycoBlue. Mezclar bien por inversión del tubo. Añadir volúmenes de x 1,6 (1.008 μL) de etanol absoluto puro y mezclar por inversión del tubo. Incubar a-80 ° C durante 15 minutos la centrifugadora a 20.000 x g a 4 ° C durante al menos 30 minutos. El pellet de DNA es a menudo muy pequeña, casi invisible y sólo puede ser identificado por el color azul de GlycoBlue. Eliminar sobrenadante cuidadosamente, moviendo la punta de la pipeta en el tubo a lo largo de la pared opuesta de donde se encuentra el pellet de DNA. Pequeñas gotitas restantes se eliminan a menudo fácilmente durante este paso y los siguientes lavados, empujando fuera de los tubos usando una punta de P10 en lugar de pipeteado hacia fuera. Lavar el pellet al añadir 800 μl de etanol al 70%. Mezclar por inversión del tubo y centrifugar a 20.000 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos repetir este lavado al menos una vez. Eliminar los restos de etanol y dejar el pie del tubo con la tapa abierta para 5 minutos deje secar al aire. Una vez que se queda sin líquido, añada 50 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0. Pipetear repetidamente la solución sobre el área en la pared del tubo donde se encontraba el pellet para solubilizar el ADN. Añadir 1 μl de Rnasa A, homogeneizar agitando el tubo, de 20 mg/mL e incubar a 37 ° C por 15 min de digerir RNA. La muestra se puede guarda en la nevera durante la noche o congelada a-20 ° C indefinidamente. Compruebe la concentración de ADN usando un colorante fluorescente basado en análisis según las instrucciones del fabricante. La cantidad total de ADN en la muestra debe ser al menos 10 ng, de lo contrario demasiado poco material está disponible para la amplificación y complejidad de biblioteca probablemente será baja. Cuando esto sucede, probablemente no era suficiente la cantidad de material de partida, o material se perdió en el camino, tal vez durante la lisis y la precipitación. Eliminación de biotina y ADN de corte Añadir a 12 μl de tampón de polimerasa de la DNA de T4 x 10, 3 μl de 1 mM de dATP, 3 μl de 1 mM dGTP y 46 μl de agua. Mezclar agitando el tubo. Añadir 5 μl de 3 U/mL T4 DNA polimerasa, mezclar agitando el tubo e incubar a 20 ° C por 30 min. Agregar 3 μl de EDTA de 0,5 M para detener la reacción y utilizar el agua para llevar la muestra a un volumen de aproximadamente 120 μl. Corte del ADN a un tamaño de 200 – 400 bp usando un dispositivo de sonicación según las instrucciones del fabricante. Con el sonicador mencionado en la Tabla de materiales, el siguiente programa es apropiado: 2 ciclos cada uno de los 50 s, deber del 10%, intensidad 5, 200 ciclos/explosión. Desplegable de biotina Pipetear 30 μl de granos magnéticos de streptavidin recubierto de 10 mg/mL en un tubo nuevo, separado en un soporte magnético y descartar el sobrenadante. Resuspender los granos en 1 x buffer B & W (5 mM Tris-Cl de pH 7.4, EDTA 0,5 mM, 1 M NaCl, disuelto en agua) + 0,1% Tritón X-100 y mezclar con un vórtex. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere por 1 – 5 min hasta que los granos son separados, dependiendo de la marca y modelo. Aspirar y descartar sobrenadante mientras desliza la punta de la pipeta a lo largo de la pared opuesta de donde se encuentran los granos. Resuspender los granos en 120 μl de 2 x tampón B & W (10 mM Tris-Cl pH 7.4, EDTA 1 mM y 2 M de NaCl). Mezclar con un vórtex. Transferencia de ADN esquilado a un nuevo tubo de unión de ADN bajo y mezclar con 120 μl de la suspensión de grano en buffer X B & W 2 Vortex. Gire los granos con la muestra de ADN a 20 rpm por 15 minutos. Separar los granos en un soporte magnético y descartar el sobrenadante. Resuspender granos en 600 μl de 1 x B & W + 0,1% Tritón X-100 e incubar a 55 ° C por 2 min, agitando a 1.000 rpm. Después de la separación, deseche el sobrenadante. Repita este lavado una vez. Lavar los granos una vez con 600 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0 y desechar el sobrenadante después de la separación. Resuspender los granos en 50 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0. 5. secuencia biblioteca elaboración Nota: Los pasos de la biblioteca se realizan utilizando componentes de una preparación comercial de la biblioteca de DNA kit (véase Tabla de materiales). Sin embargo, se pueden sustituir otros reactivos o kits alternativos. Precipitación tiende a formarse en los agentes de preparación de la biblioteca durante el almacenaje de congelador. Por lo tanto es importante asegurarse de que toda precipitación se disuelve antes de usar los reactivos. Reparación final Transferir la suspensión de grano en 50 μl de 10 mM de Tris-Cl de pH 8.0 en un nuevo tubo PCR. Agregar 3 μl de mezcla de enzima preparación final y 7 μl de tampón de reacción preparación final. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Transferir el tubo a un termociclador y ejecutar el siguiente programa: 20 ° C por 30 min, 65 ° C durante 30 minutos y mantenga a 4 º C. Ligadura de adaptador Añadir 30 μl de mezcla maestra de ligadura, 2.5 μl de 1,5 μm adaptador de secuencia (diluir a 1.5 μm de la acción) y 1 μl de reforzador de la ligadura a la suspensión de grano. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Incubar a 20 ° C durante 15 minutos en un termociclador. Agregar 3 μl de enzima de usuario. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Incubar a 37 ° C durante 15 minutos en un termociclador. Separar los granos en un soporte magnético y eliminar el sobrenadante. Lavar granos, suspender cuentas en 100 μl de 1 x buffer B & W + 0,1% Tritón X-100. Mezcla por Vortex y transfiéralo a un tubo nuevo de microcentrífuga. Separar los granos en un soporte magnético y eliminar el sobrenadante. Repita este lavado una vez con 600 μl de la solución de la misma. Suspender cuentas en 600 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0, mezcla por Vortex y transferir los granos a un tubo nuevo. Separar los granos en un soporte magnético, deseche el sobrenadante y granos de resuspender en 50 μl de 10 mM de Tris-Cl de pH 8.0. Amplificación por PCR Preparar dos tubos PCR y en cada uno, mezclar 25 μl de polimerasa Master Mix, 1,5 μl de 10 μm hacia adelante () primer PCR y 1,5 μl de reversa (indexadas) PCR primer de 10 μm.Nota: Reenviar (indizada) cartilla de la polimerización en cadena:5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T 3´.Inversa (indexada) cartilla PCR:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T 3´. * indica fosfotioato bonos y Ns en la cartilla PCR indexada. En cada tubo, agregue 22 μL de suspensión de grano y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Ejecutar mediante el siguiente programa PCR: 98 ° C por 1 min, (98 ° C por 15 s, 65 ° C durante 75 s, rampa de 1,5 ° C/s) repite 9 – 12 veces, 65 ° C durante 5 min y mantener a 4 ° C.Nota: El número de ciclos de amplificación debe determinarse empíricamente. Sin embargo, encontramos que las bibliotecas que requieren más de 12 ciclos eran en general de baja complejidad y no dio lugar a alta calidad que HI-C mapas. Por otra parte, las bibliotecas que requieren menos de 12 ciclos no fueron afectadas negativamente por amplificación para un total de 12 ciclos. Por lo tanto, es posible defecto a 12 ciclos de amplificación. Piscina las dos reacciones de PCR en un tubo de microcentrífuga sola, separar los granos en un soporte magnético y transferir el sobrenadante que contiene la biblioteca a un tubo nuevo. Selección del tamaño Traer Ampure XP suspensión de grano a temperatura ambiente y mezclar bien por agitación. Llevar el volumen de la reacción de PCR combinada a exactamente 200 μL con agua. Durante la PCR y la separación magnética, algo del volumen original se pierde generalmente. Verificar el volumen mediante el establecimiento de la pipeta de 200 μl y aspirar todo el volumen de la reacción. Si se aspira aire, más agua necesita ser añadido. Si el volumen es superior a 200 μL, ajustar el volumen de granos agregado en los pasos 5.4.3 y 5.4.6 proporcionalmente.Nota: Los volúmenes en paréntesis son válidos si el volumen total de las reacciones de PCR combinados es exactamente 200 μl. Añadir volúmenes de x 0,55 (110 μl) de suspensión de grano Ampure XP y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo por lo menos 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min., cuentas separadas en un soporte magnético para 5 minutos. Pasar el sobrenadante a un tubo nuevo. Desechar el tubo que contiene los granos. Los granos han consolidado ADN > 700 bp, que es demasiado grande para ser secuenciado. En el sobrenadante, agregar 0,2 volúmenes de x (40 μl, resultando en un total de 0,75 x Ampure buffer de la muestra) de suspensión de grano Ampure XP y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min., cuentas separadas en un soporte magnético para 5 minutos. Deseche el sobrenadante que contiene ADN < 200 bp, que incluye cartillas gratis, dímeros de primer y fragmentos demasiado pequeños para ser secuenciado. Dejar el tubo en el soporte magnético. Lavar los granos, añadir 700 μl de etanol al 80%, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento de grano e incube durante 30 s. Deseche el sobrenadante, tomar el tubo del soporte magnético y granos de resuspender en 100 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto. Añadir volúmenes de x 0,8 (80 μL) de suspensión de grano de Ampure XP. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Esta segunda ronda de selección de tamaño de límite inferior asegura que la biblioteca final está totalmente libre de cartillas y dímeros de primer. Separar los granos en un soporte magnético para 5 min y descarte el sobrenadante. Lavar el sedimento de grano dos veces con 700 μl de etanol al 80% para 30 s cada uno, dejando el tubo en el soporte magnético, como el anterior. Con el tubo en el soporte magnético, eliminar todos los restos de etanol. Ayuda a empujar las gotas de etanol del tubo con una pipeta P10. Que etanol residual se evapora hasta un máximo de 5 minutos. Tomar el tubo del soporte magnético y granos de resuspender en 50 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, a continuación, los granos separados en un soporte magnético. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Esta es la biblioteca de Hi-C final, lista para ser cuantificado y secuenciado en máquinas de secuencia de la generación siguiente, según las instrucciones del fabricante.