Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

1. Drosophila Embryos Sammlung Hinweis: Eine gleichwertige Embryo-Sammlung kann durchgeführt werden, wie in einer früheren Publikation15dargestellt. Junge eGFP-PCNA fliegen übertragen (< 1 Woche alt) in ei Sammlung Käfige mit yeasted Sammlung Platten16 (1 % Ethanol, Essigsäure 1 % und 4 % Agar). Verschieben Sie Sammlung Käfige in Inkubator eingestellt bei 25 ° C. Inkubation für 1 – 2 Tage vor der Eizellentnahme verbessert Ei Ertrag erheblich. Wechselteller Sammlung zweimal am Tag. Entfernen Sie Platten mit Embryonen aus der Sammelkammer in Intervallen von 30 – 60 min.. Kleinere Intervalle führen zu weniger Embryonen, aber engere Verteilung der Entwicklungsstadien. Sammeln von mehreren Käfigen parallel also, die im Idealfall > 200 Eier werden alle 30 – 60 min gelegt. Speichern Sie die Platten bei 25 ° C, bis die Embryonen das gewünschte Alter erreichen. Für Blastoderm Embryonen (nukleare Zyklus 14) ca. 2 h inkubieren. Fügen Sie nach 2 h Inkubation Leitungswasser aus einer Spritzflasche Sammlung Platte so dass die gesamte Oberfläche mit Wasser bedeckt ist. Aussetzen von Embryonen und Hefe, mit einer weichen Bürste. Gießen Sie resuspendierte Embryonen aus der Sammlung Platte in ein Embryo fangkorb (kommerzielle Zelle Siebe mit 100 µm Porengröße oder hausgemachte Körbe17 gut funktionieren), Hinzufügen von zusätzlichen Leitungswasser aus einer Spritzflasche, bei Bedarf. Kombinieren Sie in diesem Stadium Embryonen von alle Platten, die parallel gesammelt wurden. Die gepoolte Probe repräsentiert einen einzelnen Batch. Waschen von Embryonen gut durch spülen den Korb mit Leitungswasser aus einer Spritzflasche für 30 s bis alle Hefe Rückstände abgespült werden. Dechorionate Embryonen indem man den Fangkorb zu einer 2,5 % Natriumhypochlorit-Lösung in Wasser. Leichte Erregung durch Umschwenken erleichtert die Entfernung von der Chorion. Weiter bis Embryonen ausreichend hydrophob sind, so dass sie an der Oberfläche der Lösung, Schwimmen wenn der Korb ist herausgehoben und wieder getaucht was ~1.75–2 min dauern sollte.Achtung: Natriumhypochlorit ist ätzend. Tragen Sie geeignetsten persönliche Schutzausrüstung. Lösungen mit < 10 % Natriumhypochlorit in der Regel in der Spüle entsorgt werden, stellen Sie sicher, dass die Regelungen des Gastinstituts. Entfernen Sie den Korb aus der Projektmappe und spülen Sie gründlich mit Leitungswasser aus einer Spritzflasche aus, bis der Bleichmittel Geruch nicht mehr spürbar ist. (2) Embryo Fixierung Hinweis: Optimale Fixation Bedingungen, vor allem die Konzentration an Waschmittel, Formaldehyd und die Dauer der Fixierung, empirisch ermittelte die Bühne der Embryonen passen müssen. Für Bühnen rund um den syncytial Blastoderm eine Endkonzentration von 0,5 % Triton x-100 und 1,8 % Formaldehyd in der wässrigen Phase gut funktionieren. Für die späteren Stadien Embryo Stadium 9 kann weitere Optimierung dieser Parameter erforderlich sein. Alle Lösungen, die während der Fixierung und Sortierung verwendet sollte Protease-Inhibitoren enthalten. Invertieren Sie fangkorb zu und legen Sie es über eine 15 mL konische Zentrifugation Röhre. Embryonen aus dem Korb in das Rohr mit einer Pasteurpipette Verzicht auf PBS-T spülen (PBS, 0,5 % Triton x-100). Lassen Sie die Embryonen an der Unterseite zu begleichen und passen Sie das Gesamtvolumen auf 2 mL mit PBS-T. 6 mL Heptan und 100 µL 37 % Formaldehyd in Wasser hinzufügen.Achtung: Heptan und Formaldehyd sind giftig beim Einatmen oder nach Hautkontakt kontaktieren. Tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung und arbeiten unter einem Abzug. Abfall, Heptan oder Formaldehyd enthalten muss separat das Gastinstitut vorschriftsmäßig entsorgt werden. Starten Sie nach der Zugabe der Formaldehyd einen 15 min Timer und schütteln Sie kräftig das Rohr nach oben und unten für 1 min von hand. Die wässrige und organische Phase wird in Form einer Shampoo-ähnliche Konsistenz kombinieren. Regen Sie auf einem rotatorischen Mixer bis 10 min nach der Zugabe von Formaldehyd. Zentrifugieren Sie bei 500 X g für 1 min bei Raumtemperatur, Embryonen am unteren Ende der Röhre zu sammeln. Abzusaugen Sie die gesamte Shampoo-ähnliche Flüssigkeit und entsorgen Sie, kümmert sich nicht um alle Embryonen Aspirieren. Kleine Restmengen Shampoo-ähnliche überstand verursachen keine Probleme. 15 Minuten nach der Zugabe von Formaldehyd, Aufschwemmen der Embryonen in 5 mL PBS-T mit 125 mM Glycin das Formaldehyd zu stillen. Mischen Sie kräftig von oben und unten für 1 min schütteln. Bei 500 X g bei Raumtemperatur für 1 min zentrifugieren Sie und Aspirieren Sie überstand. Waschen von Embryonen durch resuspending ihnen in 5 mL eiskaltem PBS-T. Lassen Sie Embryonen Settle und aspirat alle überstand. Wiederholen Sie die Wäsche in Schritt 2.10 zwei weitere Male. Halten Sie die Embryonen auf Eis bis zu sortieren. In der Regel ist es eine gute Idee, 3 – 4 Chargen von Fly Embryonen, bevor Sie fortfahren zu sammeln, zu sortieren. Embryonen sollten jedoch am gleichen Tag sortiert werden. Längere Lagerung auf Eis oder im Kühlschrank führt zu veränderten Embryo Morphologie. (3) Embryo sortieren Hinweis: Sortierung kann auf Fluoreszenz Stereomikroskop ausgestattet mit einem GLP-Filter bei 60 – 80 X Vergrößerung erfolgen. Mit einer 1.000 µL Pipette, übertragen Sie einen Stapel von etwa 100 Embryonen zu, um ein kleines Glasgefäß geeignet für Sortierung, vorzugsweise von dunkler Farbe, und legen Sie ihn auf Eis. Art-Embryonen durch Dichte und Zellzyklus Status als Atommacht (Abbildung 1) drücken Sie wünschenswert Embryonen in einem separaten Stapel mit einer Nadel oder Spritze Spitze. Entfernen Sie alle Embryonen mit verstreuten, nichtnukleare Verteilung von eGFP-PCNA (Abbildung 1E). Embryonen, die teilweise eine nichtnukleare GFP Signal zeigen sollte auch entfernt werden. Um die Sortierung zu erleichtern, montieren Sie eine Line-up von Referenz-Embryonen bei nuklearen Zyklus 12, 13 und 14 in jeder Charge mit den Bildern in Abbildung 1 als Leitfaden. Verwenden Sie diese Besetzung, um Embryonen von einem unbekannten Stadium mit einem Referenz-Embryonen anzupassen, um ihre Bühne zu bestimmen. Überprüfen Sie das Entwicklungsstadium für Referenz-Embryonen, Messen Sie die atomare Dichte imaging des Embryos und zählen die Anzahl der Nukleonen an der Oberfläche des Embryos auf einer Fläche von 2.500 µm2 mit imaging-Software, die Entfernungsinformationen bereitstellt.Hinweis: Die erwartete Anzahl der Kerne für eine Fläche von 2.500 µm2 ist 12 bis 16 Kerne bei nuklearen Zyklus 12 und 20 bis 30 Kernen bei nuklearen Zyklus 1313. Sobald alle Embryonen in der entsprechenden Phase getrennt sind, fotografieren Sie die Embryonen für die Dokumentation und Qualitätskontrolle. Wenn das Stereo-Mikroskop nicht selbst mit einem Kameramodul ausgestattet ist, kann jedes Epifluoreszenz-Mikroskop mit GFP Filter verwendet werden. Pipette auf die gewünschte Embryonen mit einer 1.000 µL Pipette, Übertragung auf ein frisches Tubus und Platz auf dem Eis. Fortgesetzt, bis genügend Embryonen für das geplante Experiment sortiert werden. Für ältere Embryonen reichen als Stufe 9, in der Regel 20 Embryonen für eine in Situ Hi-C-Experiment. Bei nuklearen Zyklus 12 sind 80 Embryonen ein guter Ausgangspunkt. In früheren Zyklen sollte die Anzahl der Embryonen für jeden Zyklus etwa verdoppelt werden. Pool und geteilten Embryonen in 1,5 mL Röhrchen in einer Weise, dass eine Röhre genügend Embryonen für ein einzelnes in Situ Hi-C enthält experimentieren. Es ist ratsam, Rohre mit geringen DNA-Bindungseigenschaften zu verwenden, da das gleiche Rohr für das gesamte Protokoll verwendet werden wird und Adsorption von DNA kann zu erheblichen Verlusten bei niedrigen DNA-Konzentrationen führen. Röhren kurz bei 100 X g bei Raumtemperatur zu spinnen und überstand zu entfernen. Die Embryonen sollte so trocken wie möglich zum Einfrieren. Flash Einfrieren Embryonen durch Eintauchen der Rohre in flüssigem Stickstoff und Shop bei-80 ° C. 4. in Situ Hallo-C Lyse Legen Sie Rohre mit eingefrorenen Embryonen auf Eis. Aufschwemmen Sie Embryonen in 500 µL eiskalte Lyse-Puffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0, 10 mM NaCl, 0,2 % IGEPAL CA-630, Protease-Inhibitoren, aufgelöst in Wasser). Dann warten Sie 1 min Embryonen auf der Unterseite des Rohres zu begleichen zu lassen. Grind Embryonen mit einem Metall Mikro Stößel, vorgekühlt auf Eis, soll das fest einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch passen. Um zu vermeiden, die Embryonen zu agitieren, setzen Sie den Stößel langsam, bis es den Boden des Rohres berührt, nach unten drücken und dann Schleifen durch die Stößel zweimal in beide Richtungen drehen. Der Stößel sehr leicht anheben, wieder auf den Boden des Rohres schieben und Schleifen zu wiederholen. 4.1.3.2 10 Mal wiederholen, oder bis die Embryonen komplett lysiert werden. Die Lösung sollte homogen sein und keine große Reststücke von Embryonen bleiben sollte. Brüten Sie die homogenisierte Suspension für 15 min. Spin bei 1.000 X g, 4 ° C für 5 min auf Eis und verwerfen Sie überstand. Waschen Sie Pellets von resuspending in 500 µL eiskalte Lyse Puffer, pipettieren rauf und runter. Drehen Sie wieder wie in 4.1.4 und verwerfen Sie überstand. Aufschwemmen Sie gewaschenen Pellet in 100 µL 0,5 % Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS), pipettieren rauf und runter. Permeabilize Kerne durch Inkubation für 10 min bei 65 ° C in einem Heizblock. Stillen Sie SDS durch Zugabe von 50 µL 10 % Triton X-100 und 120 µL Wasser. Durch Streichen der Röhre mischen. Inkubation bei 37 ° C für 15 min. im Heizblock. Beschränkung Enzym Verdauung 25 µL 10-fach Restriktionsenzym Puffer und 20 U 5 U/µL MboI hinzufügen. Durch Streichen der Röhre mischen. Inkubation für 90 min bei 37 ° C im Heizblock unter leichte Erregung (750 u/min), um DNA zu verdauen. Fügen Sie weitere 20 U der MboI und weiter Inkubation für 90 min. Wärme zu inaktivieren MboI durch Inkubation bei 62 ° C für 20 Minuten. Überhang füllenHinweis: Ausfüllen des Überhangs mit biotinylierte dATP erlaubt die Auswahl der spezifischen aufgespaltenen Fragmente. Biotin-dATP an Ligatur Kreuzungen ist aus der Exonuclease Tätigkeit des T4 DNA-Polymerase (Abschnitt 4.6), geschützt, Biotin-dATP an unligated stumpfen enden effizient beseitigt ist. Der Pulldown mit Streptavidin beschichteten Perlen in Abschnitt 4.7 daher speziell bereichert für ligiertes, chimeric DNA-Fragmente. Hinzufügen von 18 µL von 0,4 mM Biotin-14-dATP, 2,25 µL eines unveränderten dCTP, dGTP/dTTP-Mix (3,3 mM) und 8 µL 5 U/µL DNA-Polymerase I Klenow Fragment. Durch Streichen der Röhre mischen und Inkubation bei 37 ° C für 90 min im Heizblock. Ligatur Fügen Sie 657 µL Wasser, 120 µL 10 x T4 DNA Ligase Puffer, 100 µL 10 % Triton x-100, 6 µL 20 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und Mix von flicking die Röhre. Schließlich fügen Sie 5 µL 5 U/µL T4 DNA-Ligase und Mischung von flicking die Röhre. Drehen Sie Rohr sanft (20 u/min) bei Raumtemperatur für 2 h. Fügen Sie eine zweite Tranche von 5 µL 5 U/µL T4 DNA-Ligase und drehen für 2 weitere h weiter. Spin-down Kerne bei 2.500 X g für 5 min und überstand verwerfen. DNA-Extraktion Aufschwemmen Sie Pellet in 500 µL Extraktionspuffer (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), 1 % SDS, aufgelöst in Wasser) und fügen Sie 20 µL 20 mg/mL Proteinase K. Mix durch Streichen der Röhre. Inkubation bei 55 ° C für 30 min, bei 1.000 u/min schütteln, um Protein zu verdauen. De-Crosslink 130 µL 5 M NaCl hinzugeben und über Nacht bei 68 ° C, schütteln bei 1.000 u/min inkubieren. Pipette Probe in eine neue 2 mL-Tube, bevorzugt mit niedrigen DNA-Bindungseigenschaften. Fügen Sie 0,1 X Mengen (63 µL) von 3 M Natrium Acetat pH 5,2 und 2 µL von 15 mg/mL GlycoBlue. Mischen Sie gut durch invertieren. Fügen Sie 1,6 X Mengen (1.008 µL) des reinen absoluten Ethanol und Mischung durch invertieren. Bei-80 ° C für 15 min. Zentrifugieren bei 20.000 X g bei 4 ° C für mindestens 30 min inkubieren. Das DNA-Pellet ist oft sehr klein, fast unsichtbar und kann nur durch die blaue Farbe des GlycoBlue beobachtet werden. Entfernen Sie überstand sehr vorsichtig ziehen die PIPETTENSPITZE in das Rohr entlang der gegenüberliegenden Wand wo das DNA-Pellet gelegen. Kleine verbleibende Tropfen sind oft leicht während dieser Schritt und die folgenden Waschungen entfernt, indem man sie aus den Rohren mit einer P10-Spitze statt pipettieren sie heraus. Waschen Sie Pellet durch Zugabe von 800 µL 70 % Ethanol. Mischen Sie durch invertieren und Zentrifugieren bei 20.000 X g bei Raumtemperatur für 5 min. dieses waschen mindestens einmal wiederholen. Entfernen Sie alle Spuren von Ethanol und lassen Sie das Rohr stehen bei geöffnetem Deckel für bis zu 5 min an der Luft trocknen. Sobald keine Flüssigkeit übrig ist, fügen Sie 50 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0. Immer wieder pipette die Lösung über die Fläche an der Wand des Rohres, wo das Pellet befand, um die DNA zu solubilisieren. Fügen Sie 1 µL von 20 mg/mL RNase A, Mix von flicking die Röhre und Inkubation bei 37 ° C für 15 min zu verdauen RNA. Die Probe kann nun über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt oder auf unbestimmte Zeit bei-20 ° C eingefroren. Die Konzentration von DNA mit einem Fluoreszenzfarbstoff basierte Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers zu überprüfen. Der Gesamtbetrag der DNA in der Probe soll mindestens 10 ng, sonst gibt es zu wenig Material für Verstärkung und Bibliothek Komplexität werden wahrscheinlich gering. In diesem Fall die Menge des Ausgangsmaterials war wahrscheinlich nicht ausreichend, oder Material war auf dem Weg vielleicht während Lyse und Niederschlag verloren. Biotin-Entfernung und DNA-Scheren Addieren Sie 12 µL 10 X T4-DNA-Polymerase-Puffer, 3 µL 1 mM dATP, 3 µL 1 mM dGTP und 46 µL Wasser. Durch Streichen der Röhre mischen. 5 µL 3 U/mL-T4-DNA-Polymerase, Mischen von flicking die Röhre und bei 20 ° C für 30 min inkubieren. Fügen Sie 3 µL 0,5 M EDTA, die Reaktion zu stoppen, und verwenden Sie Wasser ein Volumen von etwa 120 µL der Probe zu. Die DNA zu einer Größe von 200 – 400 bp mit einem Ultraschall-Gerät entsprechend den Anweisungen des Herstellers zu scheren. Mit den sonikator erwähnt in der Tabelle der Materialien, das folgende Programm ist angebracht: 2 Zyklen jeder der 50 s, 10 % Zoll, Stärke 5, 200 Zyklen/platzen. Biotin-pulldown Pipette 30 µL 10 mg/mL Streptavidin beschichteten magnetische Beads in einen neuen Schlauch, trennen Sie diese auf einem Magnetstativ und überstand verwerfen. Perlen in 1 x B & W Puffer (5 mM Tris-Cl pH 7.4, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, aufgelöst in Wasser) + 0,1 % Triton x-100 und Mischung von Vortexen aufzuwirbeln. Ein Magnetstativ setzen Sie Rohr auf und 1 – 5 min. warten Sie, bis die Perlen, je nach Fabrikat und Modell getrennt sind. Aspirieren und überstand beim Schieben der Pipettenspitze an der Wand gegenüber befinden sich die Perlen zu verwerfen. Aufschwemmen Sie Perlen in 120 µL 2 x B & W-Puffer (10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA und 2 M NaCl). Durch Vortexen mischen. Sheared DNA zu einem neuen niedrigen DNA-Bindung Schlauch zu übertragen, und mischen mit 120 µL der Wulst Suspension in 2 X B & W Puffer durch aufschütteln. Drehen Sie Perlen mit der DNA-Probe bei 20 u/min für 15 min. Trennen Sie Perlen auf einem Magnetstativ zu und entsorgen Sie überstand. Aufschwemmen Perlen in 600 µL 1 x B & W + 0,1 % Triton x-100, und bei 55 ° C für 2 min schütteln bei 1.000 u/min inkubieren. Verwerfen Sie nach der Trennung überstand. Wiederholen Sie diese Wäsche einmal. Waschen Sie Perlen einmal mit 600 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0 und verwerfen Sie überstand nach Trennung zu. Perlen in 50 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0 aufzuwirbeln. 5. Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung Hinweis: Alle Bibliothek Schritte erfolgen mit Komponenten aus einer kommerziellen DNA-Bibliothek Vorbereitung kit (siehe Tabelle der Materialien). Jedoch können alternative Kits oder andere Reagenzien ersetzt werden. Niederschlag neigt, Formular in der Bibliothek-Vorbereitung-Agenten im Tiefkühllager. Es ist daher wichtig, um sicherzustellen, dass alle Niederschläge aufgelöst wird, vor der Verwendung der Reagenzien. Ende Reparatur Übertragen Sie die Perle-Suspension in 50 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0 in eine neue PCR-Röhrchen. Fügen Sie 3 µL Ende Prep Enzym-Mix und 7 µL Ende Prep Reaktion Puffer. Mischen von pipettieren rauf und runter. Rohr auf einem Thermocycler übertragen und führen Sie das folgende Programm: 20 ° C für 30 min, 65 ° C für 30 min und Halt bei 4 ° C. Adapter-Ligatur Fügen Sie 30 µL Ligation Master Mix, 2,5 µL 1,5 µM Sequenzierung Adapter (verdünnte bis 1,5 µM ab Lager lieferbar) und 1 µL Ligation Enhancer an der Wulst-Aufhängung. Mischen von pipettieren rauf und runter. Inkubation bei 20 ° C für 15 min in einem Thermocycler. 3 µL Enzym Benutzer hinzufügen. Mischen von pipettieren rauf und runter. Inkubation bei 37 ° C für 15 min in einem Thermocycler. Trennen Sie Perlen auf einem Magnetstativ zu und entfernen Sie überstand. Zum Waschen der Perlen, Aufschwemmen Perlen in 100 µL 1 x B & W Puffer + 0,1 % Triton x-100. Mix von aufschütteln und Übertragung auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch. Trennen Sie Perlen auf einem Magnetstativ zu und entfernen Sie überstand. Wiederholen Sie dieses einmal mit 600 µL des gleichen Puffers waschen. Perlen in 600 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0, Mix von Vortexen, aufschwemmen und Perlen auf einen neuen Schlauch übertragen. Perlen auf einem Magnetstativ zu trennen, überstand verwerfen und Perlen in 50 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0 aufzuwirbeln. PCR-Amplifikation Bereiten Sie zwei PCR-Röhrchen und in jedem, mischen Sie 25 µL der Polymerase Master Mix, 1,5 µL 10 µM nach vorne (nichtindizierte) PCR Primer und 1,5 µL 10 µM rückwärts (indizierte) PCR-Primer.Hinweis: Nach vorne (nichtindizierte) PCR-Primer:5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T-3´.Rückwärts (indizierte) PCR-Primer:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T-3´. * zeigt Phosphorothioat Anleihen und Ns in den indizierten PCR-Primer. Fügen Sie in jedem Röhrchen 22 µL Wulst Hemmung und Mischung hinzu, indem pipettieren rauf und runter. PCR mit dem folgenden Programm ausführen: 98 ° C für 1 min (98 ° C für 15 s, 65 ° C für 75 s, Rampen 1,5 ° C/s) 9 – 12 Mal wiederholt, 65 ° C für 5 min und Halt bei 4 ° cHinweis: Die Anzahl der Verstärkung Zyklen muss empirisch ermittelt werden. Allerdings haben wir festgestellt, dass Bibliotheken, die mehr als 12 Zyklen erforderlich im Allgemeinen von geringer Komplexität waren und nicht in qualitativ hochwertige Hi-C-Karten führen. Auf der anderen Seite wurden Bibliotheken, die weniger als 12 Zyklen erforderlich nicht negativ beeinflusst, durch die Verstärkung für eine volle 12 Zyklen. Daher ist es möglich, standardmäßig auf 12 Zyklen der Verstärkung. Bündeln Sie die beiden PCR-Reaktionen in einem einzigen Microcentrifuge Schlauch, trennen Sie Perlen auf einem Magnetstativ zu und übertragen Sie den Überstand mit der Bibliothek zu einem neuen Schlauch. Größenauswahl Bringen Sie Ampure XP Wulst Aussetzung auf Raumtemperatur und Mischung gut durch Schütteln. Volumen der gepoolten PCR-Reaktion auf genau 200 µL mit Wasser zu bringen. Während der PCR und die magnetische Trennung einige des ursprünglichen Volumens ist in der Regel verloren. Überprüfen Sie Volume zu, indem Sie die Pipette auf 200 µL und Aspirieren Sie das gesamte Volumen der Reaktion. Wenn Luft abgesaugt ist, Wasser mehr muss hinzugefügt werden. Übersteigt das Volumen 200 µL, die Lautstärke von Perlen in den Schritten 5.4.3 und 5.4.6 proportional hinzugefügt.Hinweis: Die Bände in Klammern sind gültig, wenn das Gesamtvolumen der gepoolten PCR Reaktionen genau 200 µL ist. 0,55 X Volumen (110 µL) Ampure XP Wulst Suspension und Mischen von pipettieren oben und unten mindestens 10 mal. In 5 min, separate Perlen auf einem Magnetstativ für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Wechseln Sie überstand an einen neuen Schlauch Entsorgen Sie die Röhrchen mit den Perlen. Die Perlen haben DNA gebunden > 700 bp, die sequenziert werden zu groß ist. Hinzufügen des Überstands 0,2 X Volumen (40 µL, wodurch insgesamt 0,75 X Ampure Puffer in der Probe) Ampure XP Wulst Hemmung und Mix von oben und unten 10 mal pipettieren. In 5 min, separate Perlen auf einem Magnetstativ für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Entsorgen Sie überstand die DNA enthält < 200 bp, inklusive kostenlose Primer, Grundierung Dimere und Fragmente zu klein sequenziert werden. Lassen Sie das Rohr auf die Magnetstativ. Waschen Sie Perlen, 700 µL Ethanol 80 % hinzufügen, kümmert sich um nicht zu stören das Wulst Pellet und inkubieren Sie für 30 s. Überstand verwerfen, dann nehmen Sie die u-Bahn aus der Magnetstativ und Perlen in 100 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0 Aufschwemmen. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 10 mal pipettieren und bei Raumtemperatur für 1 min inkubieren. Fügen Sie 0,8 X Mengen (80 µL) Ampure XP Wulst Suspension. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 10 mal pipettieren und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Diese zweite Runde der Untergrenze Größenauswahl sorgt dafür, dass die endgültige Bibliothek völlig frei von Primer und Grundierung Dimere ist. Trennen Sie Perlen auf einem Magnetstativ für 5 min zu und entsorgen Sie überstand. Waschen Sie die Wulst Pellet zweimal mit 700 µL Ethanol 80 % für 30 s jede, wobei das Rohr auf dem magnetischen Stand, wie oben beschrieben. Entfernen Sie mit dem Rohr noch auf die Magnetstativ alle Spuren von Ethanol. Es hilft, Tröpfchen von Ethanol aus dem Rohr mit einer Pipette P10 schieben. Verbleibende Ethanol für maximal 5 Minuten verdunsten zu lassen. Rohr aus der Magnetstativ und Perlen in 50 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0 aufzuwirbeln. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 10 mal pipettieren. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min, dann separate Perlen auf einem Magnetstativ. Übertragen Sie überstand auf eine frische Rohr. Dies ist die letzte Hi-C-Bibliothek, bereit zu quantifizieren und sequenziert auf Maschinen der nächsten Generation Sequenzierung, gemäß den Anweisungen des Herstellers.