Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

1. drosophila embriyo koleksiyonu Not: Bir önceki yayın15′ te gösterildiği gibi bir eşdeğer embriyo koleksiyon gerçekleştirilebilir. Genç eGFP-PCNA sinekler transfer (< 1 haftalık)16 (% 1 etanol, % 1 asetik asit ve % 4 agar) içine yumurta toplama kafesleri mayalanarak koleksiyonu ile tabaklar. 25 ° C’de ayarla bir kuluçka koleksiyonu kafesleri taşımak 1-2 gün önce yumurta toplama için kuluçka yumurta verimi önemli ölçüde artırır. Koleksiyon tabakları günde iki kez değiştirin. Embriyo toplama odası 30-60 dk aralıklarla gelen içeren plakaları kaldırın. Ama gelişim aşamalarında daha sıkı dağıtım daha az embriyolar daha küçük aralıklar neden. Paralel olarak birden fazla kafes kadar bu ideal toplamak > 200 yumurta her 30-60 dk koyulur. Embriyoların istenen yaşına kadar tabak 25 ° C’de depolayın. Blastoderm aşaması için embriyo (nükleer döngüsü 14), kuluçkaya yaklaşık 2 h için. Tüm yüzeyi su ile kaplıdır, kuluçka 2 h sonra musluk suyu bir fışkırmak şişe toplama plaka ekleyin. Embriyo askıya alma ve yumuşak bir fırça kullanarak Maya. Koleksiyon plaka resuspended embriyo bir embriyo toplama sepeti (ticari hücre süzgeçler) 100 µm gözenek boyutu veya ev yapımı sepet17 iş iyi fışkırmak şişe ek musluk suyu ekleyerek gerekirse dökün. Bu aşamada, embriyo paralel olarak toplanan tüm plakaları dan birleştirin. Havuza alınan örnek tek bir toplu iş temsil eder. Embriyo de musluk suyu sepetle fışkırmak şişe 30 dan durulama tarafından yıkayın kadar tüm Maya kalıntı akıp s. Dechorionate embriyo içine su % 2.5 sodyum hipoklorit çözeltilerine toplama sepeti yerleştirerek. Dönen tarafından ışık ajitasyon koryon kaldırılmasını kolaylaştırır. Böylece ne zaman sepet dışarı kaldırdı ve tekrar, sular altında onlar çözüm yüzeyde float embriyo yeterince hidrofobik kadar devam ~1.75–2 min almalı.Dikkat: Sodyum hipoklorit aşındırıcı. Uygun kişisel koruyucu ekipman giymek. Çözümler içeren < % 10 sodyum hipoklorit genelde lavaboda tasfiye edilmesi, ana bilgisayar Enstitüsü yönetmeliklerine kontrol etmek emin olun. Sepet çözümden kaldırmak ve çamaşır suyu kokusu artık fark edilir kadar fışkırmak şişe dokunun su ile iyice durulayın. 2. embriyo fiksasyon Not: Optimum fiksaj koşulları, deterjan, formaldehit ve fiksasyon, süresi öncelikle konsantrasyon embriyo aşamasında uygun ampirik olarak belirlenmiş olması gerekir. Sinsisyal blastoderm çevresinde aşamaları için % 0,5 Triton X-100 ve % 1,8 formaldehit son bir konsantrasyon sulu faz iş de. Embriyo sahne 9 ötesinde daha sonraki aşamaları için daha fazla en iyi duruma getirme bu parametreler gerekli olabilir. Tüm çözümler fiksasyon ve sıralama sırasında kullanılan proteaz inhibitörleri içermelidir. Toplama sepeti ters çevir ve 15 mL konik Santrifüjü tüp yerleştirin. Embriyo sepeti üzerinden bir Pasteur pipet PBS-T dağıtımı kullanarak tüpüne sifonu (PBS, % 0.5 Triton X-100). Alt kısmında yerleşmek ve PBS-T. ile 2 ml toplam ses seviyesini embriyo izin Heptane 6 mL ve 100 µL % 37 formaldehit suya ekleyin.Dikkat: Heptane ve formaldehit teneffüs ne zaman zehirli veya cilt sonra başvurun. Uygun kişisel koruyucu donanımları ve duman mahallede çalışma. Heptane veya formaldehit içeren atık ayrı ayrı ana bilgisayar Enstitü nün düzenlemelere göre tasfiye edilmesi gerekiyor. Formaldehit eklenmesi sonra 15 dk sayacýný baþlatmak ve şiddetle tüp yukarı ve aşağı 1 dk. için el ile çalkalanır. Sulu ve Organik faz formu bir şampuan gibi tutarlılık için birleştirir. Bir çevirme karıştırıcı formaldehit eklenmesinden sonra 10 dk kadar tahrik. Vasıl 500 x g embriyo tüp alt toplamak için oda sıcaklığında 1 dk santrifüj kapasitesi. Tüm şampuan gibi sıvı Aspire edin ve, herhangi bir embriyo Aspire edin değil için dikkat çekici atın. Şampuan gibi süpernatant az kalan miktarda sorunları neden olmaz. 15 dakika sonra formaldehit, ek PBS-T 5 ml formaldehit gidermek için 125 mM glisin ile embriyo resuspend. 1 dk. için yukarı ve aşağı sallayarak kuvvetle karıştırın. 500 x g 1 dk. için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Embriyo 5 mL buz gibi PBS-T. resuspending tarafından yıkama Embriyo yerleşmeye ve Aspire edin tüm süpernatant izin. Adım 2.10 makinaya iki kez daha tekrarlayın. Embriyo buz üzerinde sıralama kadar tutun. Genellikle, sıralama için 3-4 toplu işlemleri devam etmeden önce sinek embriyo toplamak için iyi bir fikirdir. Ancak, embriyo aynı gün sıralanması. Genişletilmiş depolama buz üzerinde veya buzdolabında değişmiş embriyo morfoloji için yol açar. 3. embriyo sıralama Not: Sıralama 60-80 X büyütme, GFP filtre ile donatılmış flüoresan herhangi bir stereo mikroskop üzerinde yapılabilir. 1000 µL pipet kullanarak, küçük cam kap, tercihen bir koyu renk, sıralamak için uygun bir toplu iş yaklaşık 100 embriyo transfer ve buz üzerinde yerleştirin. Sıralama embriyo tarafından arzu edilen embriyo bir iğne veya şırınga ucu kullanarak ayrı bir yığın iterek nükleer yoğunluğu ve hücre döngüsü duruma göre (Şekil 1). EGFP-PCNA (Şekil 1E) dağınık, nükleer olmayan dağılımı ile tüm embriyoların kaldırın. Ayrıca, nükleer olmayan GFP sinyal kısmen gösteren embriyolar kaldırılması gerekir. Sıralama yardım resimleri resim 1 ‘ de bir kılavuz olarak kullanarak her yığında nükleer döngüsü 12, 13 ve 14 başvuru embriyo bir line-up araya. Bu line-up onların sahne belirlemek için bilinmeyen bir sahne embriyo bir başvuru embriyoların ile eşleştirmek için kullanın. Gelişim aşaması için başvuru embriyo doğrulamak için embriyo görüntüleme ve çekirdekleri bir alanda mesafe bilgi sağlar görüntüleme yazılımı kullanarak 2500 µm2 embriyo yüzeyde sayılması nükleer yoğunluğu ölçmek.Not: Beklenen çekirdek için 2.500 µm2 yüzölçümü 12-16 çekirdek nükleer döngüsü 12 ve 20-30 çekirdekleri nükleer döngüsü 1313sayısıdır. Bir kez tüm embriyoların uygun aşamada ayrılır, belgelendirme ve kalite kontrol için embriyo fotoğraf çekmek. Stereo mikroskop kendisi donatmak ile bir fotoğraf makinesi ölçü birimi değilse, herhangi bir epifluorescence mikroskop GFP filtreleri ile kullanılabilir. Pipet 1000 µL pipet, taze tüp ve yer buz üzerinde kullanarak istenen embriyolar kadar. Yeterli embriyo için planlanan deney sıralanır kadar devam edin. İçin embriyo büyük 9, sahne daha genellikle 20 embriyo bir in situ Hi-C deney için yeterlidir. 12 nükleer döngüsü 80 embriyo iyi bir başlangıç noktası vardır. Önceki döngüleri, embriyo sayısı yaklaşık her döngüsü için iki katına. Havuzu ve split embriyo bir tüp bir tek in situ Hi-C için yeterli embriyo içerir şekilde 1,5 mL tüpler içine deneyin. Bu tüpler düşük DNA bağlama özellikleri ile aynı tüp için tüm iletişim kuralının kullanılacağını ve DNA adsorpsiyon düşük DNA konsantrasyonlarda önemli zararlar açabilir kullanmadan önce tavsiye edilir. Kısaca, 100 x g oda sıcaklığında tüpler spin ve süpernatant kaldırın. Embriyo gibi kuru olmalıdır dondurma için mümkün olduğunca. Flaş dondurma embriyo sıvı azot ve mağaza-80 ° C’de tüplerde batış tarafından 4. in Situ Hi-C Lizis Dondurulmuş embriyo ile tüplerin buza koyun. Embriyo buz gibi lizis arabellek (10 mM Tris-Cl pH 8.0, 10 mM NaCl, %0.2 IGEPAL CA-630, proteaz inhibitörleri; içinde çözünmüş su) 500 µL içinde resuspend. Daha sonra embriyo tüp alt kısmında yerleşmek izin için 1 dakika bekleyin. 1.5 mL microcentrifuge tüp sıkıca uyacak şekilde tasarlanmıştır buz üzerinde önceden soğutmalı metal bir mikro havaneli kullanarak embriyo eziyet. Embriyo Tantanacı önlemek için tüp alt dokunana kadar havaneli yavaş yavaş Ekle, aşağı doğru itin ve havaneli ile iki kez her iki yönde döndürerek eziyet. Havaneli ile çok hafif kaldırın, tekrar tüp altına itmek ve taşlama tekrarlayın. 4.1.3.2 10 kez yineleyin veya embriyo tamamen lysed kadar. Çözüm homojen olmalıdır ve embriyo hiçbir kalıntı büyük parçaları kalmalıdır. 15 dk. Spin 1000 x g, 5 min için 4 ° C de buzda homojenize süspansiyon kuluçkaya ve süpernatant atın. Pelet yukarı ve aşağı pipetting 500 µL buz gibi lizis arabellekte resuspending tarafından yıkayın. 4.1.4 olduğu gibi yine spin ve süpernatant atın. Yukarı ve aşağı pipetting yıkanmış Pelet 100 µL % 0.5 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), içinde resuspend. Çekirdeği bir Isıtma blok içinde 65 ° C’de 10 dakika için kuluçka tarafından permeabilize. SDS 50 µL % 10 Triton X-100 ve 120 µL su ekleyerek gidermek. Tüp flicking tarafından karıştırın. Isı blok 15 dakika 37 ° C’de kuluçkaya. Restriksiyon enzimi sindirim Restriksiyon enzimi arabellek x 10 ve 20 5 U/µL MboI U 25 µL ekleyin. Tüp flicking tarafından karıştırın. DNA 37 ° c ısı blok hafif ajitasyon (750 devir/dakika) altında 90 dk için kuluçka sindirmek. Başka bir 20 U MboI ekleyin ve kuluçka 90 dk için devam edin. Isı-MboI 20 dk 62 ° C’de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz. Çıkıntı doldurmaNot: biotinylated dATP ile çıkıntı doldurma belirli ve birleştirilmiş parçaları seçim sağlar. Biotin-dATP unligated künt ucunda verimli bir şekilde kaldırılır, ancak biotin-dATP tüp ligasyonu kavşaklar, eksonükleaz aktivitesi T4 DNA polimeraz (Bölüm 4.6), koruma altındadır. Streptavidin kaplı boncuk 4.7 bölümünde bu nedenle özellikle kullanarak açılan ve birleştirilmiş, chimeric DNA parçaları için zenginleştirir. 18 µL 0.4 mM biotin-14-dATP, 2.25 µL değiştirilmemiş bir dCTP/dGTP/dTTP karışımı (3,3 mM her) ve 8 µL parçasının 5 U/µL DNA polimeraz ı Klenow ekleyin. Tüp flicking tarafından mix ve 37 ° c ısı blok içinde 90 dk için kuluçkaya. Tüp ligasyonu 657 µL su, 10 x T4 DNA ligaz arabelleği, 100 µL 120 µL ekleyin Triton X-100, 20 mg/mL Sığır serum albumin (BSA) ve karışımı tüp flicking tarafından 6 µL. Son olarak tüp flicking tarafından 5 µL 5 U/µL T4 DNA ligaz ve karışımı ekleyin. Tüpü yavaşça 2s için oda sıcaklığında (20 devir/dakika) döndürün. 5 U/µL T4 DNA ligaz 5 µL ikinci taksit ekleyin ve 2 için daha fazla h dönen devam edin. Çekirdeklerin 2500 x g 5 min için de aşağı spin ve süpernatant atın. DNA ekstraksiyon Pelet ayıklama arabellek (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), % 1 SDS; içinde çözünmüş su) 500 µL içinde resuspend ve tüp flicking tarafından 20 mg/mL İndinavir K. Mix 20 µL ekleyin. Protein 55 ° c 30 dk 1000 devir / dakikada sallayarak için kuluçka sindirmek. İçin de-crosslink, 5 M NaCl 130 µL ekleyin ve bir gecede 1000 devir / dakikada sallayarak 68 ° C’de kuluçkaya. Pipet örnek tercihen düşük DNA bağlama özelliklere sahip yeni bir 2 mL tüp içine. 0.1 x birimleri (63 µL) 3 M sodyum asetat pH 5.2 ve 2 µL 15 mg/ml GlycoBlue ekleyin. Mix de ters çevirme. Ters çevirme tarafından 1.6 x birimleri (1,008 µL) saf mutlak etanol ve karışımı ekleyin. 20.000 x g için en az 30 dk 4 ° c de 15 dakika santrifüj süreyle-80 ° C’de kuluçkaya. DNA Pelet genelde çok küçük, neredeyse görünmez ve yalnızca GlycoBlue mavi renk nedeniyle lekeli olabilir. Süpernatant pipet ucu ters duvar boyunca tüp içine DNA Pelet olduğu üzerinden hareket kaldırmak çok dikkatli. Küçük kalan damlacıkları genellikle kolayca kaldırılır Bu adım ve aşağıdaki yıkama sırasında P10 ucu kullanarak tüpler dışına iterek yerine onları pipetting. Pelet 800 µL % 70 etanol ekleyerek yıkayın. Mix ters çevirme tarafından ve santrifüj kapasitesi 20.000 x g , oda sıcaklığında 5 dakika süreyle, bu yıkama en az bir kez yinelenir. Etanol bütün izlerini kaldırmak ve tüp ayakta kurumasını 5 min için kapağı açık bırakın. Hiçbir sıvı kalan kez, 10 mM Tris-Cl pH 8.0 50 µL ekleyin. Art arda çözüm tüp duvarına nerede Pelet DNA solubilize için yer oldu alana pipette. 20 mg/ml RNase A, Tüp, flicking tarafından mix 1 µL ekleyin ve 15 dakika sindirimi RNA 37 ° C’de kuluçkaya. Örnek şimdi gece buzdolabında saklanan ya da süresiz olarak-20 ° C’de donmuş. Onay floresan bir boya kullanarak DNA konsantrasyonu tahlil üretici yönergelerine göre temel. DNA’ın toplam tutarı örnek en az 10 olmalıdır ng, aksi halde çok az malzeme amplifikasyon için mevcuttur ve Kütüphane karmaşıklığı büyük olasılıkla düşük. Bu durumda, malzeme başlangıç miktarını muhtemelen yeterli değildi veya malzeme yol boyunca, belki de lizis ve yağış sırasında kayboldu. Biotin kaldırma ve DNA kesme Birlikte 10 x T4 DNA polimeraz arabelleği 12 µL, 1 mM dATP, 3 µL, 1 mM dGTP, 3 µL ve 46 µL su ekleyin. Tüp flicking tarafından karıştırın. 3 U/mL T4 DNA polimeraz 5 µL eklemek, tüp flicking tarafından mix ve 30 dakika için 20 ° C’de kuluçkaya. Reaksiyon durdurmak için 0, 5 M EDTA 3 µL ekleyip su yaklaşık 120 µL bir birim için örnek getirmek için kullanabilirsiniz. DNA sonication aygıtıyla üreticinin talimatlarına göre 200-400 bp boyutuna kesme. Malzemeler tablobelirtilen sonicator kullanarak, aşağıdaki programı uygundur: 2 döngüleri her 50 s, % 10 görev, yoğunluğu 5, 200 devir/seri çekim. Biotin açılan 10 mg/mL streptavidin kaplı manyetik boncuklar 30 µL yeni bir tüp pipet, bunları manyetik bir stand üzerine ayırın ve süpernatant atın. Boncuk 1 x B & W arabellek (5 mM Tris-Cl pH 7.4, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl; içinde çözünmüş su) + %0.1 Triton X-100 ve mix vortexing tarafından resuspend. Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve boncuklar, marka ve model bağlı olarak ayrılır 1 – 5 min için bekleyin. Aspire edin ve süpernatant pipet ucu boncuk konumlandırıldığı duvar boyunca kayma sırasında atın. Boncuk 2 B & W arabellek (10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA ve 2 M NaCl) x 120 µL resuspend. Vortexing tarafından mix. Yamultulmuş DNA bir yeni düşük DNA bağlama tüp için transfer ve vortexing tarafından 120 µL boncuk süspansiyon içinde 2 X B & W tampon ile karıştırın. Boncuk DNA örneği 20 devirde 15 dakika ile döndürün. Boncuk manyetik bir stand ayırmak ve süpernatant atın. Resuspend 1 x B & W + %0,1 600 µL Triton X-100 boncuk ve 55 ° c için 2 dk 1000 devir / dakikada sallayarak, kuluçkaya. Ayrılıktan sonra süpernatant atmak. Bu yıkama bir kez yinelenir. Boncuk 10 mM Tris-Cl pH 8.0 600 µL hemen ile yıkayın ve süpernatant ayrılıktan sonra atın. Boncuk 10 mM Tris-Cl pH 8.0 50 µL içinde resuspend. 5. sıralama kitaplığı hazırlık Not: Tüm kütüphane adımları yapılır bir ticari DNA Kütüphane hazırlık bileşenleri kullanarak ( Tablo malzemelerigörmek) kit. Ancak, alternatif kitleri veya diğer kimyasalları yerine olabilir. Yağış dondurucu depolama sırasında form kitaplığı hazırlık aracıları eğilimindedir. Bu nedenle tüm yağış reaktifleri kullanmadan önce tasfiye edilir emin olmak önemlidir. Son onarım 10 mM Tris-Cl pH 8.0 50 µL boncuk süspansiyon yeni bir PCR tüp içine aktarın. 3 µL son hazırlık enzim karışımı ve son hazırlık tepki arabelleği 7 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Tüp bir termal cycler aktarmak ve aşağıdaki programı çalıştır: 20 ° C 30 dk, 30 dk ve 4 ° C’de tutmak için 65 ° C Bağdaştırıcı ligasyonu Tüp ligasyonu Master Mix, 1,5 µM 2.5 µL 30 µL eklemek adaptör (stoktan için 1,5 µM seyreltik) sıralama ve ligasyonu artırıcı 1 µL boncuk süspansiyon için. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. 20 ° c termal cycler 15dk için kuluçkaya. Kullanıcı enzim 3 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. 15 dakika içinde bir termal cycler 37 ° C’de kuluçkaya. Boncuk manyetik bir stand ayırmak ve süpernatant kaldırın. Boncuk yıkamak, resuspend için Triton X-100 1 x B & W arabellek + %0,1 100 µL içinde boncuk. Karıştırmak yanında vortexing ve yeni microcentrifuge tüp transferi. Boncuk manyetik bir stand ayırmak ve süpernatant kaldırın. Bu yıkama bir kez aynı arabelleği 600 µL kullanarak yineleyin. 10 mM Tris-Cl pH 8.0, karıştırmak vortexing, yanında 600 µL boncuk resuspend ve yeni bir tüp boncuk aktarın. Boncuk manyetik bir stand ayrı süpernatant atmak ve boncuk 10 mM Tris-Cl pH 8.0 50 µL içinde resuspend. PCR güçlendirme İki PCR tüpleri hazırlayın ve her, 25 µL polimeraz Master Mix, 1,5 µL 10 µM ileri (Sıralanmayan) PCR astar ve 10 µM ters (Dizinli) PCR astar 1,5 µL karıştırın.Not: İleri (Sıralanmayan) PCR astar:5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T-3´.Geriye doğru (Dizinli) PCR astar:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T-3´. * dizinli PCR astar phosphorothioate tahvil ve Ns gösterir. Her tüpün içinde yukarı ve aşağı pipetting tarafından 22 µL boncuk süspansiyon ve karışımı ekleyin. Aşağıdaki programı kullanarak PCR çalıştırın: 98 ° C için 1 dakika, (98 ° C 15 s, 75 65 ° C s, 1.5 ramping ° C/s) 65 ° C 5 min ve 4 ° C’de tutmak için 9 – 12 kez, tekrarlananNot: Ampirik olarak belirlenmesini amplifikasyon döngü sayısı vardır. Ancak, 12’den fazla döngüleri gerekli kütüphaneleri genellikle düşük karmaşıklığı vardı ve yüksek kalitede Hi-C haritalar sonuçlanmamıştır bulduk. Öte yandan, az 12 döngüleri gerekli kütüphaneleri olumsuz için tam 12 döngüleri yükseltecek tarafından etkilenen değil. Bu nedenle, varsayılan amplifikasyon 12 döngüleri için mümkündür. Havuzu iki PCR reaksiyonları bir tek microcentrifuge tüp boncuk manyetik bir stand ayrı ve yeni bir tüp kitaplığına içeren süpernatant aktarın. Boyut seçimi Ampure XP de sallayarak oda sıcaklığında ve mix boncuk süspansiyon getirmek. Havuza alınan su ile tam olarak 200 µL PCR tepki hacmi getir. PCR ve manyetik ayırma sırasında bazı orijinal hacminin genellikle kayıp. Birim için 200 µL pipet ayarlayarak doğrulayın ve birimin tümü reaksiyon Aspire edin. Hava emişli, daha eklenmesi gereken su. Birimin 200 µL aşarsa, adım 5.4.3 ve 5.4.6 orantılı olarak eklenen boncuk seviyesini ayarlamak.Not: güç parantez içinde havuzlu PCR reaksiyonları hacmi tam olarak 200 µL ise geçerlidir. 0.55 x (110 µL) hacimleri Ampure XP boncuk süspansiyon ve yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından karıştırın. 5 dk, 5 dk için manyetik bir stand ayrı boncuk için oda sıcaklığında kuluçkaya. Süpernatant için yeni bir tüp taşıyın. Boncuk içeren tüp atmak. Boncuk DNA bağladıktan > 700 bp, sıralı için çok büyük. Süpernatant için 0.2 x birimleri (40 µL, 0,75 x Ampure arabellek örnekteki toplam sonuçlanan) eklemek Ampure XP boncuk süspansiyon ve aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından mix. 5 dk, 5 dk için manyetik bir stand ayrı boncuk için oda sıcaklığında kuluçkaya. DNA içeren süpernatant atmak < 200 ücretsiz astar, astar dimer ve çok küçük parçaları içeren sıralı için bp,. Tüp manyetik kürsüye bırakın. Boncuk yıkayın, 700 µL % 80 etanol eklemek için dikkat çekici boncuk Pelet rahatsız eder ve 30 için kuluçkaya için s. Süpernatant atmak, sonra tüp manyetik stand off al ve boncuk 10 mM Tris-Cl pH 8.0 100 µL içinde resuspend. Aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından mix ve 1 dk. için oda sıcaklığında kuluçkaya. 0.8 x (80 µL) hacimleri Ampure XP boncuk süspansiyon ekleyin. Aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından mix ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya. Alt sınır boyutu seçimi bu ikinci turunda son Kütüphane astar ve astar dimer tamamen ücretsiz sağlanır. Boncuk 5 min için manyetik bir stand ayırmak ve süpernatant atın. Boncuk Pelet 700 µL % 80 etanol için 30 ile iki kez yıkayın s her yukarıdaki gibi manyetik standında tüp bırakarak. Tüp ile hala manyetik stand, etanol bütün izlerini kaldırmak. Bu damlacıkları etanol P10 pipet kullanarak tüp dışarı itmek için yardımcı olur. Kalan etanol için en fazla 5 dk buharlaşmasına izin. Tüp manyetik stand off al ve boncuk 10 mM Tris-Cl pH 8.0 50 µL içinde resuspend. Aşağı yukarı 10 kez pipetting karıştırın. 5 dk sonra ayrı boncuk manyetik bir stand için oda sıcaklığında kuluçkaya. Transfer süpernatant temiz bir tüp. Bu son Hi-C Kütüphane, sayısal ve sonraki nesil sıralama makinelerde, üreticinin yönergelerine göre sıralı hazır olduğunu.