Поколение генома общесистемной Chromatin конформации захвата библиотек из плотно поставил раннего дрозофилы эмбрионов

1. Коллекция зародыша дрозофилы Примечание: Эквивалент эмбриона коллекции может быть выполнено как показано в предыдущей публикации15. Передавать молодым eGFP-PCNA мух (< 1 неделя старый) в коллекции клетки яйцо с дрожжевого коллекции пластины16 (1% этанола, уксусная кислота 1% и 4% агар). Перемещение коллекции клетки инкубатора в 25 ° C. Инкубации 1 – 2 дней до сбора яиц значительно повышает урожайность яйцо. Изменить коллекцию пластины дважды в день. Снимите крышки, содержащего эмбрионы из коллекции камеры с интервалом 30-60 мин. Меньшие промежутки времени привести к меньшее количество эмбрионов, но крепче распределение стадии развития. Собирать, от нескольких клеток параллельно так идеально и что > 200 яйца откладываются каждые 30 – 60 мин. Храните пластины при 25 ° C до достижения желаемого эмбрионов. Бластодермы стадии эмбрионов (ядерного цикла 14) Проинкубируйте примерно 2 ч. После 2 ч инкубации добавьте водопроводной воды от шприц бутылку к пластине коллекции так, что вся поверхность покрыта водой. Приостановить эмбрионов и дрожжей, мягкой щеткой. Наливайте ресуспензированы эмбрионы от коллекции пластины в корзину коллекции эмбриона (коммерческие ячейки сита с 100 мкм поры или домашнее корзины17 работают хорошо), добавив дополнительные водопроводную воду из шприц бутылку, при необходимости. На данном этапе объединить эмбрионов от всех плит, которые были собраны в параллельном режиме. Обобщённые образец представляет собой единый пакет. Вымойте эмбрионов хорошо промыв корзину с водопроводной водой из бутылки шприц для 30 s пока не смыл все остатки дрожжей. Dechorionate эмбрионы, помещая корзина коллекции в 2,5% раствор гипохлорита натрия в воде. Легкие агитации, закрученной облегчает удаление хориона. Продолжать до тех пор, пока эмбрионов достаточно гидрофобны, так что они плавают на поверхности раствора, когда корзина поднял и погруженной снова, который должен занять ~1.75–2 мин.Предупреждение: Гипохлорит натрия обладает коррозионными свойствами. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты. Растворы, содержащие < гипохлорита натрия 10% обычно может быть удален в раковину, не забудьте проверить правила принимающей института. Выньте корзину из раствора и промыть водопроводной воды от шприц бутылку до тех пор, пока запах отбеливателя больше не заметно. 2. эмбриона фиксации Примечание: Условия оптимальной фиксации, главным образом концентрации моющего средства, формальдегида и длительность фиксации, нужно быть эмпирически установлено подходят на стадии эмбриона. Для этапов вокруг-синцитиальный Бластодерма конечная концентрация 0,5% Тритон X-100 и 1,8% формальдегида в водной фазе работают хорошо. Для более поздних этапов стадию эмбриона 9 дальнейшая оптимизация этих параметров может быть необходимым. Все решения, используемые во время фиксации и сортировка должна содержать ингибиторов протеазы. Инвертировать корзина коллекции и поместите его над 15 мл конические центрифугирования. Флеш эмбрионов из корзины в трубку с помощью пипетки Пастера дозирования PBS-T (PBS, 0,5% X-100 Тритон). Пусть эмбрионов оседают на дне и отрегулировать общий объем по 2 мл с PBS-T. Добавьте 6 мл гептана и 100 мкл 37% формальдегида в воде.Предупреждение: Гептана и формальдегид токсичных при вдыхании или после кожи контакт. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты и работать в зонта. Отходы, содержащие Гептан или формальдегид должно утилизироваться отдельно согласно правилам принимающей Институт. После добавления формальдегида запустить таймер 15 мин и энергично встряхнуть трубу вверх и вниз за 1 мин вручную. Водные и органические фазы будет объединить формы шампунь как последовательности. Агитируйте на вращательное мешалке до 10 мин после нанесения формальдегида. Центрифуга на 500 x g 1 мин при комнатной температуре для сбора эмбрионов в нижней части трубки. Аспирационная весь шампунь как жидкости и отменить его, стараясь не аспирационная любой эмбрионов. Оставшиеся в небольших количествах супернатант шампунь как не вызывают проблем. 15 мин после нанесения формальдегида, Ресуспензируйте эмбрионы в 5 мл PBS-T с 125 мм глицин для утоления формальдегида. Смешайте энергично встряхивая вверх и вниз на 1 мин. Центрифуга на 500 x g при комнатной температуре в течение 1 мин и удалить супернатант. Вымойте эмбрионов, resuspending их в 5 мл ледяной PBS-t. Пусть эмбрионов поселиться и аспирата все супернатант. Повторите мыть в шаге 2.10 еще два раза. Держите эмбрионов на льду до сортировки. Обычно это хорошая идея, чтобы собирать 3 – 4 серий летать эмбрионов, прежде чем приступать к сортировке. Однако эмбрионы должны быть отсортированы в тот же день. Длительное хранение на льду или в холодильнике приводит к морфологии изменены эмбриона. 3. эмбриона сортировка Примечание: Сортировка может быть сделано на любой флуоресцентные стерео микроскоп с GFP фильтром при увеличении X 60 – 80. С помощью пипетки 1000 мкл, передать пакет примерно 100 эмбрионов подходит для сортировки, желательно темного цвета, небольшой стеклянный сосуд и поместите его на льду. Сортировка эмбрионов ядерной плотности и клеточный цикл статус (рис. 1), нажав желательно эмбрионов в отдельную кучу, используя кончик иглы или шприца. Удалите все эмбрионы с дисперсных, не обладающих ядерным распространением eGFP-PCNA (Рисунок 1E). Кроме того эмбрионов, которые частично Показать неядерных GFP сигнал должны быть удалены. Для оказания помощи в сортировке, соберите линейку ссылка эмбрионов в ядерного цикла 12, 13 и 14 в каждом пакете, используя в качестве руководства фотографии в Рисунок 1 . Используйте этот состав эмбрионов Неизвестный этап с одним из эмбрионов ссылку для того, чтобы определить их этапе. Чтобы проверить стадии развития эмбрионов ссылку, измерьте ядерная плотность изображений эмбриона и подсчета числа ядер на поверхности эмбриона в районе 2500 мкм2 с использованием изображений программное обеспечение, которое предоставляет сведения о расстоянии.Примечание: Ожидаемое количество ядер для площадью 2500 мкм2 — 12 до 16 ядер на ядерного цикла 12 и 20-30 ядер ядерного цикла 1313. После того, как все эмбрионы на соответствующем этапе разделены, принимать фотографии эмбрионов для документации и контроля качества. Если стерео Микроскоп само по себе не оснащен модулем камеры, могут использоваться любые эпифлуоресцентного микроскопа с GFP фильтры. Пипетка до желаемого эмбрионов, с помощью пипетки 1000 мкл, передача свежих пробки и место на льду. Продолжайте, пока достаточное количество эмбрионов сортируются для запланированного эксперимента. Для эмбрионов старше чем этап 9, как правило 20 эмбрионов достаточно для одного в situ эксперимент Привет-C. На ядерного цикла 12 80 эмбрионов являются хорошей отправной точкой. В ранее циклов необходимо приблизительно удвоить количество эмбрионов для каждого цикла. Бассейн и разделения эмбрионов в 1,5 мл пробирок таким образом, что одна трубка содержит достаточное количество эмбрионов для одного в situ Hi-C эксперимент. Рекомендуется использовать трубы с низкими характеристиками привязки ДНК, так как же трубка будет использоваться для всего протокола и адсорбции ДНК может привести к значительным потерям при низких концентрациях ДНК. Спин трубы кратко на 100 x g при комнатной температуре и удалить супернатант. Эмбрионы должны быть как сухой, как можно скорее для замораживания. Флэш замораживания эмбрионов, погрузив трубы в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C. 4. в Situ Привет C Лизис Место труб с замороженных эмбрионов на льду. Ресуспензируйте эмбрионов в 500 мкл буфера lysis ледяной (10 мм трис-Cl рН 8,0, 10 мм NaCl, 0,2% IGEPAL CA-630, Ингибиторы протеаз, растворенных в воде). Подождите 1 мин, чтобы позволить эмбрионов поселиться в нижней части трубки. Измельчить эмбрионов, с помощью металлических микро пестиком, предварительно охлажденный на льду, который предназначен для плотно пробки microcentrifuge 1,5 мл. Чтобы избежать агитацию эмбрионы, медленно вставьте пестиком, пока он не коснется нижней части трубки, сместите вниз и затем шлифуют, вращая пестик дважды в обоих направлениях. Очень слегка приподнимите пестиком, снова нажмите в нижней части трубки и повторять шлифования. 4.1.3.2 повторить 10 раз или до тех пор, пока эмбрионы полностью лизированы. Раствор должен быть однородным, и должна оставаться без остаточных большие куски эмбрионов. Инкубировать гомогенизированные подвеска на льду на 15 мин спина на 1000 x g, 4 ° C на 5 мин и удалить супернатант. Стирать Пелле resuspending 500 мкл ледяной литического буфера, закупорить вверх и вниз. Снова спина как 4.1.4 и удалить супернатант. Ресуспензируйте промывают Пелле в 100 мкл 0,5% лаурилсульфат натрия (SDS), закупорить вверх и вниз. Разрушения ядер по инкубации в течение 10 минут при температуре 65 ° C в блоке Отопление. Утолите SDS, добавляя 50 мкл 10% Тритон X-100 и 120 мкл воды. Смешать, стряхивая трубки. Инкубируйте при 37 ° C 15 мин в блоке тепла. Пищеварение энзима ограничения 25 мкл 10 x буфер энзима ограничения и 20 U 5 U/мкл Мбои. Смешать, стряхивая трубки. Дайджест ДНК путем инкубации в течение 90 минут при 37 ° C в блоке тепла под легким агитации (750 об/мин). Добавить еще 20 U Мбои и продолжать инкубации 90 мин. Тепло инактивирует Мбои по инкубации на 62 ° C в течение 20 мин. Свес заполнитьПримечание: Заполнение навеса с биотинилированным dATP позволяет выбор конкретных перевязаны фрагментов. Биотин dATP на лигирование узлов защищен от деятельность при exonuclease T4 ДНК-полимеразы (раздел 4.6), тогда как биотин dATP на unligated тупым концами эффективно удаляется. Пулдаун, используя стрептавидина покрытием бусины в разделе 4.7 поэтому специально обогащает перевязаны, химерных фрагментов ДНК. Добавьте 18 мкл 0,4 мм биотин-14-dATP, 2,25 мкл неизмененном дЦТФ/dGTP/dTTP смеси (по 3,3 мм) и 8 мкл 5 U/мкл ДНК-полимераза I фрагменты фрагмента. Смешать, стряхивая трубки и инкубировать при 37 ° C 90 мин в блоке тепла. Перевязка Добавить 657 мкл воды, 120 мкл 10 x T4 ДНК лигаза буфера, 100 мкл 10% Тритон X-100, 6 мкл 20 мг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА), и смесь, стряхивая трубки. Наконец добавьте 5 мкл 5 U/мкл T4 ДНК лигаза и микс, стряхивая трубки. Поворот трубы аккуратно (20 мин) при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавьте второй взнос 5 мкл 5 U/мкл T4 ДНК лигаза и продолжайте вращать для 2 более h. Спин вниз ядер на 2500 x g 5 минут и удалить супернатант. Экстракции ДНК Ресуспензируйте Пелле в 500 мкл буфера извлечения (50 мм трис-Cl рН 8,0, 50 мм NaCl, 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 1% SDS; растворенных в воде) и 20 мкл 20 мг/мл протеиназы K. Mix, стряхивая трубки. Дайджест белка с инкубации при температуре 55 ° C за 30 мин, тряски на 1000 об/мин. Де crosslink 130 мкл 5 М NaCl и Инкубируйте на ночь на 68 ° C, тряски на 1000 об/мин. Образец в пипетку в новом 2-мл пробирку, преимущественно с низкими характеристиками связывания ДНК. Добавьте 0,1 x томов (63 мкл) 3 M натрия ацетата рН 5.2 и 2 мкл 15 мг/мл GlycoBlue. Смешайте хорошо переворачивать. Добавьте 1.6 x томов (1008 мкл) чистого абсолютного этанола и микс, инвертирование. Инкубируйте на-80 ° C на 15 мин центрифуги на 20000 x g при 4 ° C для по крайней мере 30 минут. Пелле ДНК часто очень маленький, практически невидимый, а только может быть выставлен за синий цвет GlycoBlue. Удалите супернатант очень тщательно, перемещение наконечник пипетки в трубку вдоль противоположной стены от где находится Пелле ДНК. Маленькие капельки оставшиеся часто легко удаляются во время этот шаг и следующий моет, нажав их из трубы, используя кончик P10 вместо закупорить их. Вымойте Пелле, добавляя 800 мкл на 70% спирте. Смешать, инвертирование и центрифуги на 20000 x g при комнатной температуре на 5 мин повторить это мыть по крайней мере один раз. Удалите все следы этанола и оставить постоянный трубки с открытой крышкой для воздушно-сухой до 5 мин. После того, как остальные не жидкость, 50 мкл 10 мм трис-Cl рН 8.0. Неоднократно Пипетка решение над районом на стенке трубки расположение гранул чтобы солюбилизировать последнего ДНК. 1 мкл 20 мг/мл РНКазы A, смесь, стряхивая трубки и инкубировать при 37 ° C на 15 минут, чтобы дайджест РНК. Теперь образец можно хранить в холодильнике на ночь или замороженные при температуре-20 ° C на неопределенный срок. Проверка концентрации ДНК Люминесцентную краску на основе анализа согласно инструкциям производителя. Общее количество ДНК в образце должна быть по крайней мере 10 нг, в противном случае слишком мало материал доступен для амплификации и библиотека сложности, вероятно, будет низкой. Когда это произойдет, количество исходного материала, вероятно, не достаточно, или материал был потерян в пути, возможно во время лизис и осадков. Удаление биотина и ДНК стрижка Добавьте вместе 12 мкл 10 x буфер T4 ДНК-полимеразы, 3 мкл dATP 1 мм, 3 мкл dGTP 1 мм и 46 мкл воды. Смешать, стряхивая трубки. 5 мкл 3 ед/мл T4 ДНК-полимеразы, смешивать, стряхивая трубки и Инкубируйте на 20 ° C за 30 мин. 3 мкл ЭДТА 0,5 М для остановки реакции и использовать воду для принести объемом около 120 мкл пример. Сдвига ДНК до размера 200 – 400 bp с помощью sonication устройства в соответствии с инструкциями производителя. С помощью sonicator, упомянутых в Таблице материалов, следующая программа подходит: 2 циклов, каждый из 50 s, 10% пошлины, интенсивность 5, 200 циклов/взрыв. Биотин пулдаун Пипетка 30 мкл 10 мг/мл стрептавидина покрытием магнитные шарики в новой трубки, разделите их на магнитную подставку и удалить супернатант. Ресуспензируйте бусины в 1 x B & W буфера (5 мм трис-Cl рН 7,4, ЭДТА 0,5 мм, 1 M NaCl, растворенных в воде) + 0,1% тритон X-100 и микс на vortexing. Место труб на магнитную подставку и ждать 1 – 5 мин, до тех пор, пока бисер разделены, в зависимости от марки и модели. Аспирационная и удалить супернатант сдвинув наконечник пипетки вдоль стены напротив где расположены шарики. Ресуспензируйте бусины в 120 мкл 2 x B & W-буфера (10 мм трис-Cl рН 7,4, ЭДТА 1 мм и 2 М NaCl). Смешайте vortexing. Передача стриженый ДНК в новой низким трубки связывания ДНК и смешать с 120 мкл подвески из бисера в буфере 2 X B & W, vortexing. Вращайте бусины с образца ДНК в 20 об/мин, 15 мин. Отдельные шарики на магнитную подставку и удалить супернатант. Ресуспензируйте бисер в 600 мкл 1 x B & W + 0.1% тритон X-100 и Инкубируйте на 55 ° C за 2 мин, тряски на 1000 об/мин. После разделения, удалить супернатант. Повторите это мыть раз. Вымойте бусины с 600 мкл 10 мм трис-Cl рН 8.0 и отбросить надосадке после разделения. Ресуспензируйте бусины в 50 мкл 10 мм трис-Cl рН 8.0. 5. последовательности библиотеки подготовка Примечание: Все библиотеки шаги делаются с использованием компонентов от коммерческой подготовки библиотеки ДНК комплекта (см. Таблицу материалы). Однако может быть заменен альтернативные наборы или других реагентов. Осадков, как правило, форму в библиотеку подготовка агентов во время хранения морозильник. Поэтому важно, чтобы убедиться, что все осадков растворяется перед использованием реагентов. Конец ремонт Передача подвески из бисера в 50 мкл 10 мм трис-Cl рН 8,0 в новой ПЦР-пробирку. Добавьте 3 мкл конце приготовительный фермент смесь и 7 мкл буфера конце подготовительные реакции. Смешайте закупорить вверх и вниз. Передача труба тепловая велосипедист и запустите следующую программу: 20 ° C в течение 30 мин, 65 ° C для 30 минут и провести на 4 ° C. Перешнуровка адаптер 30 мкл лигирование Мастер микс, 2,5 мкл 1,5 мкм секвенирования адаптер (разбавляют до 1,5 мкм со склада) и 1 мкл лигирование Enhancer для подвески из бисера. Смешайте закупорить вверх и вниз. Инкубируйте на 20 ° C 15 мин в тепловая велосипедист. 3 мкл пользователя фермента. Смешайте закупорить вверх и вниз. Инкубируйте при 37 ° C 15 мин в тепловая велосипедист. Отдельные шарики на магнитную подставку и удалить супернатант. Мыть бусы, Ресуспензируйте бусины в 100 мкл 1 x B & W буфера + 0.1% тритон X-100. Смесь vortexing, и передача новых пробки microcentrifuge. Отдельные шарики на магнитную подставку и удалить супернатант. Повторите это мыть один раз, используя 600 мкл же буфера. Ресуспензируйте бусины в 600 мкл 10 мм трис-Cl рН 8,0, микс, vortexing и передача бусы на новой трубки. Отделить бусы на магнитную подставку, удалить супернатант и Ресуспензируйте бусины в 50 мкл 10 мм трис-Cl рН 8.0. Амплификации PCR Подготовить два ПЦР трубы и в каждом, смешать 25 мкл полимеразы Мастер микс, 1.5 мкл 10 мкм вперед (неиндексированные) PCR праймер и 1,5 мкл 10 мкм обратный (индексный) PCR праймер.Примечание: Вперед (неиндексированные) праймера PCR:5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T-3´.Реверс (индексный) праймера PCR:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T-3´. * Указывает фосфоротиоат облигаций и Ns в индексированные праймера PCR. В каждой тюбике мкл 22 подвески из бисера и микс, закупорить вверх и вниз. Запуск ПЦР, используя следующую программу: 98 ° С в течение 1 мин, (98 ° C 15 s, 65 ° C для 75 s, наращивает 1,5 ° C/s) повторил 9 – 12 раз, 65 ° C за 5 мин и провести на 4 ° C.Примечание: Количество усиления циклов должно быть установлено эмпирически. Однако мы обнаружили, что библиотеки, которые необходимы более чем 12 циклов в целом низкой сложности и не привели к высоким качеством, которую Hi-C карты. С другой стороны библиотек, которые требуют менее чем 12 циклов не были затронуты отрицательно усиления для полного 12 циклов. Таким образом это можно по умолчанию до 12 циклов амплификации. Объединить две реакции PCR в одном microcentrifuge трубки, отдельные шарики на магнитную подставку и передачи супернатанта, содержащий библиотеку новой трубки. Выбор размера Принесите Ampure XP бусины подвеска до комнатной температуры и перемешать хорошо встряхнув. Довести объем пула реакции PCR ровно 200 мкл с водой. Во время ПЦР и магнитной сепарации некоторые из первоначального объема обычно теряется. Проверьте объем, установив пипетки для 200 мкл и аспирационная весь объем реакции. Если атмосферный воздух, воды должна быть добавлена. Если объем превышает 200 мкл, отрегулируйте громкость бисер добавлены в шагах 5.4.3 и 5.4.6 пропорционально.Примечание: Объемы в скобках являются действительными, если общий объем пула реакций PCR ровно 200 мкл. Добавьте 0.55 x тома (110 мкл) подвески из бисера Ampure XP и смешивать, закупорить вверх и вниз по крайней мере 10 раз. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин, отдельными валиками на магнитные постоять 5 мин. Супернатант переход к новой пробке. Выбросите трубка, содержащая бисер. Бисер связали ДНК > 700 bp, который слишком велик для виртуализации. Супернатант, добавьте 0.2 x томов (40 мкл, что приводит к в общей сложности 0,75 x Ampure буфера в образце) подвески из бисера Ampure XP и микс от закупорить вверх и вниз по 10 раз. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин, отдельными валиками на магнитные постоять 5 мин. Отменить супернатанта, которая содержит ДНК < 200 bp, которая включает в себя бесплатный грунтовки, Димеры праймера и фрагменты слишком мал для виртуализации. Оставьте трубки на магнитную подставку. Мыть бусы, 700 мкл 80% этанола, заботясь не беспокоить шарик Пелле и Инкубируйте 30 s. Отменить супернатанта, затем взять трубку от магнитного стенд и Ресуспензируйте бусины в 100 мкл 10 мм трис-Cl рН 8.0. Смешать, закупорить вверх и вниз в 10 раз и инкубации при комнатной температуре в течение 1 мин. Добавьте 0.8 x тома (80 мкл) подвески из бисера Ampure XP. Смешать, закупорить вверх и вниз в 10 раз и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин. Этот второй раунд выбор размера нижней границы гарантирует, что окончательный библиотека является полностью бесплатным, грунтовки и Димеры праймера. Отдельные бусы на магнитные постоять 5 мин и удалить супернатант. Помыть лепешка из бисера дважды с 700 мкл 80% этанола для 30 s каждая, при этом оставляя трубки магнитного стенд, как указано выше. С трубки еще на магнитного стенд удалите все следы этанола. Это помогает подтолкнуть капли этанола из трубки с помощью пипетки P10. Пусть остаточного этанола испаряются максимум 5 мин. Возьмите трубку от магнитного стенд и Ресуспензируйте бусины в 50 мкл 10 мм трис-Cl рН 8,0. Смешайте закупорить вверх и вниз по 10 раз. Инкубации при комнатной температуре за 5 мин, затем отдельными валиками на магнитную подставку. Супернатант передать свежие трубки. Это окончательный Привет-C библиотека, готовы быть количественно и виртуализации на следующее поколение виртуализации машин, согласно инструкциям производителя.