しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

1ショウジョウバエ胚のコレクション。 注: 以前文書15に示すように、同等の採卵を実行できます。 若い eGFP PCNA ハエを転送 (< 1 週齢) 卵コレクション ケージ yeasted コレクションにプレート16 (1% エタノール, 1% 酢酸そして 4% 寒天培地)。 25 ° C で培養するコレクションのケージを移動します。採卵の前に 1-2 日間の培養卵収量が大幅に向上します。コレクション板に 1 日 2 回を変更します。 30-60 分間隔でコレクション室から胚を含むプレートを取り外します。短い間隔より少ない胚発達段階の緊密な分布があります。収集並列で複数のケージからだから、理想的に > 200 の卵が 30-60 分毎に配置されます。 胚が必要な年齢に達するまでは、25 ° C でプレートを格納します。胚期の胚 (核燃料サイクル 14)、約 2 時間孵化させなさい。 孵化の 2 h 後水道水ホヤの瓶からに追加コレクション プレート表面全体が水で覆われているので。胚を中断し、酵母の柔らかいブラシを使用します。 注ぎコレクション プレートからの再懸濁の胚胚コレクション バスケット (100 μ m の細孔径や自家製バスケット17仕事よく商業細胞ストレーナー)、ホヤの瓶から付加的な水道水の追加に応じて。この段階で並列で収集されたすべての板から胚を兼ね備えてください。プールされたサンプルは、1 つのバッチを表します。 30 用ホヤの瓶から水道水が付いているバスケットを洗浄によっても胚を洗う s まですべての酵母の残留で流されています。 Dechorionate 胚 2.5% ナトリウム次亜塩素酸水溶液の水コレクション バスケットに置くことによって。渦巻く光撹拌絨毛膜の除去が容易になります。胚は、バスケットが取り外されたと再び、水没、彼らはソリューションの表面に浮くので、十分に疎水性まで続行する ~1.75–2 分を取る必要があります。注意: 次亜塩素酸ナトリウムは腐食性です。適切な保護具を着用します。ソリューションを含む < 10% ナトリウム次亜塩素酸は通常流しに破棄できます、ホスト機関の規制をご確認ください。 バスケットをソリューションから削除し、漂白剤の臭いが顕著なされなくなるまでホヤの瓶から水道水で完全にすすぎます。 2. 胚の固定 注: 最適な固定条件、洗剤、ホルムアルデヒドおよび固定期間の濃度では主に経験的に決定される胚の段階に合わせてする必要があります。胞胚の周りにステージ、水相中に 0.5% トリトン X-100 と 1.8% ホルムアルデヒドの最終濃度が適しています。胚の段階 9 を超えて後の段階、さらにこれらのパラメーターの最適化が必要なあります。固定および並べ替え中に使用されるすべてのソリューションは、プロテアーゼ阻害剤を含める必要があります。 コレクション バスケットを反転し、15 mL の円錐形遠心分離管の上に置きます。PBS-T を調剤パスツール ピペットを使用してチューブにバスケットから胚をフラッシュ (PBS、0.5% トリトン X-100)。 胚下部に解決し、PBS T で 2 mL に容量の調整をしましょう 水 6 mL ヘプタンのと 37% ホルムアルデヒド 100 μ L を追加します。注意: ヘプタンおよびホルムアルデヒド吸入すると有毒であるまたは皮膚の後にお問い合わせください。適切な個人用保護具を着用し、ヒューム フードで働きます。ヘプタンまたはホルムアルデヒドを含む廃棄物がホスト機関の規則に従って個別に処分します。 ホルムアルデヒド添加後 15 分タイマーを開始、積極的に振るチューブ上下に 1 分の手で。水溶液と有機相をフォーム シャンプーのような一貫性に結合します。 ホルムアルデヒド添加後 10 分まで、回転ミキサーで攪拌します。 チューブの下部に胚を収集するために部屋の温度で 1 分の 500 × gで遠心分離機します。 全体のシャンプーのような液体を吸引になり、胚を吸引しないように世話を破棄します。シャンプーのような上澄みの残り少量では、問題は発生しません。 ホルムアルデヒド、添加後の 15 分は、ホルムアルデヒドをクエンチする 125 mM グリシンと PBS T の 5 mL の胚を再懸濁します。1 分の上下に揺することによって積極的にミックスします。 1 分間室温で 500 × gで遠心し、上清を吸引します。 5 mL の氷冷 PBS T にそれらを再で胚を洗う胚セトルとすべて清吸引をしましょう。 2.10 の手順で洗浄を 2 回繰り返します。 並べ替えまで氷の上の胚を保ちます。通常、並べ替えに進む前にハエの胚の 3-4 バッチを収集することをお勧めします。ただし、同じ日に胚を並べ替え 必要があります。拡張ストレージ氷や冷蔵庫の中には、変更された胚形態に します。 3. 胚の選別 注: 並べ替えは、60-80 倍の倍率で GFP フィルター搭載蛍光ステレオ顕微鏡を実行できます。 1,000 μ L ピペットを使用して、好ましくは暗い色の並べ替えに適して小さなガラス容器に約 100 の胚のバッチを転送、氷の上に置きます。 並べ替え胚核密度と細胞周期の状態 (図 1) 針や注射器の先端を使用して別の杭に望ましい胚を押すことによって。 EGFP PCNA (図 1E) の分散、非原子力分布とすべての胚を削除します。また、部分的に非核 GFP シグナルを示す胚を削除必要があります。 分類の助けガイドとして図 1の画像を使用して各バッチで核燃料サイクル 12、13、および 14 を参照胚のラインアップをアセンブルしてください。彼らのステージを決定するために参照の胚のいずれかで不明な段階の胚を一致するように、このラインアップを使用します。 参照胚の発達段階を確認するには、胚をイメージングと距離情報を提供するイメージング ソフトウェアを使用して、2,500 μ m2の面積で胚の表面で核の数を数えることによって核密度を測定します。注: 2,500 μ m2の領域の核数の期待値は核燃料サイクル 12、16、12 核と核燃料サイクル 131320 に 30 核。 適切な段階ですべての胚を分割すると、ドキュメントおよび品質管理のための胚の写真を撮る。ステレオの顕微鏡は、カメラ モジュールを装備自体ではない、GFP フィルターと落射蛍光顕微鏡が使用可能性があります。 氷の上の 1,000 μ L ピペット、新鮮なチューブと場所への転送を使用して目的の胚をピペットします。 計画された実験のため十分な胚を並べまで続行します。古い胚の第 9、ステージよりも一般的に 20 胚で十分やあ-C 実験場1 つです。核燃料サイクル 12、80 の胚は良い出発点です。以前のサイクルで胚の数はサイクル毎に約倍増する必要があります。 1 つの管に十分な胚 1 つ場でハイ C が含まれていることそのような方法で 1.5 mL チューブにプール、分割胚の実験します。全体のプロトコルの同じ管が使用され、DNA の吸着が低 DNA 濃度に重大な損失につながることができますので低 DNA 結合特性でチューブを使用することをお勧めします。 室温で 100 x gで簡単にチューブをスピンして、上清を除去します。胚を乾燥する必要があります可能な限り凍結の。 フラッシュは、液体窒素、-80 ° C の店でチューブを水没によって胚を凍結します。 4.その場でハイ-C の 換散 凍結胚とチューブを氷を場所します。 冷たい換散バッファー (10 mM Tris Cl pH 8.0、10 mM の NaCl、0.2% IGEPAL CA 630、プロテアーゼ阻害剤; 水に溶解) を 500 μ l 添加の胚を再懸濁します。胚管の底で解決させる 1 分待ちます。 1.5 mL 遠心チューブが収まるように設計されている氷の上事前冷却金属マイクロ乳棒を用いた胚を挽きます。 避けるために胚を攪拌をそれが管の底に触れるまでゆっくりと、杵を挿入、プッシュ ダウン、および両方の方向で 2 回杵を回転させて挽きます。 非常にわずかに杵を持ち上げる、管の底に push 研削を繰り返します。 4.1.3.2 を繰り返して 10 回、または胚は完全に分離するまで。胚の残りの大きな部分が残っていないする必要があります、ソリューションは、均質なはずです。 1,000 × g、5 min のための 4 ° C で 15 分スピン氷上均質懸濁液をインキュベートし、上澄みを廃棄します。 ペレットをピペッティング上下 500 μ L 冷たい換散バッファーに再洗い。 4.1.4 のように再び回転し、上澄みを廃棄します。 ピペッティング上下 0.5% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 100 μ L で洗浄のペレットを再懸濁します。暖房のブロックの 65 ° C で 10 分間インキュベートして核を permeabilize します。10% トリトン X-100 と 120 μ L 水の 50 μ L を追加することにより SDS を癒します。チューブをフリックでミックスします。 熱ブロックで 15 分間 37 ° C で孵化させなさい。 制限の酵素の消化力 制限酵素バッファー x 10 の 5 U/μ L mboi を検索の 20 U 25 μ L を追加します。チューブをフリックでミックスします。 37 ° c (750 rpm) 若干の動揺の下で熱ブロックで 90 分間インキュベートし、DNA を消化します。 別 20 U mboi を検索を追加し、90 分の潜伏を続けます。 熱-62 ° C、20 分のインキュベーションでの不活性 mboi を検索します。 オーバー ハングのフィルイン注: は、特定のフラグメントを結紮の選択をできます dATP をビオチン化とオーバー ハングで充填します。Unligated 鈍端にビオチン dATP を効率的に除去する一方、ビオチン-dATP を結紮交差点は exonuclease の作業の T4 DNA ポリメラーゼ (セクション 4.6) から保護されます。4.7 節したがって具体的ストレプトアビジン コーティング ビーズを用いたプルダウンを結紮、キメラの DNA 断片を富ませます。 0.4 mM ビオチン-14-dATP の 18 μ L、未変更の dCTP/dGTP/dTTP のミックス (3.3 mM)、2.25 μ L、5 U/μ L DNA ポリメラーゼ I Klenow のフラグメントの 8 μ L を追加します。 チューブをフリックでミックスし、熱ブロックの 90 分の 37 ° C で孵化させなさい。 結紮 水の 657 μ L、100 μ L の 10% の 10 x T4 DNA リガーゼ バッファーの 120 μ L を追加トリトン X-100、20 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) のチューブをフリックでミックス 6 μ L。最後にチューブをフリックで 5 U/μ L T4 DNA リガーゼとミックスの 5 μ L を追加します。 回転管優しく (20 rpm) 2 時間室温で。 5 U/μ L T4 DNA リガーゼの 5 μ L の 2 番目の割賦を追加し、多くの h を 2 回転を続けます。 2,500 x gで 5 分で核を回転し、上澄みを廃棄します。 DNA の抽出 抽出バッファー (50 mM Tris Cl pH 8.0、50 mM NaCl、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、1 %sds; 水に溶解) を 500 μ l 添加でペレットを再懸濁します、チューブをフリックで 20 mg/mL プロティナーゼ k. ミックスの 20 μ L を追加します。 1,000 rpm で揺れ、30 分間 55 ° c の孵化によってタンパク質を消化します。 デ-架橋に 5 M の NaCl の 130 μ l 添加し, 一晩 1,000 rpm で揺れ、68 の ° C で。 低 DNA 結合特性と優先的に、新しい 2 mL チューブにピペットのサンプルです。 3 M ナトリウム酢酸 pH 5.2 と 2 μ GlycoBlue 15 mg/mL の 0.1 x ボリューム (63 μ L) を追加します。反転でよく混ぜます。1.6 x 大量 (1,008 μ L) の純粋なエタノールとミックスを追加するには、反転します。 少なくとも 30 分のための 4 ° C で 20,000 × gで 15 分遠心分離機-80 ° C で孵化させなさい。DNA の餌は、しばしば非常に小さい、ほとんど目に見えないとだけ GlycoBlue の青い色のため発見することができます。 DNA の餌がある場所から反対側の壁に沿って管にピペット チップを移動、非常に慎重に上清を除去します。小さい残りの水滴が P10 の先端を使用してチューブからそれらを押すことで削除この手順と次の洗浄時に頻繁に容易にそれらをピペットではなく。 70% のエタノールの 800 μ L を追加することでペレットを洗浄します。反転でミックスし、遠心分離機で 20,000 × gで 5 分間室温で少なくとも一度この洗浄を繰り返します。 エタノールのすべてのトレースを削除し、空気乾燥するまで 5 分間蓋を開けてチューブ立ってを残します。液体がなくなり 10 mM Tris Cl pH 8.0 の 50 μ L を追加します。ペレットが DNA の可溶化位置していた管の壁の領域にピペット ソリューションの繰り返し。 20 mg/mL RNase A、チューブをフリックでミックスの 1 μ L を追加し、ダイジェスト RNA に 15 分間、37 ° C で孵化させなさい。サンプルを一晩冷蔵庫の中に格納されているまたは無期限に-20 ° C で凍って今できます。 製造元の指示に従って蛍光染料ベースの試金を使用して DNA の濃度を確認してください。サンプルの DNA 量必要があります少なくとも 10 ng、それ以外あまり素材は増幅とライブラリの複雑性は低いでしょう。この場合、出発材料の量は不十分だったおそらくまたは材料は溶解と沈殿物の中に途中で、おそらく失われました。 ビオチン除去と DNA のせん断 一緒に 10 x T4 DNA ポリメラーゼ バッファーの 12 μ L、dATP を 1 mM の 3 μ L、1 mM dGTP の 3 μ L と 46 μ L の水を追加します。チューブをフリックでミックスします。3 U/mL T4 DNA ポリメラーゼの 5 μ L を加えてチューブをフリックでミックス 20 の ° C で 30 分間インキュベートします。 反応を停止する 0.5 M の EDTA の 3 μ L を追加し、約 120 μ L のボリュームに、サンプルを持参して水を使用します。 製造元の指示に従って超音波デバイスを使用して 200-400 bp のサイズに DNA をせん断します。材料の表に記載されている超音波発生装置を使用すると、次のプログラムは適切な: 2 サイクル 50 s、デューティ 10%、震度 5、200 サイクル/バースト。 ビオチン プルダウン 新しい管に 10 mg/mL ストレプトアビジン コーティング磁気ビーズの 30 μ L をピペット、マグネット スタンドに区切って、上澄みを廃棄します。 ボルテックスでは、B & W のバッファー (5 mM Tris Cl pH 7.4 0.5 ミリメートルの EDTA、1 M 塩化ナトリウム; 水に溶解) + 0.1% トリトン X-100 とミックス × 1 でビーズを再懸濁します。マグネット スタンドにチューブを置き、ビーズは、製造元やモデルによって区切られている 1-5 分間待ちます。 吸引し、ビーズがある場所の反対側の壁に沿ってピペット チップをスライドさせながら上澄みを廃棄します。B & W のバッファー (10 mM Tris Cl pH 7.4 では、1 mM EDTA と 2 M 塩化ナトリウム) x 2 の 120 μ L でビーズを再懸濁します。ボルテックスでミックスします。 新しい低 DNA 結合の管、傾斜された DNA を転送し、ボルテックスで 120 μ L 2 X B & W バッファー ビーズ懸濁液のミックスします。15 分 20 の rpm で DNA サンプルとビーズを回転させます。 マグネット スタンドにビーズを分離し、上清を捨てます。 再懸濁しますビーズ x B & W + 0.1 %1 600 μ L でトリトン X-100 と 55 ° C の 1,000 rpm で揺れ、2 分間インキュベートします。分離後、上清を捨てます。この洗浄をもう一度繰り返します。 10 mM Tris Cl pH 8.0 の 600 μ L で一度ビーズを洗浄し、分離した後の上澄みを廃棄します。 10 mM Tris Cl pH 8.0 の 50 μ L でビーズを再懸濁します。 5. 配列ライブラリの準備 注: ライブラリのすべての手順が行われます商業 DNA ライブラリの準備からコンポーネントを使用してキット (材料の表を参照してください)。ただし、代替キットまたはその他の試薬を代えることが。沈殿物はフォーム ライブラリの準備エージェントの冷凍貯蔵中に傾向があります。したがって、試薬を使用する前にすべての沈殿物を溶解するかどうかを確認することが重要です。 最後の修理 新しい PCR チューブに 10 mM Tris Cl pH 8.0 の 50 μ L ビーズ懸濁液を転送します。 終了準備酵素ミックスの 3 μ L と終わり準備反応バッファーの 7 μ L を追加します。上下にピペッティングで混ぜます。 チューブをサーマルサイクラーに転送し、次のプログラムを実行: 20 ° C、30 分、4 ° C で 30 分押しの 65 ° C アダプター結紮 結紮マスター ミックス、1.5 μ M の 2.5 μ L の 30 μ L を追加シーケンス アダプター (ストックから 1.5 μ M に希釈) と結紮エンハンサーのビーズ懸濁液に 1 μ L。上下にピペッティングで混ぜます。 サーマルサイクラーに 15 分 20 ° C で孵化させなさい。 ユーザー酵素の 3 μ L を追加します。上下にピペッティングで混ぜます。 熱 cycler で 15 分間 37 ° C で孵化させなさい。 マグネット スタンドにビーズを分離し、上清を除去します。 ビーズを洗浄、再懸濁しますトリトン X-100 の x B & W バッファー + 0.1 %1 100 μ L のビーズします。ボルテックスと新しい微量遠心チューブへの転送でミックス。マグネット スタンドにビーズを分離し、上清を除去します。 一度同じバッファーの 600 μ L を使用してこの洗浄を繰り返します。 10 mM Tris Cl pH 8.0、ボルテックス、ミックスの 600 μ L でビーズを再懸濁し、ビーズを新しいチューブに転送します。 マグネット スタンドにビーズを分離、培養上清を破棄し、10 mM Tris Cl pH 8.0 の 50 μ L でビーズを再懸濁します。 PCR の拡大 2 つの PCR チューブを準備し、各ミックス ポリメラーゼ マスター ミックスの 25 μ L、10 μ M 前方 (インデックス) PCR プライマー、1.5 μ、10 μ M の逆 (インデックス) PCR プライマー 1.5 μ。注: 転送 (インデックス) の PCR のプライマー:5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T 3´。(インデックス) PCR プライマーを逆します。5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T 3´。* インデックス付きの PCR プライマーのホスホロチオエート結合と Ns を示します。 各チューブの上下にピペッティングによるビーズ懸濁液とのミックスの 22 μ L を追加します。 次のプログラムを使用して PCR を実行: 98 ° C 1 分 (98 ° C、15 s、75 65 ° C ランプ 1.5 の ° C/s) 繰り返される 9-12 回、4 ° C で 5 分押しの 65 ° C注: 増幅サイクル数は、経験的に定められます。しかし、我々 は発見と低演算量の概ね以上 12 サイクルに必要なライブラリですが、高品質のやあ-C にマップされませんでした。その一方で、未満 12 サイクルに必要なライブラリでは、完全の 12 のサイクルを増幅して否定的影響されなかった。したがって、増幅の 12 サイクルに既定することが可能です。 プールの単一微量遠心チューブに 2 つの PCR の反作用、マグネット スタンドにビーズを分離し、上清を新しいチューブにライブラリを含むを転送します。 サイズの選択 Ampure XP ビーズ懸濁液にもたらす室温とミックスを揺することによっても。 水で丁度 200 μ L にプールされた PCR の反作用のボリュームをもたらします。PCR と磁気分離の間に、元のボリュームのいくつかは通常失われます。ピペットを 200 μ L に設定すると、ボリュームを確認し、全体の反応量を吸引します。場合は空気を吸引するより多くの水を追加する必要があります。量は、200 μ L を超えた場合、比例して 5.4.3 と 5.4.6 の手順で追加ビーズのボリュームを調整します。注: かっこ内のボリュームは、プールされた PCR の反作用の合計量が丁度 200 μ l 添加の場合有効です。 Ampure XP ビーズ懸濁液の 0.55 倍ボリューム (110 μ L) を加え、ピペッティングを上下 10 回以上で混ぜます。 5 分、5 分、マグネット スタンドに別のビーズの室温で孵化させなさい。 上清を新しいチューブに移動します。ビーズを含むチューブを破棄します。ビーズは、DNA をバインドされている > 700 bp は、シーケンス処理するのには大きすぎます。 、上清に 0.2 x ボリューム (40 μ L、サンプルで 0.75 x Ampure バッファーの合計で) を追加 Ampure XP ビーズ懸濁液の上下に 10 回ピペッティングでミックス。 5 分、5 分、マグネット スタンドに別のビーズの室温で孵化させなさい。 DNA を含んだ上澄みを廃棄 < 200 bp、無料プライマー、プライマー二量体小さすぎる断片を含むシーケンスします。 マグネット スタンドにチューブを残します。ビーズを洗浄、80% エタノールの 700 μ L を追加、ビーズ ペレットを邪魔しないように世話をしインキュベートする 30 秒。 上澄みを廃棄、マグネット スタンドをチューブに乗りし、100 μ L の 10 mM Tris Cl pH 8.0 でビーズを再懸濁します。上下に 10 回ピペッティングで混ぜるし、1 分間室温でインキュベートします。 Ampure XP ビーズ懸濁液の 0.8 x ボリューム (80 μ L) を追加します。上下に 10 回ピペッティングで混ぜるし、5 分間室温でインキュベートします。下限サイズ選択のこの第二ラウンドは、最後のライブラリはプライマーおよびプライマー二量体の完全に自由を保証します。 5 分、マグネット スタンドにビーズを分離し、上清を捨てます。 30 80% エタノールの 700 μ L で 2 回ビーズ ペレットを洗う s マグネット スタンド、上記のようにチューブを残しながら、それぞれ。 マグネット スタンドにまだチューブ、エタノールのすべてのトレースを削除します。P10 のピペットを使用してチューブからのエタノール液滴をプッシュするのに役立ちます。最大 5 分の蒸発残留エタノールができます。 マグネット スタンドをチューブに乗り、10 mM Tris Cl pH 8.0 の 50 μ L でビーズを再懸濁します。上下に 10 回ピペッティングで混ぜます。 5 分後マグネット スタンドに別のビーズの室温で孵化させなさい。 新鮮なチューブに上清を転送します。これは、定量化し、製造元の指示に従って次世代シーケンス コンピューターでシーケンス処理する準備ができて最終的なやあ-C ライブラリです。